PLoS ONE: Atomic force mikroskopi afslører en rolle for endotel Cell ICAM-1 ekspression i blærekræft Cell Overholdelse

Abstrakt

Kræft metastase er en kompleks proces, der involverer celle-celle-interaktioner medieret af celle klæbende molekyler. I denne undersøgelse bestemme vi klæbestyrken mellem et endotelcelle-monolag og tumorceller af forskellige metastatiske potentialer ved hjælp atomic force mikroskopi. Vi viser, at bruddet kræfter receptor-ligand obligationer øges med tilbagetrækning hastighed og interval mellem 20 og 70 pN. Det er vist, at de mest invasive cellelinjer (T24, J82) danner de stærkeste bindinger med endothelceller. Brug af ICAM-1 overtrukne substrater og et monoklonalt antistof specifikt for ICAM-1, viser vi, at ICAM-1 fungerer som en central receptor på endotelceller, og at dets interaktioner med ligander udtrykt af tumorceller er korreleret med ruptur kræfter opnået med de mest invasive kræftceller (T24, J82). For de mindre invasive cancerceller (RT112), går endotel ICAM-1 ikke synes at spille nogen rolle i adhæsion processen. Desuden en detaljeret analyse af fordelingen af ​​ruptur kræfter tyder på, at ICAM-1 interagerer fortrinsvis med en ligand på T24 cancerceller og med to ligander på J82 kræftceller. Mulige counter receptorer for disse interaktioner er CD43 og MUC1, to kendte ligander for ICAM-1, som er udtrykt af disse cancerceller

Henvisning:. Laurent VM, Duperray A, Sundar Rajan V, Verdier C (2014) Atomic kraft Mikroskopi afslører en rolle for endotel Cell ICAM-1 ekspression i blærekræft Cell Overholdelse. PLoS ONE 9 (5): e98034. doi: 10,1371 /journal.pone.0098034

Redaktør: Andrew Pelling, University of Ottawa, Canada

Modtaget: Januar 21, 2014 Accepteret: April 28, 2014; Udgivet: 23. maj 2014

Copyright: © 2014 Laurent et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Kilderne finansiering, der har støttet arbejdet er nanovidenskab Foundation, ANR Transmig, La Ligue contre le cancer, LABEX Tec21. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

adhæsive interaktioner af cancerceller med endotelet er centrale begivenheder i metastase-processen (dvs. dispersionen af ​​cancerceller fra et organ til andre dele af kroppen) [1], [2]. Under dannelsen og væksten af ​​tumorer, cancerceller formår at flygte fra primære tumorer og gennemtrænge blod flow, således kan bevæge sig over lange afstande. På fjerne steder i det menneskelige legeme, cancerceller interagerer med endotelet, klæbe og vinder ekstravasatet, dvs. migrerer gennem endothelial barriere. Leukocytter og cancerceller anvender lignende mekanismer til interaktion med endotelceller (ECS), men mens fænomenerne adhæsion og migrering af leukocytter gennem endotelet især er blevet undersøgt under inflammation, er tilgængelige få resultater vedrørende den rolle, som de centrale molekyler involveret i vedhæftning og transmigration af kræftceller [1], [3], [4], [5].

Ligesom leukocytrekruttering, tethering og rulning af tumorceller (TCS) på endotel er blevet påvist for nogle kræftceller og er medieret af selectiner. Efter denne indledende interaktion, faste adhæsion finder sted, medieret af flere celleadhæsionsmolekyler tilhører integrinfamilien [6] samt intercellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1) og vaskulært celleadhæsionsmolekyle-1 (VCAM-1) fra immunglobulin familien, hvilket fører til tumorinvasion [7], [8]. VCAM-1 udtrykkes af endotelet efter stimulering, og interagerer med α4β1 integrin, mens ICAM-1 udtrykkes af EC’er, leukocytter og nogle TC’er, og kan opreguleres ved inflammatoriske cytokiner. ICAM-1 er involveret i leukocytadhæsion til endotelet ved dets interaktioner med LFA-1 og Mac-1 leukocyt integriner (β2 integrin). TC mangler p2 integriner, men neutrofiler kan fungere som en bro mellem TC’er og ECS, med LFA-1 på leukocytter binding til ICAM-1 udtrykt på både endotel og TC [5]. Desuden ICAM-1 er en receptor for andre molekyler, såsom CD43 [9] og MUC1 [10], som er udtrykt af nogle TC’er.

