PLoS ONE: Målrettet Angivelse af Suicide Gene ved vævsspecifik promotor og MicroRNA forordning for Cancer Gene Therapy

Abstrakt

For at realisere det fulde potentiale af kræft selvmord genterapi, der tillader den præcise udtryk for selvmord gen i kræftceller, vi brugte en vævsspecifik Epithelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) promotor (EGP- 2), der dirigerer transgen Herpes simplex virus-thymidinkinase (HSV-TK) -ekspression fortrinsvis i EpCAM overudtrykker cancerceller. EpCAM niveauer er væsentligt højere i retinoblastoma (RB), en barndom øje kræft med begrænset udtryk i normale celler. Anvendelse af miRNA regulering, der støder op til anvendelsen af ​​den vævsspecifikke promotor, ville tilvejebringe det andet lag af kontrollen til transgenekspression kun tumorcellerne samtidig skåne de normale celler. For at teste denne hypotese vi klonede lad-7b miRNA mål i 3’UTR-regionen af ​​HSV-TK selvmord gen drevet af EpCAM promotor, fordi lad-7 familie miRNA, herunder lad-7b, viste sig at være nedreguleret i RB tumorer og cellelinier. Vi brugte EpCAM løbet udtrykke og lad-7 ned reguleret RB cellelinjer Y79, Weri-RB1 (EpCAM

+ ve /lad-7b

nedreguleret), EpCAM nedreguleres, lad-7 over at udtrykke normal retinal Müller glial cellelinie MIO-M1 (EpCAM

-ve /lad-7b

opreguleres), og EpCAM opreguleret, lad-7b opreguleret normal thyroid cellelinie N-Thy-Ori-3.1 (EpCAM

+ ve /lad-7b

opreguleret) i undersøgelsen. Celleproliferationen blev målt ved MTT-assay, apoptose blev målt ved at probe spaltet Caspase3 blev EpCAM og TK-ekspression kvantificeres ved Western blot. Vores resultater viste, at EGP2-promotor HSV-TK (EGP2-TK) konstruere med 2 eller 4 kopier af lad-7b miRNA mål udtrykte TK-genet kun Y79, Weri-Rb-1, mens TK genet ikke udtrykte i MIO -M1. Sammenfattende har vi udviklet en vævsspecifik, miRNA-reguleret dobbelt kontrol vektor, som selektivt udtrykker selvmord genet i EpCAM løbet udtrykke celler

Henvisning:. Danda R, Krishnan G, Ganapathy K, Krishnan UM, Vikas K, Elchuri S, et al. (2013) Målrettet Angivelse af Suicide Gene ved vævsspecifik promotor og MicroRNA forordning for Cancer Gene Therapy. PLoS ONE 8 (12): e83398. doi: 10,1371 /journal.pone.0083398

Redaktør: Rajiv R. Mohan, University of Missouri-Columbia, USA

Modtaget: 27. juni, 2013; Accepteret: 5. november 2013; Udgivet: December 31, 2013

Copyright: © 2013 Danda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af det indiske råd for medicinsk forskning, Grant ingen 35/6 /2010 /-BMS Nano til at udføre kloning, transfektion, og funktionel analyse. I del dette arbejde blev støttet af Institut for Bioteknologi, Indiens regering, Grant ingen BT /01 /CE1B /11 /V /16 til at udføre Lad-7miRNA familie profil. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Konventionelle behandlinger som kemoterapi, radio terapi og kirurgi er det mest effektive middel til at behandle kræftpatienter [1]. Baseret på de sygdomsstadier, nuværende behandlingsmetoder til retinoblastoma (RB) den hyppigste neoplasme af øjet i barndommen, omfatter intensiv kemoterapi, stråling, konsolidering med autolog hæmatopoietisk stamcelle redning og kirurgisk resektion. Men patienter med glasagtige frø, sub retinale frø, og bilaterale avancerede multifokale sygdomme er en stor udfordring med de nuværende behandlingsmuligheder, [2], [3]. Nylige opdagelse af cancer stamceller, en undergruppe af cancerceller med stamcellelignende egenskaber, som er delvis ansvarlige for tumorvækst med forskellige egenskaber sammenlignet med differentierede tumorceller stiger kompleksiteten i kræftbehandling [1]. Derfor er der behov for nye behandlingsmetoder til at bekæmpe kræft. Blandt de forskellige tilgange, kunne selvmord genterapi være et lovende alternativ strategi, eftersom selvmord genekspression kan reguleres til et bestemt væv [4], [5]. Selvmord genterapi involverer intracellulær afgivelse af et gen kodende for et enzym, som omdanner et prodrug til et cytotoksisk produkt [6], [7]. Den mest almindeligt anvendte selvmordsgen er herpes simplex virus type I-thymidinkinase (HSV-TK). Forskellige undersøgelser havde brugt HSV-TK selvmordsgen terapi til behandling af RB og andre kræftformer [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Ikke specifikt udtryk for selvmord genet i normale celler er en alvorlig begrænsning i de eksisterende selvmord gen strategier for kræftbehandling.