Cancer progression er forbundet med ændringer i ekspressionen af ​​nogle klæbemiddel molekyler. Nogle værker undersøgte forholdet mellem N-cadherin ekspression og progressionen af ​​tumoren malignitet [11], [12]. En stigning på cancercelle invasionsevne kombineres med omkobling af E-cadherin ved N-cadherin og en stigning i ekspressionen af ​​visse integrin underenheder [13]. Fra et kvantitativt synspunkt, har sammenligningen af ​​klæbende egenskaber i ikke-maligne og maligne epiteliale blære celler vist, at en øget N-cadherin niveau i T24 maligne celler blev ledsaget af ændringer i uforpligtende egenskaberne af de enkelte N-cadherinmolekyler [14] . Derudover har ICAM-1-ekspression blevet forbundet med en mere aggressiv tumor fænotype [15], [16]. Ikke desto mindre er de involveret i firmaet vedhæftning af TC-ligander endnu ikke så klart defineret som for leukocytter, og kvantificering af sådanne adhæsive interaktioner mellem EC’er og kræftceller er ikke blevet undersøgt hidtil.

Kvantitative oplysninger om celle klæbekræfter kan opnås ved hjælp af forskellige kraft spektroskopiteknikker: bio-membran force probe [17], optisk pincet [18] og atomic force mikroskop (AFM) [19]. Alle disse teknikker, der opererer under et optisk mikroskop tillader at visualisere cellerne og samtidig måle adhæsionskræfter fra nogle få pN til nogle få hundrede pN eller mere. I dette arbejde, vælger vi at bruge enkelt-celle force spektroskopi tilstand af AFM til at studere celle-celle-interaktioner er involveret i vedhæftning af FKS på EC’er. I modsætning til andre metoder til klæbestyrke, denne teknik gør det muligt at foretage målinger i en konfiguration tæt på

in vivo

situation. En cancercelle er fastgjort til en blød cantilever og bringes i kontakt med en EF-monolag og kraftsignalet overvåges takket være AFM cantilever deformation [19], [20]. Signalet giver også afsløre begivenheder såsom mulige breakups af receptor-ligand obligationer samt den globale vedhæftning styrke ved celleniveau.

Bestemmelse af celle-celle-interaktioner blev udført for forskellige cantilever tilbagetrækning hastigheder at undersøge, hvordan ruptur kraft (involveret i celle-celle klæbende obligationer) er ændret. Vi undersøgte forholdet mellem de målte receptor-ligand obligationer og den tilsvarende metastatiske potentiale af humane blære cancerceller, for at bestemme den klæbende underskrift af sådanne cancerceller. Endelig viser vi, at ICAM-1 receptor på EC’er fungerer som en nøglemediator for limen interaktion med de mest invasive cancerceller. Vores resultater viser, at de mere invasive blære cancerceller interagerer takket være en eller to typer af ICAM-1-ligander: CD43 og MUC1 er gode kandidater, som påvist ved flowcytometri eksperimenter. Denne viden om sådanne interaktioner er afgørende for forståelsen af ​​kræft celle adhæsion til endotel, en mekanisme, der fører til invasion og metastase.

Materialer og metoder

Celler og cellekultur

Tre blære cellelinier blev anvendt i denne undersøgelse: RT112, T24 og J82 (ATCC, Rockville, MD). Disse cellelinjer repræsenterer progression fra godt til dårligt differentierede fænotyper og opstå fra overfladisk til invasiv epitelial menneskelig blærekræft. RT112 cancerceller er moderat differentieret og er kendetegnet ved en cytologisk grad 2 (eller differentiering) [21]. T24 og J82 cancerceller er dårligt differentieret og karakteriseret ved en cytologisk klasse 3. For at skelne cancerceller fra HUVEC’er blev cancerceller transficeret med et plasmid, der udtrykker GFP (grønt fluorescerende protein – pEGFP). Human vaskulær Umbilical endotelceller (HUVEC’er) blev indkøbt fra Promocell (Heidelberg, Tyskland). Cancerceller blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære, i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 100 UI /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (komplet RPMI-medium). EC’er blev opretholdt i Promocell dyrkningsmedium. ECS blev udpladet i komplet dyrkningsmedium på dækglas overtrukket med kollagen I (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankrig) og forlod 3 dage til at sprede for at opnå konfluens. For AFM eksperimenter, blev dyrkningsmediet tilsat HEPES (20 mM, pH 7,4).

atomic force mikroskopi

Vi anvendte en Nanowizard II AFM (JPK Instruments, Berlin, Tyskland) monteret på et Zeiss mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland). Denne konfiguration gør det muligt at udføre AFM målinger og samtidig observere celler under anvendelse af fasekontrast eller fluorescens tilstande. Denne AFM er også udstyret med “CellHesion” modulet (JPK Instruments, Berlin, Tyskland). Dette modul muliggør en langtrækkende vertikal forskydning af scenen op til 100 um, hvilket gør kraft spektroskopi målinger muligt, herunder celle-celle-interaktioner. Sideløbende er en lodret piezotranslator (PIFOC, Physik Instrumente, Karlsruhe, Tyskland) monteret på mikroskopet målsætning at flytte målet i takt med mikroskopet scenen og fokus på celler under udførelsen af ​​AFM målinger. Alle målinger blev udført ved 37 ° C ved hjælp af Petri Dish Heater (JPK Instruments, Berlin, Tyskland).

Cantilever belægning

Bløde udkragninger var V-formede dem uden vingespids (MLCT- O, Bruker, Frankrig). De blev kalibreret under anvendelse af termiske fluktuationer analysemetode [22], og udviser en fjederkonstant tæt på 0,01 N /m. For at muliggøre vedhæftning af kræftceller til cantilever blev sidstnævnte funktionaliserede hjælp biotin-conA (Interchim, Montluçon, Frankrig) [23]. Efter skylning med PBS blev cantilevere inkuberet natten over ved 37 ° C i biotin-BSA (Interchim, Montluçon, Frankrig) (0,5 mg /ml), skylles igen i PBS og derefter inkuberet i streptavidin (Interchim, Montluçon, Frankrig) (0,5 mg /ml) i 10 minutter. Endelig blev cantilevere skyllet med PBS og sat i en biotin-conA dråbe i løbet af 10 minutter og derefter skyllet med PBS. Dette molekyle tillader binding af cancerceller til støtteben med en kraft større end den celle-celle løsrivelse kraft i vores undersøgelse: biotin-conA klæber til kræft cellemembranen med en afdeling kraft på 2 nN [20], mens frigørelsen Gældende i samspillet mellem cancercellen og EF er af størrelsesordenen 1 nN.

cancercelle capture

cancerceller blev dyrket i dyrkningskolber, derefter blev frigjort lige før AFM eksperimenter under anvendelse af en trypsin /EDTA-opløsning (0,05% trypsin og 0,53 mM EDTA). RPMI-medium med serum blev tilsat til cellerne for at blokere virkningen af ​​trypsin. Endelig blev cellerne centrifugeret og resuspenderet i medium uden serum. Kræftceller blev deponeret i en petriskål, hvorpå en EF-monolag var blevet dyrket, og bosatte sig i et par sekunder. Celleindfangning bestod i at placere cantilever spids over en cancercelle (eftersom cancerceller var fluorescerende, de kunne skelnes fra EC’er, se figur 1), til at komme i kontakt med cellen under ti sekunder med en kraft på 1 nN. Derefter udliggeren med den optagne celle blev tilbagetrukket langsomt ved konstant hastighed, og cellen blev holdt i dyrkningsmedium for at hvile i 15 minutter. Dernæst blev 1 ml RPMI 1640-medium med serum tilsat. Cellen var solidt bundet til cantilever og efterfølgende anvendes til at undersøge vedhæftning til EC’er.