For effektivt at styre transgen ekspression kun i målceller, har forskellige undersøgelser anvendt forskellige væv promotorer [15], [16], [17], [18], [19], [20]. En sådan promotor er epitel glycoprotein-2 /EpCAM /17-1A (EGP2) promotor, som selektivt dræber EpCAM overudtrykker celler i mange cancere ved begrænset ekspression af TK (thymidin kinase) efterfulgt af Ganciclovir (GCV) behandling [21], [ ,,,0],22]. EpCAM /CD326 er et type I trans membran glycoprotein, som udtrykkes i apikale membran af cancerceller og viser baso-lateral ekspression i normale epitelceller. Det er blevet rapporteret at være specifikt udtrykkes i epitelvæv, og overudtrykt i størstedelen af ​​humane epiteliale carcinomer, herunder colorectal, bryst, prostata, hoved- og halscancer, hepatiske carcinomer og retinoblastom [23], [24]. Kontrolleret genekspression i de målrettede væv er afgørende for genterapi især i forbindelse med cancer selvmord genterapi. Selvom vævsspecifik promotor drevne selvmord genterapi viste lovende resultater, utætte ekspression af vævsspecifikke promotorer i ikke målrettede celler er blevet rapporteret [21]. Derfor alternative strategier er afgørende foruden den vævsspecifikke promotor regulering af selvmord genterapi Salg

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små, ikke-kodende RNA’er. ( 1000 i pattedyrceller), der regulerer forskellige cellulære funktioner lige fra celledeling, signaltransduktion og metabolisme. Den posttranskriptionel regulering af genekspression via miRNA-medieret RNA-interferens (RNAi) er velkendt [25]. miRNA er kendt for at blokere mRNA translation eller reducere mRNA stabilitet efter perfekt binding af guide streng til elementer de miRNA-anerkendelse (MRes) inden for 3

luntranslated region (UTR) af målgener [26], [27], [28], [29]. Lad-7 er en klasse af miRNA, der er involveret i celle regulering og tumor suppression. Tidligere undersøgelser af prostata-, lunge- og brystkræft, viste nedregulering af Lad-7 familie miRNA [30], [31]. For nylig, gliafibrillært surt protein (GFAP) promotor- drevet væv specifikt gen ekspressionsvektorer sammen med målsekvenserne til dereguleret miRNA (mir122a, mir31, mir127, mir143) blev indført i 3’UTR region i transgenet [32], [ ,,,0],33], [34], [35], [36]. Denne fremgangsmåde havde tilladt transgenekspression kun i målrettede glioblastoma cancerceller uden nogen ekspression i normale astrocytter celler af samme afstamning [34].

I denne undersøgelse konstruerede vi en pattedyrcelle-ekspressionsvektor, der huser EpCAM promotor (EGP2) drevet selvmordsgen HSV-TK reguleret af ekspression af de deregulerede miRNA niveauer. Målet er at udtrykke selvmordsgen kun i EpCAM

+ ve celler med meget minimal eller ingen ekspression i normale celler af samme linje. Den lad-7b miRNA er under udtrykt i Y79, Weri-Rb-1 cancer cellelinjer. Vi gjorde EGP2-TK konstruktion med 2 og 4 kopier af lad-7b miRNA målsekvenser. Ekspressionen af ​​TK-genet er begrænset til cancercellelinjer, såsom Y79, Weri-Rb-1, MDA-MB-453, og MCF-7 henviser TK-genekspression er minimal i MIO-M1 cellelinie. Vi viste for første gang anvendelsen af ​​EpCAM-promotor drevne miRNA reguleret TK selvmordsgen i EpCAM positive og lad-7 ned regulerede celler. Denne strategi giver en tvedelt niveau kontrol over transgen, som kan føre til en selektiv transgen ekspression i kræftceller uden ethvert udtryk i de normale celler.

Materialer og metoder

Etik redegørelse

retinoblastoma tumorer prøver blev indsamlet fra tømte øje bolde som en del af behandlingen og anvendes til forskning formål blev en skriftlig generel tilladelse fra de forældre /værger patientens gennemgår enucleation. Undersøgelsen blev gennemført efter godkendelse fra den etiske underudvalg (Institutional Review Board) af Sankara Nethralaya eye hospital [Etisk clearance nr: 147 (A) -2009-P].

Tumor prøver og patologiske detaljer

for denne undersøgelse 10 friske retinoblastom tumorer blev anvendt, blev der Clinocopathological oplysninger om tumorer baseret på international retinoblastoma iscenesættelse arbejdsgruppe (IRSWG) [37], [38] og blev givet i tabel S1. Pooled voksen nethinden 50-55 (n = 3) år blev brugt som kontrol og blev opnået fra kadaver øjne doneret til CU Shah Eye Bank, Sankara Nethralaya.

Cell kultur

retinoblastoma cellelinje Y79, Weri-RB1, og Brystkræft cellelinjer MDA-MB-453, MCF-7 blev opnået fra Riken Bio Resource Centre (Japan). Human Retinal Müller glial cellelinie MIO-M1 afledt fra den neurale nethinde var begavet fra G.A. Limb, UCL Institute of Ophthalmology, London, England [39]. Menneskelig thyroid follikulær epitelial cellelinje Nthy-ori 3-1 blev begavet fra Dr.Omer Ugur, Hacettepe Institut for Onkologi [40], [41]. MIO-M1, MDA-MB-453, MCF-7 blev dyrket i Dulbeccos modifikation af Eagles medium (DMEM) indeholdende glutamin, suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (100 IU /ml). Nthy-ori 3-1 og Y79, Weri-RB1 blev dyrket i RPMI1640 tilsat 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 4,5% dextrose og dyrket i suspension ved 37 ° C i en CO 5%

2-fugtig inkubator.

In vitro

transgen ekspression analyse

(EGP2-TK) blev venligst stillet til rådighed af Dr. MG Rots, Institut for Therapeutic Gene Modulation, Universitetscenter for Farmaci, universitetet i Groningen, Holland. Den pUT649 ekspressionsvektor indeholdende en Zeocin-resistent gen og bærer HSV-TK-genet under kontrol af human cytomegalovirus promotor (CMV-TK) [genereret af professor G.Tiraby (Toulouse Universitet), Cayla, France] blev forbigående transficeret ind Y79 , Weri-RB1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1 hjælp Lipofectamine TM 2000 transfektion reagens (Invitrogen, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Kloning af miRNA mål i EGP2-TK-plasmidet

for at konstruere plasmider med lad-7 miRNA målsekvenser blev EGP2-TK bruges som en rygrad indeholder HSV-TK i nedstrøms EGP2 promotor. Til konstruktion af miRNA-mål, blev oligonukleotider designet med lad-7b mål (perfekte supplement sekvens af Lad-7b miRNA blev taget fra miRBase tiltrædelse no-MIMAT0000063) efterfulgt af

Kpnl

der er udpeget som T1A (med mål perfekte vende et supplement til lad-7b miRNA) og T1B (perfekt supplement til T1A) blev udglødet og ligeret mellem

NotI

BstBI

restriktionssteder resulterer i EGP2-TK-2T har 2 kopier af de lad-7b mål.

Kpnl

/

BstBI

fragment blev fordøjet med respektive enzymer og ligeret med oligonukleotider med yderligere to eksemplarer af lad-7b målsekvenser. Hvilket er udpeget som T2A (med mål perfekt supplement til lade-7b miRNA) og T2B (perfekt supplement til T2A) hhv. Disse blev annealet og ligeret resulterende i EGP2-TK-4T have 4 kopier af lad-7b målsekvenser. De kontrolmål C1A, C1B og C2A, C2B blev genereret ved at tage den perfekte omvendt komplementære af Lad-7b miRNA mål. Gennem hele manuskriptet EGP2-TK med 2 kopier af lad-7b mål vil blive nævnt som EGP2-TK-2T og 4 kopier af lad-7b mål som EGP2-TK-4T. På samme måde EGP2-TK med 2 kopier af lad-7b styresekvens vil blive betegnet som EGP2-TK-2C og 4 kopier af styresekvens vil blive betegnet som EGP-TK-4C. Plasmidkonstruktionerne for luciferase (luc) reporter assay blev genereret ved at erstatte HSV-TK-genet med