A) Fotografi af cantilever med vedhæftede fluorescerende kræftcelle over HUVEC monolag. Hvid skala bar svarer til 20 um. B) Skitse af den fremgangsmåde-tilbagetrækning fremgangsmåde og typiske tilbagetrækningskraft kurve i forhold til piezo forskydning. Den kræftcelle nærmer EF monolag ved konstant hastighed. Så cellen kommer i kontakt med EF i 10 sekunder (under 1 nN påførte kraft) for at skabe adskillige bond komplekser over adhæsion område. Udliggeren trækkes tilbage ved konstant hastighed med henblik på at frigøre de adhæsive bindinger. Den tilbagetrækning kurve viser tvinger hopper svarende til brud kraft (f), i obligationer. Det klæbende energi (skraverede område) repræsenterer frigørelsen arbejde udliggeren til helt frigøre cellen fra substratet. Den detachement kraft er den kraft nødvendig for at strække kræftcellen og EF indtil obligationer begynder at løsne. Bemærk, at nogle kraft spring kan følge et plateau, som svarer til tøjr dannelse

Kraft spektroskopi:. Analyse af kræftcelle-EF-interaktion

Først kræftcellen blev sat over en EF. Cantilever blev sænket ved konstant lav hastighed (1 um /s) for at sætte cancercellen i kontakt med EF (over kernen). En kompressionskraft på 1 nN blev påført til EF i 10 sekunder (figur 1A) for at skabe bindinger og reproducere faste adhæsion. Endelig blev cancercellen tilbagetrukket med en hastighed på mellem 0,5 um /s til 20 pm /s. Måling af cantilever deformation under lodret bevægelse blev registreret i de forskellige faser (Figur 1B). Typisk for en cancercelle-EF pair, en sekvens af fem kraft kurver blev opnået ved fem forskellige tilbagetrækningsmekanismer hastigheder (med en hviletid på ca. 1 minut mellem hver kurve). Så kræftcellen blev efterladt i hvile i løbet af ti minutter og flyttes over en anden EF til at måle en sekvens af fem kraft kurver igen. Endelig blev hver cancercelle anvendt tre eller fire gange, derfor femten eller tyve sådan kraft kurver (N = 15 eller N = 20) blev opnået. Målingerne blev derefter opsamlet til forskellige cancercellelinier, under lignende forsøg. En skitse af den typiske tilbagetrækningskraften i form af piezo forskydning er vist i figur 1C. Den mindste punkt på kurven er adskillelse kraft, dvs. den nødvendige kraft til at adskille cancercellen fra EF. Frigørelsen kraft understøttes af cellen deformerbarhed, men tillige af antallet og styrken af ​​klæbebindinger dannet mellem celler. De forskellige spring i kraft svarer til de successive breakups af obligationer, der er involveret i celle-celle interaktion [24], [25], og derfor repræsenterer ruptur kræfter (dvs. receptor-ligand obligationer). Bemærk, at en kraft spring kan følge et plateau i kraft, svarende til tøjr dannelse, hvis forlængelse er plateauet længde. Den tilbagetrækning kurve indeholder også oplysninger om vedhæftningen energi, som er det nødvendige arbejde for at frigøre kræftcellen (skraverede område i figur 1C). Dette omfatter arbejdet for at strække celler samt arbejdet for at bryde de molekylære bindinger [25]. Alle disse parametre (detachement kraft, brud kraft, vedhæftning energi) opnås fra kraft kurve ved hjælp af Image Processing Software (JPK instrument, Berlin, Tyskland). For hvert sæt betingelser blev AFM eksperimenter udført omkring 9 gange på 3 forskellige dage. Medmindre andet er angivet, er data rapporteret som middelværdi ± standardfejl på middelværdien. Alle statistiske tests blev udført under anvendelse af R-softwaren (2,14 release). Da dataene er korreleret, brugte vi en generaliseret lineær Mixed Model (GLMM). Forskelle mellem de beregnede parametre på ubehandlede og anti-ICAM-1-behandlede celler blev testet ved den blandede funktion af AFEX pakke i F software.

Inhibering af ICAM-1-ligander på EC’er

Humant monoklonalt antistof mod ICAM-1 [27] blev anvendt ved en 30 pg /ml koncentration. Før AFM eksperimenter blev EC’er inkuberet i 15 minutter i nærværelse af antistoffet ved 37 ° C. Derefter blev cellerne skyllet to gange i PBS og inkuberet i 2 ml dyrkningsmedium.

Immobilisering af ICAM-1 og BSA

En 20 pi alikvot af rekombinant ICAM-1 (RD Systems, Lille, Frankrig) (25 ug /ml) i 0,1 M NaHCO

3 (pH 8,6) blev adsorberet natten over ved 4 ° C i midten af ​​dækglasset. Ubundne proteiner blev fjernet ved vask med PBS og 2 ml komplet RPMI 1640 medium blev derefter tilsat til ICAM-1 coatet skål før AFM eksperimenter.