Guassia luciferase

gen. De luciferase konstruktioner blev navngivet som nævnt ovenfor at erstatte TK med luc. Tabel 1 viser de oligonukleotider, der anvendes i undersøgelsen.

miRNA ekspressionsanalyse

TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit og TaqMan® Universal PCR Master Mix uden Amperase® UNG fra Applied BioSystems (CA, USA) blev anvendt til detektion og kvantificering af modent miRNA. Kvantificering blev udført i overensstemmelse med producentens protokol under anvendelse af 1 ug totalt RNA-prøve. Vi brugte RNU6 miRNA (assay-id, 001.093) som kontrol. TheTaqMan® MicroRNA (Applied Biosystems) individuelle analyser blev anvendt til følgende miRNA skøn: HSA-lad-7a (assay-id, 000.377), HSA-lad-7b (assay-id, 2619), HSA-lad-7c (assay-id, 000.379), HSA-lad-7d (assay-id, 002.283), HSA-lad-7e (assay-id, 2406), HSA-lad-7f (assay-id, 000.382), og HSA-let-7 g (assay-id, 0.002.282 ) og HSA-lad-7i (assay-id, 002.221). Data blev normaliseret ved hjælp Ct-værdier for huset-holder gen U6 i hver prøve. At beregne relative mængder af miRNA blev den gennemsnitlige Ct værdien af ​​U6 RNA subtraheres fra den for target miRNA at opnå ændringen i Ct-værdi. Den gange ændring i genekspression blev derefter bestemt som log2 relative enheder. PCR-produkterne blev påvist med et ABI PRISM 7500 Sequence Detection systemet og analyseres med det ABI PRISM 7500 SDS software (Applied Biosystems).

reportergenassay

Vi anvendte luciferasereportergen assay for promotoren styrke analyse og studere miRNA forordning om transgen ekspression. pGluc plasmid indeholdende CMV-promotoren drevne -luciferase konstruktion blev indkøbt fra (New England Biolabs, MA, USA). Den EGP2 promotoren blev klonet foran en luciferase gen (EGP2-luc) udskiftning af CMV-promotoren. De 2 og 4 kopier af lad-7b målsekvenser blev klonet i 3’UTR-regionen af ​​konstruktionen (EGP2-luc). Den transfektion blev gjort forbigående med følgende plasmider CMV-Luc, EGP2-Luc, EGP2-luc-2T, EGP2-luc-4T, EGP2-luc-2C og EGP2-luc-4C. Efter 48 timers transfektion med luciferase-konstruktion blev cellerne vasket med PBS og dyrket i frisk medium i yderligere 24 timer. Cellerne blev høstet og analyseret for luciferase og β-galactosidase aktiviteter i overensstemmelse med producentens protokoller (New England Biolabs).

Western blot-analyse

For at analysere ekspressionen af ​​TK og EpCAM proteiner, blev de samlede celleekstrakter fremstilles ved at lysere cellerne i lysepuffer [10 mM Tris-HCI pH 7,2, 2% SDS, 10 mM dithiothreitol, 1% protease og phosphataseinhibitorer cocktail (Sigma-Aldrich, MO, USA)]. Proteinkoncentrationen blev bedømt ved Lowry metode. Cellelysaterne blev blandet med 5X Laemmli loading buffer og kogt i 5 min. Lige store mængder (50 ug) protein blev underkastet elektroforese på en 12% SDS-polyacrylamidgel og elektro-blottet til nitrocellulose membran. Membranenhederne blots blev blokeret i 1 time med 5% skummetmælk i TBS indeholdende 0,1% Tween-20 og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistof. HSV-TK (tilvejebragt af Dr. William C. Summers, Yale University) og EpCAM (cellesignalering, MA, USA) antistoffer blev anvendt ved fortynding af 1:100 og 1:150 hhv. Blottene blev vasket og inkuberet med passende peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (anti-kanin 1:5000; anti-muse 1:2000 (cellesignalering) i 3 timer ved stuetemperatur og visualiseret med tetramethylbenzidin /hydrogenperoxid (TMB /H

2O

2, Bangalore Genei, Indien) reagens i henhold til producentens anvisninger. Membraner blev strippet hjælp 100 mM glycin, pH 2, i 40 minutter, blokeret, og igen undersøgt for β-actin (Sigma). blottene blev scannet med en UVP BioDoc-IT imaging system (CA, USA) og Densitometrisk analyse af digitaliserede billeder blev udført med ImageJ software (NIH). intensiteten for hvert bånd blev normaliseret til intensiteten af ​​den tilsvarende β-actin band efter baggrunden normalisering.

Måling af følsomhed over for Ganciclovir (GCV)

Y79, Weri-RB1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1cells blev podet i en 96 brønds plade 24 timer forud for transfektion med en tæthed på 10.000 celler per brønd for at bestemme cellernes levedygtighed. transfektionen blev udført transient med plasmider indeholdende CMV-TK, EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK- 2C, EGP2-TK-4C og inkuberet i 48 timer. Cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer (1, 10, 50,100 uM) af GCV i 24 timer. Følsomheden over for GCV blev evalueret ved brug af kolorimetriske MTT-assayet. En multi-brønd scanner (BioTek, VT, USA) blev anvendt til at måle absorbansen ved 570 nm bølgelængde. De ikke-transficerede ubehandlede kontroller blev tildelt en værdi på 100%. Cell overlevelse blev beregnet ved ligningen:. Test OD /Kontrol OD x 100%

Immunofluorscence

Følgende transfekterede cellelinier MIO-M1, Nthy-ori-3-1, Weri-RB1 blev Y79-celler vasket med 1 × PBS og fikseret med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter permeabiliseres med 0,25% Triton X-100 i 5 min. Cellerne blev blokeret med 5% føtalt bovint serum i 30 minutter, inkuberet med anti-spaltede caspase 3 (cellesignalering) og anti-Bcl2 antistof (cellesignalering) i 3 timer, derefter med FITC (grøn) og TRITC (rød) konjugeret sekundære antistoffer (Jackson Immunoresearch, PA, USA) i 2 timer. Cellerne farvning blev visualiseret ved hjælp af en Zesis Axio vison omvendt systemet mikroskop med 10X mål. At sikre specificiteten af ​​farvning blev billeder opnået under anvendelse indstillinger i hvilke der ingen fluorescens var påviselig i negative kontroller med sekundære antistoffer alene (data ikke vist).

Statistisk analyse

Data er udtrykt som middelværdier ± SD af 3 eksperimenter med hvert eksperiment udført i triplikater. Statistisk signifikans blev beregnet med Students t-test og ap-værdi ≤ 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Begrænset TK udtryk ved EGP2 promotor

Vi analyserede den selektive ekspression af transgenet ved EGP2 promotor i Y79, Weri-RB1, Nthy-ori 3-1 cellelinjer. Western blot analyse viste EpCAM proteinekspression i Y79, Weri-RB1, Nthy-ori 3-1 celler og dens udtryk blev ikke set i MIO-MI cellelinje (Figure1A). Derfor Y79, Weri-RB1 blev Nthy-ori 3-1cells betragtes som EpCAM positive (EpCAM

+ ve) og MIO-MI som EpCAM negative (EpCAM

ve) til EpCAM proteinekspression. Til evaluering af EGP-2-promotoren for sin evne til at regulere HSV-TK-ekspression i EpCAM-udtrykkende celler, vi forbigående transficeret cellerne med EGP2 promoter drevet HSV-TK konstruktion (EGP2-TK). CMV-promotor-drevet HSV-TK (CMV-TK) konstruktion blev anvendt som en positiv kontrol. I CMV-TK forbigående transficerede celler, blev TK protein udtrykt i alle cellelinier (Nthy-ori 3-1, Y79, Weri-RB1 og MIO-M1) (figur 1B). I EGP2-TK forbigående transficerede celler, blev TK-ekspression set i Nthy-ori 3-1, Y79 og Weri-RB1 celler. Endvidere TK proteinekspression var lav i MIO-M1-celler (figur 1C). Dette kan skyldes den utætheder af EGP2 promotoren som rapporteret tidligere i andre promotorer [34], [35]. I real time PCR eksperimenter viste CMV-promotoren drevne TK-genet konsekvent ekspression i alle de 4 cellelinjer (figur 1D). EGP2-TK transficerede Nthy-ori 3-1 viste Y79 og Weri-RB1 cellelinier signifikant højere TK-ekspression i forhold til CMV-TK transficerede cellelinier. Imidlertid EpCAM promotoren signifikant reduceret TK-genekspression i MIO-MI cellelinje (figur 1D). Reportergen assay viste, at CMV-luc transfektion udviste et signifikant højere genekspression sammenlignet med de ikke-transficerede celler. Den EGP2-luc transfektion ind i Nthy-ori 3-1, Y79 og Weri-RB1 cellelinier viste signifikant højere luciferaseekspression i forhold til CMV-luc-transficerede celler undtagen i MIO-M1, hvor luciferase-ekspression er betydeligt lavere i EGP2- luc transfektion (fig 1E). Disse resultater viser, at EpCAM-promotoren selektivt aktiveres i EpCAM positive cellelinier Y79, Weri-RB1, Nthy-ori 3-1, og ikke i EpCAM negativ cellelinie MIO-M1.