På BSA-coating-protokol, en pi alikvot af BSA ved 100 ug /ml i PBS blev adsorberet i 30 minutter ved 37 ° C i midten af ​​petriskålen. Ubundne proteiner blev fjernet ved vask med PBS, og 2 ml af det komplette RPMI-medium blev derefter tilsat til BSA coatet skålen før AFM eksperimenter.

Flowcytometrianalyse af ICAM-1, MUC1 og CD43 ekspression og immunfluorescensfarvning

Expression niveauer af ICAM-1 (på EF overflade), blev MUC1 og CD43 (på kræftcellen overflade) analyseres ved flowcytometri (Accuri C6 flowcytometer, BD Bio-videnskaber). Kvantificering blev foretaget ved at måle den geometriske middelværdi fluorescens. For immunfluorescensfarvning blev dækglas coatet med 25 ug /ml humant fibronectin. Celler blev fikseret med 2% paraformaldehyd og forarbejdet til indirekte immunfluorescens mikroskopi.

Til måling ekspressionsniveauer af ICAM-1 og MUC1, EC’er eller cancerceller blev inkuberet med det primære antistof og derefter med FITC-konjugeret (ged anti-mus IgG) sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch, USA). De primære antistoffer er et humant monoklonalt antistof mod ICAM-1 [26] eller et anti-MUC1 monoklonalt antistof C595 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). Den anti-MUC1 antistof genkender et tetrapeptid motiv i proteinet kerne MUC1 molekylet.

I CD43 ekspressionsniveau, cancerceller blev inkuberet med et monoklonalt antistof CD43-klonen L10 mærket med FITC (Invitrogen, USA), som reagerer med det ekstracellulære domæne.

Resultater

Vedhæftning af forskellige cancer cellelinjer

for at vurdere, om kræft celle invasionsevne er relateret til dets klæbende egenskaber, vi udført force spektroskopi målinger rettet mod samspillet mellem kræftceller (af forskellig invasionsevne) og ECS. De kræftceller skyldes følgende cellelinjer: RT112, T24 og J82. RT112 celler er de mindre invasive celler, mens T24 og J82 celler er de mere invasive dem [21]. Kraft kurver blev udført mellem en cancercelle fastgjort til cantilever spids og et monolag af EC’er udpladet på et dækglas. Figur 2 viser typiske kraft kurver opnået under samspillet mellem de tre kræft celletyper (T24, J82 og RT112) med ECS. Hver tilbagetrækning kurve (tilbagetrækning hastighed V = 5 um /s) viser flere ruptur hændelser knyttet til den successive brydning af bindinger, der er involveret i celle-celle interaktion. Interessant, de mindre invasive celler (RT112) præsentere mindre brud kraft skridt i forhold til de fleste invasive celler (T24, J82). Desuden frigørelsen kraft, der er den minimale punkt (figur 2A-B-C) af kurven er mindre for RT112 celler. Figur 2A-B-C viser også fordelingen af ​​ruptur kræfter detekteret for cancercellelinjer interaktioner med EC’er på V = 5 um /s. Disse størrelser [10-70 Pn] er i området fra typiske kraftværdier opnået for receptor-ligand obligationer [23], [27], [28], [29]. Det er bemærkelsesværdigt, at de tre celletyper udviser forskellige kraftværdier: målinger afslører en gennemsnitlig brud kraft 29,6 ± 0,8 pN for RT112, 34,0 ± 0,9 pN for T24 og 44,2 ± 1,1 PN to J82 (V = 5 um /s). Bemærk, at de gennemsnitlige ruptur kræfter er mindre for RT112 celler, som er den mindre invasive art.

Typiske kraft kurver efter 10s-kontakt mellem en TC og en EF om et HUVEC monolag. Probability histogrammer med opsamlede ruptur kræfter f for J82 (A), T24 (B) og RT112 celler (C) ved V = 5 um /s. Lodrette pile angiver eksempler på force hopper svarende til opløsningen af ​​receptor-ligand obligationer.