EpCAM ekspression blev vurderet ved western blot-analyse og β-actin blev anvendt som en loading kontrol (a). Den transgen ekspression drevet af EGP2 og CMV-promotoren blev evalueret ved transient transfektion af CMV-TK, EGP2-TK, CMV-luc, og EGP2-luc. Efter 2 dages transfektion TK proteinekspression drevet af CMV-promotoren blev vurderet ved Western blot-analyse, og resultaterne blev normaliseret mod β-actin (B). TK-proteinekspression drevet af EGP2 promotoren blev vurderet ved Western blot-analyse og resultater blev normaliseret mod β-actin (C). Protein kvantificering blev kvantificeret ved hjælp ImageJ software og proteinekspression blev udtrykt i relative signal intensitetsværdier. TK-mRNA-niveauer blev kvantificeret ved Real-time PCR, mRNA-niveauerne blev normaliseret mod GAPDH og blev udtrykt i relative fold change enheder (D). Luciferaseekspression analyse blev udført ved at kvantificere den udskilte Gaussia luciferase. Resultaterne blev normaliseret mod un-transficerede celler og blev udtrykt i relative lysenheder (E). Normaliserede niveauer af luciferaseekspression i procent er vist som middelværdi ± standardafvigelse (n = 3). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 vs. Control + p 0,05, ++ p 0,01, +++ p. 0,001 vs. CMV-luc

EGP-2-promotoren styrer selektiv celledrab ved begrænset ekspression af TK

for at vurdere de funktionelle aspekter af TK-genekspression, forskellige koncentrationer (1, 10, 50, 100 uM) af GCV behandling blev gjort i 24 timer på CMV-TK eller EGP2-TK forbigående transficerede cellelinjer, såsom Y79, Weri-RB1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1. Den 10 uM koncentration af GCV behandling viste næsten 50-60% cellelevedygtighed i alt CMV-TK transficerede cellelinjer undersøgt. Procentdelen af ​​cellelevedygtighed faldt med stigende koncentration af GCV i Nthy-ori 3-1, Y79, og Weri-RB1 celler (figur 2A, 2C, 2D). I disse cellelinjer blev cellelevedygtigheden faldt under EpCAM-promotoren reguleres TK sammenlignet med CMV-promotoren reguleres TK i EpCAM

+ ve celler. I MIO-MI-celler, cellelevedygtigheden er omkring 60% under CMV-promotoren regulering af TK /GCV (figur 2B) og 90% under EpCAM promotor regulering af genet. Endvidere cellelevedygtigheden faldt betydeligt under EpCAM-promotoren reguleres TK i Y79, Weri-RB1, Nthy-ori 3-1 celler. Disse resultater antyder EGP2 promotoren udtrykker TK-genet i EpCAM

+ ve og ikke i EpCAM

ve cellelinier.

Cellelevedygtighed assay ved MTT blev vurderet ved at transficere EGP2-TK og CMV -TK plasmider ind i cellelinier. Nthy-ori-3-1 (A), MIO-M1 (B), Y79 (C), Weri-RB1 (D). Efter 48 timers transfektion, efterfulgt af GCV behandling ved forskellige koncentrationer (1, 10, 50, 100 uM) i 24 timer. Resultaterne blev normaliseret mod un-transficerede celler og blev udtrykt i procent af cellelevedygtighed. Cellernes levedygtighed blev vist i procent middel ± SD (n = 3).