Vedhæftning energi og detachement kraft (celleniveau)

Et vigtigt aspekt at karakterisere interaktionen af ​​kræftceller ECS er vedhæftningen energi, som involverer hele kontakt celleområdet. Adhæsionen energi afledes gennem integration af arealet under kurven F (z), hvor F er den kraft, og z er den piezo forskydning. Grundlaget linje vælges som den endelige grænseværdi, efter alle obligationer er fritliggende. Den JPK software gør det muligt at vælge denne værdi, og derefter udfører integration. Derfor undersøgte vi vedhæftningen energi samt frigørelsen kraft (absolutte værdi af den minimale kraft på tilbagetrækningskraften kurve, se figur 1 B) versus tilbagetrækning hastighed (V). Som vist i figur 3, er disse to parametre øges med tilbagetrækning hastighed. Med hensyn til adhæsion energi, de mest invasive J82 celler til stede større værdier i forhold til de T24 eller RT112 celler. Desuden er denne forskel bekræftes af de udstationeringsprocedurer kraftværdier som er højere for J82 celler i sammenligning med T24 og RT112 celler. Under alle omstændigheder, udstationering styrker eller vedhæftning energier er altid mindre med mindre invasive RT112 celle.

Plot af vedhæftningen energi (A) og løsrivelse kraft (B) vs. tilbagetrækning hastighed efter 10s-kontakt mellem en TC og en EF om et HUVEC monolag. Tre cancer cellelinjer: T24 (åben cirkel), J82 (fuld firkant) og RT112 (fuld trekant). Data er plottet som gennemsnit ± standardfejl af gennemsnittet. Linjen er blot en vejledning for øjet.

Effekt af tilbagetrækning fart på brud kraft

brud kraft har vist teoretisk at afhænge af logaritmen til belastningsgraden af cantilever [30]. For at undersøge underskrivelsen af ​​hver kræft cellelinje, er man nødt til at analysere kraft spektre af de tre kræft celletyper i løbet af deres interaktion med EC’er (figur 4). Disse spektre nuværende styrke værdier afhængigt af tilbagetrækningskroppen hastighed eller ækvivalent belastningsgraden r

f (N /S), lig med produktet af tilbagetrækningskroppen hastighed V (m /s) gange fjederkonstanten k (N /m) af cantilever, dvs. r

f = kV. Tving værdier stiger gradvist med tilbagetrækning hastighed og varierer mellem 20,8 ± 0,7 pN og 47,4 ± 1,9 pN for RT112 celler, mellem 27,1 ± 1,1 pN og 52,4 ± 2,0 pN for T24 celler, og mellem 31,6 ± 1,0 pN og 65,8 ± 1,6 pN for J82 celler. For de tre kræftceller, den gennemsnitlige brud kraft versus logaritmen til tilbagetrækning hastighed stiger, men ikke er lineær.

Forholdet mellem brud kraft og tilbagetrækning hastighed efter 10s-kontakt mellem en TC og en EF om en HUVEC monolag. Tre cancer cellelinjer: T24 (fuld cirkel), J82 (fuld firkant) og RT112 (fuld trekant) interagere med endotel. Data er plottet som gennemsnit ± standardfejl af gennemsnittet. Linjen er blot en vejledning for øjet.

Måling af specifikke og uspecifikke vedhæftning kræfter til kræftceller

I en tidligere undersøgelse, viste vi, at ICAM-1 var involveret i TC ekstravasation [4]. For at teste den specifikke adhæsion mellem cancerceller og ICAM-1-molekyler, udførte vi kraft spektroskopi eksperimenter mellem en cancercelle fastgjort til spidsen af ​​en AFM cantilever og immobiliserede ICAM-1-molekyler på en glasskål. Som vist i figur 5, disse målinger viser, at brud kræfter er meget tæt på dem, der allerede er opnået for cancercelle-EF interaktion [28]. Værdierne er i intervallet [20-70pN] for en tilbagetrækning hastighed mellem 0,5 um /s og 20 um /s. Kan sammenligne disse værdier til de ikke specifikke adhæsionskræfter målte vi også Bruddet kræfter mellem TC’er og en BSA-overtrukket overflade. Kraften niveau involveret i ikke-specifik adhæsion er i området af [10-45pN], som er langt mindre vigtig, omkring 40% til 70% af den specifikke binding kraft.