Tilstedeværelse af lad-7 familie miRNA i retinoblastoma af real-time kvantitativ PCR

Det er blevet rapporteret, at , lad-7 familie miRNA er apoptotiske, og stærkt konserveret på tværs af arter i rækkefølge og funktion og deregulering af lad-7 familie fører til kræft [25]. Vi analyserede ekspressionsprofilen af ​​lad-7 familie i (n = 10) primære retinoblastom tumorer og Y79, WER-RB1, MIO-M1, Nthy-ori 3-1 cellelinjer (figur 3). Lad-7 familie blev nedreguleret i primære tumorer sammenlignet med den for det normale voksne nethinden. Lad-7a var stærkt nedreguleret blandt bogstav 7 familiemedlemmer i primære tumorer (figur 3A, B). Lad-7c og lad-7d var stærkt nedreguleret i Y79 og Weri-RB1, når det blev sammenlignet med MIO-M1cell linje (figur 3C). I Nthy-ori 3-1 cellelinje blev alle miRNA opreguleret sammenlignet med MIO-M1 (figur 3C). Desuden viste lad-7b konsekvent nedregulering i både retinoblastom cellelinier i forhold til andre lad-7 familiemedlemmer og viste høj opregulering i Nthy-ori 3-1. Derfor blev denne (lad-7b) valgt at klone miRNA target sekvenser i vores plasmidkonstruktioner.

udtryk for lad-7 miRNA blev kvantificeret ved hjælp af real time PCR. Udtrykket analyse af lad-7 familie miRNA blev evalueret i retinoblastoma primære tumorer. Resultaterne blev normaliseret mod normal voksen nethinden og blev udtrykt i fold ændringsværdier forhold til normal voksen nethinden (A, B). Udtrykket analyse af lad-7 familie miRNA blev evalueret i retinoblastom cellelinier. Resultaterne blev normaliseret mod MIO-M1 og blev udtrykt i gange ændring værdier i forhold til MIO-M1 (C). miRNA fold ændring blev beregnet ved hjælp af 2

-▵▵CT metode.

In vitro

luciferaseanalyse medieret af pCMV /EGP2-

luc

vektorer

transfektion af EGP2-TK og EGP2-Luc konstruktioner i EpCAM negativ cellelinie viste signifikant udtryk for TK og luciferase gener (Figur 1 C, E). En væsentlig cytotoksicitet ved GCV behandling observeret i EpCAM negativ cellelinie MIO-M1 upon EGP2-TK transfektion med GCV-behandling (fig. 2B) kunne skyldes utætte ekspression af EGP2 promotoren i EpCAM negative cellelinjer. En lignende utætte ekspression af GFAP promotoren blev observeret i normale astrocytter [34]. At regulere uspecifik ekspression af transgen drevet af EGP2 promotor, vi klonet lad-7b mål på 3’UTR region EGP2-luc-konstruktionen (figur 4A). Cellerne blev transficeret med EGP2-luc, EGP2-luc-2T EGP2-luc-4T, EGP2-luc-2C, EGP2-luc-4C plasmidkonstruktioner og luciferasegenet ekspression blev analyseret efter 24 timer. En betydelig reduktion i luciferaseaktiviteten blev observeret med EGP2-luc-2T og EGP2-luc-4T sammenlignet med EGP2-luc i MIO-M1 (EpCAM

ve /lad-7b

op reguleret) og Nthy -ori 3-1 (EpCAM

+ ve /lad-7b

opreguleret) celler (figur 4B). En yderligere signifikant reduktion i luciferaseaktiviteten i EGP2-luc-2T sammenlignet med EGP2-luc-4T blev observeret i MIO-M1 celler. Men i Y79 og Weri-RB1 (EpCAM

+ ve /let7

nedreguleret) celler, vi ikke observere signifikant reduktion i luciferaseaktiviteten af ​​EGP2-luc-2T og EGP2-luc-4T forhold til den EGP2-luc (figur 4B). Disse resultater understreger behovet for miRNA regulering af transgenekspression sammen med den vævsspecifikke promotor til målrettet ekspression af transgen.

miRNA målsekvenser to kopier eller fire eksemplarer, som beskrevet i tabel 1. reportergenet luciferase under CMV-promotoren blev klonet i EpCAM-TK-konstruktionen ved at fjerne TK-genet og indsætning luciferasegenet. miRNA mål blev klonet i 3’UTR region af ekspressionsvektoren indeholdende Gluc genet under EpCAM-promotoren (A). Luciferase-ekspression blev kvantificeret ved secerneret Gaussia luciferase. Plasmidet konstruerer EGP2-luc, blev EGP2-luc-2T, EGP2-luc-4T, EGP2-luc-2C, og EGP2-luc-4C transficeret i MIO-M1, Nthy-ori 3-1, Y79, Weri-RB1 cellelinier. Efter inkubation i 48 timer resultaterne blev normaliseret til un-transficerede celler og blev udtrykt i relative lysenheder (B). Luciferase værdierne er udtrykt som procent middel ± standardafvigelse (n = 3). * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001 vs EGP-2-luc-2T

Cell specifikke cytotoksicitet ved dobbelt kontrol vektor transfektion med GCV behandling var højere end ETK alene

Vi evaluerede målrettet cytotoksicitet induceret af GCV behandling på EGP2-TK-2T og EGP2-TK-4T transfektion sammenlignet med kontrollerne EGP2-TK, EGP2-TK-2C og EGP2-TK-4C i alle de 4 cellelinjer. De normale cellelinier Nthy-ori 3-1 (figur 5A) og MIO-M1 (figur 5B) transficeret med EGP2-TK-2T og EGP2-TK-4T-konstruktioner med GCV behandling resulterede i signifikant lavere celledød i forhold til EGP2- TK. Disse cellelinier viste signifikant mindre cytotoksicitet medieret af EGP2-TK-2T sammenlignet med EGP2-TK-4T-konstruktionen. I retinoblastom cellelinier Y79 (figur 5C), Weri-Rb-1 (figur 5D) transficeret med EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK-2C og EGP2-TK-4C-konstruktioner, efterfulgt af GCV behandling viste ingen signifikant forskel i celledød. Disse resultater viser, at celle specifikke cytotoksicitet medieret af HSV-TK efter behandling med GCV lægemiddel blev reguleret af lad-7b miRNA mål i de normale cellelinier.

Cellelevedygtighed assay ved MTT blev vurderet ved at transficere EGP2-TK , EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK-2C, EGP2-TK-4C plasmider i cellelinierne, Nthy-ori-3-1 (A), MIO-M1 (B), Y79 ( C), Weri-RB1 (D). Efter 48 timers transfektion, efterfulgt af GCV behandling ved forskellige koncentrationer (1, 10, 50, 100 uM) i 24 timer, aflæsninger blev målt ved 570 nm ved anvendelse af spektrofotometer. Resultaterne blev normaliseret til utransficerede celler. Cellelevedygtighed blev vist i procent middel ± standardafvigelse (n = 3). * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001 vs. kontrol

EpCAM promotor og lad-7b målsekvens medierer udtryk for apoptotisk markør i retinoblastomceller

for at styre rapporterede utætte udtryk for TK-genet i de ikke-målrettede normale celler (figur 1 2), vi transficeret EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-2C konstruktioner i følgende cellelinjer : N-Thy-Ori-3.1, MIO-M1, Y79 og Weri-Rb-1. Da vi observerede EGP2-TK-2T viste signifikant effekt i at kontrollere transgen ekspression, vælger vi kun EGP2-TK-2T til analyse apoptose markører efter GCV behandling. Den EGP2-TK konstruktion blev højt udtrykt i EpCAM

+ ve cellelinjer, Nthy-ori 3-1 (figur 6A, bane 1), Y79 (figur 6A, bane 3), Weri-Rb-1 (figur 6A, bane 4), sammenlignet med EpCAM

ve MIO-M1cell linje (figur 6A, bane 2). Transfektion af EGP2-TK-2T-konstruktionen begrænset TK-ekspression kun i retinoblastom cellelinier (figur 6B, bane 3, 4) og ikke i normale cellelinjer, såsom MIO-M1 og Nthy-ori 3-1 selv i nærvær af EpCAM-protein. De EGP2-TK-2T transficerede retinoblastom cellelinier behandlet med GCV lægemiddel viste den apoptotiske markering, aktiveret Caspase3 og nekrotisk markør PARP-1 ekspression (figur 6C, bane 3, 4), men ikke i normale cellelinier (figur 6C, bane 1, 2). For yderligere at validere den apoptotiske markører ekspression udførte vi immunofluroscence eksperimenter, hvor lignende resultater blev observeret, hvilket understøtter den apoptotiske markør-ekspression på western blot (figur S1). I stedet for PARP anvendte vi Bcl-2, som er et anti apoptotisk markør.

Western blot-analyse blev udført for tilstedeværelse af TK-proteinet, blev EGP2-TK transficeret ind Nthy-ori-3-1, MIO-M1 , Y79 og Weri-Rb-1 cellelinjer (A).