Rupture kraft vs. tilbagetrækning hastighed for T24-celler interagerer enten med et overtrukket substrat eller med EC’er (cirkel). Substratet er belagt med BSA 100 pg /ml (firkant) eller rekombinant ICAM-1 25 pg /ml (diamant). Data er plottet som gennemsnit ± standardfejl af gennemsnittet. Linjen er blot en vejledning for øjet.

rolle ICAM-1-receptor

Som vist ved konfokal mikroskopi imaging (figur 6A), ekspressionen af ​​ICAM-1 på ustimuleret EC’er er moderat. FACS-analyse (figur 6B) bekræfter den ICAM-1-ekspression niveau, når man sammenligner fluorescens niveauer af celler behandlet med et irrelevant antistof og med anti-ICAM-1-antistof. For at bestemme det relative bidrag fra ICAM-1-receptor på celle-celle-adhæsion, undersøgte vi ændringen af ​​de adhæsionskræfter når blokering denne receptor med et specifikt monoklonalt antistof. Figur 7 viser virkningen af ​​antistof mod ICAM-1 under adhæsionen af ​​de tre cancer celletyper med ECS. Interessant, inhibering af EF ICAM-1 resulterede i et signifikant fald af ruptur kræfter for kun de mere invasive celler. For T24 celler, kraft gennemsnit varierede mellem 27,1 pN og 52,4 PN (med forskellige hastigheder) uden at blokere ICAM-1-receptoren, men mellem 14,4 pN og 35,7 PN, når blokering ICAM-1 (figur 7A). Denne effekt er også klart synlig på box-knurhår-plot opnået ved en tilbagetrækning hastighed på 5 um /s (figur 7 B). Den anti-ICAM-1-antistof inducerer et signifikant fald af brud kraft for T24 (fra 34pN til 21,8 PN, se figur 7B), og værdien af ​​21,8 PN (+/- 0,7) opnået efter brug af antistoffet er sammenlignelig med den brud force værdi 23.3pN (+/- 1,6) opnået for T24-BSA vedhæftning (se figur 7G). Derfor, efter inhibering af ICAM-1, brud force niveau er typisk for en ikke-specifik adhæsion. Denne inhibering synes at være praktisk taget fuldstændig for T24-celler. For J82 celler, kraft gennemsnit varierer mellem 31,6 pN og 65,8 pN uden at blokere ICAM-1 og mellem 17,7 pN og 58,1 pN når blokere ICAM-1. Denne virkning af anti-ICAM-1 er klart synlig i kassen-whisker plot af figur 7D: middelværdien falder fra 44,2 pN til 30,4 pN ved en tilbagetrækning hastighed på 5 um /s. Endelig er vedhæftningen af ​​RT112 celler til ECS ikke faldt i tilstedeværelse af anti-ICAM-1 antistof: middelværdierne varierer mellem 20,8 pN og 47,4 pN mens de er mellem 21,1 pN og 58,6 pN når blokere ICAM-1. Denne ikke-signifikant effekt af anti-ICAM-1-antistof bekræftes af de box-whisker plots (figur 7F): antistoffet ikke inducerer en formindskelse af det brud kraft. Derfor har en vigtig reduktion i bindende kræfter for invasive celler (fx 35% for J82 og T24 celler) kvantificeret her uanset hastighed, mens der ikke er nogen ændring i tilfældet med den mindre invasive RT112 celle. Dette viser tydeligt, at ICAM-1 udtrykt af EC’er spiller en afgørende rolle på den faste vedhæftning af de mere invasive celler (J82 og T24).

A) Konfokal mikroskopi billede af en EF-monolag farvet for ICAM-1 ( grøn). HUVEC’er blev fikseret med PFA. Kerner farves i blåt hjælp DAPI. B) Kvantificering af ICAM-1 niveauer ved FACS-analyse (stiplet linie) i sammenligning med et irrelevant antistof (fuldt optrukket linie).

Brud kraft vs. tilbagetrækning hastighed efter samspil mellem kræft celle og en EF, behandlet med et anti ICAM-1-antistof eller ej. Tilsvarende box-knurhår plots viser ruptur kræfter ved en tilbagetrækning hastighed på 5 m /s. (A, B) T24-EF, (C, D) J82-EF og (E, F) RT112-EF. Til sammenligning er brud kraft boxplot også vist for T24-BSA interaktion (panel G). Til paneler A, C og E, og den er blot en vejledning for øjet. Data er plottet som gennemsnit ± standardfejl af gennemsnittet. Stjerner repræsenterer p-værdi fra GLMM statistiske test mellem parametre beregnet på ubehandlet og anti-ICAM-1-behandlede celler (* p ≤ 0,05).

Detaljeret analyse af ruptur kræfter

da vi brugte gennemsnitsværdier for brud kræfter, som kan skjule kompleksiteten af ​​de selvklæbende obligationer, blev en mere detaljeret inspektion af kraften hopper (som vist ved hjælp af histogrammer) udføres for at få mere information. Denne analyse er givet i figur 8, hvor TC-EC’er eller TC-substrat (ICAM-1 eller BSA) force spring registreres og præsenteres ved hjælp af histogrammer, ved en given hastighed på 5 um /s. Inspektion af histogrammet af T24-EC’er ruptur kræfter i figur 8A (uden virkningen af ​​anti-ICAM-1) afslører en Gauss-fordeling centreret ved 32,9 PN (+/- 5.8). Interessant denne fordeling af kræfter fundet til T24-EF-interaktion er meget lig den, der opnås under interaktionen mellem T24 og ICAM-1 overtrukne-substrat (dvs. middelværdi = 28,8 pN +/- 5.1) (se histogram i figur 8D ). På den anden side, når EC’er er blevet behandlet med anti-ICAM-1-antistof, toppen i figur 8A næsten forsvinder (arealet under kurven divideres med en faktor ti). En ny top centreret ved 19 pN vises, svarende til værdien af ​​21,5 pN fundet til T24 interagere med BSA-coatede overflade (figur 8E), som kan henføres til ikke-specifikke interaktioner.

Virkning af en anti -ICAM-1 antistof på kræft-EF interaktioner. Ruptur kraft distributioner er gaussisk med en eller to toppe afslører tilstedeværelsen af ​​receptor /ligand bindinger eller ikke specifikke interaktioner. Probability histogrammer af ruptur kraft (V = 5 um /s) for (A) T24-HUVEC, (B) J82-HUVEC, (C) RT112-HUVEC. Sorte histogrammer repræsenterer interaktion kræft-celle og EF uden antistof mens røde viser kraft fordeling efter brug af antistoffet. Paneler D (T24-ICAM-1) og E (T24-BSA) viser brud kraft sandsynligheder for T24-celler i kontakt med overtrukne substrater. Antallet N af hændelser er angivet på histogrammer

histogram af J82-EF ruptur kræfter afslører en fordeling af en dobbelt Gaussisk fordeling:. Der er to toppe i første omgang (42 pn og 70 pn) som kan ses af det store spektrum af kraftværdier. Efter inkubation med antistoffet, den sidste top (70 pn) fuldstændigt forsvinder henviser den første (42 pn) sænkes med en faktor 3 (figur 8B). Vi kan konkludere, at ICAM-1 forventes at interagere med to ligander på J82 celleoverfladen, og at antistoffet inhiberer begge interaktioner, men fortrinsvis én. Disse obligationer kan være specifikke interaktioner med to forskellige ligander for eksempel. Desuden (figur 8B), vises en ny lavere top, når du bruger antistof (≈28pN), hvis værdi er meget tæt på den, der findes for ikke-specifikke bindinger.

Sagen om RT112 celle er anderledes, som det kan ses i figur 8C. Der er kun én top med og uden antistof placeret på lignende niveauer (28 pN og 33 PN, ingen signifikant forskel). Tilsætning af anti-ICAM-1 antistof ændrer ikke den overordnede kurve, derfor detekteres nogen klar effekt for RT112 celler, hvilket indikerer, at ICAM-1 sandsynligvis er ikke involveret i denne vedhæftning proces.

Analyse af ICAM 1 ligander (CD43 og MUC1) udtryk ved invasive celler T24 og J82

Blære kræftceller udtrykker ikke de fælles ICAM-1-ligander, såsom LFA-1 eller Mac-1 [5]. På den anden side, blev ekspressionen af ​​MUC1 (mucin 1) og CD43 (Leukosialin) for nylig beskrevet som ICAM-1-ligander [31], [10], [9], [32]. Derfor kvantificeret vi deres udtryk ved flowcytometri. Resultaterne i figur 9 viser, at T24-celler kun udtrykker CD43 ligand mens J82 celler udtrykker både CD 43 og MUC1 ligander. Med hensyn RT112 celler, de udtrykker kun CD43 ligand.