PLoS ONE: matrixmetalloproteinase-8 medierer Ugunstige systemiske virkninger af Local Bestråling på farmakokinetik Anti-Cancer Drug 5-Fluorouracil

Abstrakt

Samtidig chemoradiation med 5-fluorouracil (5-FU) er almindeligt accepteret til kræftbehandling. Men samspillet mellem stråling og 5-FU er fortsat uklare. Her har vi vurderet indflydelse lokal bestråling på farmakokinetikken af ​​5-FU i rotter. Den fælles-fraktionen stråling blev leveret til hele bækken områder Sprague-Dawley rotter efter edb tomografi-baserede planlægning. 5-FU på 100 mg /kg blev ordineret 24 timer efter stråling. En HØJTRYKSVÆSKEKROMATOGRAFI system blev anvendt til at måle 5-FU i blodet. Matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) -hæmmer jeg blev administreret for at undersøge, hvorvidt RT modulation af 5-FU farmakokinetiske parametre kunne blive blokeret. Sammenlignet med sham-bestrålede kontroller, hele bækken bestråling reducerede arealet under koncentration mod tid (AUC) af 5-FU i plasma og i modsætning hertil steg i galde med strålingsdosis-afhængig måde. Baseret på protein array analyse, mængden af ​​plasma MMP-8 blev forøget med hele bækken bestråling (2,8 gange ved 0,5 Gy og 5,3 gange ved 2 Gy) i sammenligning med kontroller. Forbehandling med MMP-8 inhibitor tilbageføres virkningen af ​​bestråling på AUC for 5-FU i plasmaet. Vores resultater først viser, at lokal bestråling modulere de systemiske farmakokinetik af 5-FU gennem at stimulere frigivelsen af ​​MMP-8. Farmakokinetikken af ​​5-FU ved samtidig chemoradiaiton behandling bør kontrolleres igen, og den optimale 5-FU-dosis bør reevalueres og om nødvendigt justeres, under CCRT

Henvisning:. Hsieh CH, Liu CY, Hsieh YJ, Tai HC, Wang LY, Tsai TH, et al. (2011) matrixmetalloproteinase-8 medierer Unfavorable systemiske virkninger af Local Bestråling på farmakokinetik Anti-Cancer Drug 5-fluorouracil. PLoS ONE 6 (6): e21000. doi: 10,1371 /journal.pone.0021000

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: December 26, 2010; Accepteret: 18. maj 2011; Udgivet: 9 juni 2011

Copyright: © 2011 Hsieh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

strålebehandling (RT) anvendes som et effektivt. lokal behandling modalitet til inhibering af celleproliferation, inducere celledød og undertrykke tumorvækst [1]. For at forbedre resultatet behandling, både hvad angår locoregional kontrol og overlevelse, samtidig brug af kemoterapi under strålebehandling (CCRT) er nu standard behandling af forskellige maligniteter, især lokalt fremskredne kræftformer. Blandt de lægemidler, der anvendes til at forbedre RT virkning, 5-fluorouracil (5-FU) er et af de mest almindeligt anvendte kemoterapeutiske midler af CCRT [2], [3], [4], [5].

Før i tiden blev RT udelukkende anvendes som en lokal behandling og dens virkning blev estimeret lokal virkning model [6] ved. voksende beviser viser dog, at bestråling har direkte DNA-skader-afhængige effekter samt sende signaler til de omkringliggende celler. Reaktionerne af ikke-bestrålede celler reagerer på signalerne fra nærliggende bestrålede celler betegnes den tilskuer-virkning [7], [8]. Desuden er længere rækkevidde virkning indtræder inden for eller mellem væv også rapporteret og kaldes abscopal, out-of-feltet eller fjerne tilskuer reaktioner [9]. Adskillige molekyler spiller roller i tilskuer signalering, der involverer stressreaktioner og celle-celle signalering, men ingen af ​​dem er specifik for stråling. Adskillige undersøgelser viser ændringerne af plasma stof niveauer reagerer på stråling, såsom interleukin 6 (IL-6) [10], IL-8 [11], transformerende vækstfaktor-beta 1 (TGF-β1) [12], tumor nekrose faktor α (TNF-α) [13], reaktive oxygenarter [14] og reaktive nitrogenforbindelser [15]. Alligevel er der ikke stærke beviser for årsagssammenhænge af disse molekyler forudsat. For nylig, vi rapporterede, at abdominal bestråling i væsentlig grad kan modulere de systemiske farmakokinetik af 5-FU på 0,5 Gy, off-målområdet i klinisk praksis, og ved 2 Gy, den daglige dosis behandling for target behandling i en eksperimentel rottemodel [16]. Derudover resultaterne fra en klinisk undersøgelse viste, at kolorektal cancer patienter med lavere AUC for 5-FU under adjuverende kemoterapi havde lavere sygdomsfri overlevelse [17]. Tilsammen disse linjer beviser støtter vigtigheden og nødvendigheden af ​​at søge efter mæglerne er ansvarlige for den uventede effekt af lokal RT på systemiske farmakokinetik kemoterapeutiske midler, såsom 5-FU. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi mulige opløselige mediatorer involveret i virkningen af ​​lokaliserede hele bækken RT, med lever sparing, på farmakokinetikken af ​​5-FU hos rotter.

Resultater

Plasma farmakokinetiske parametre af 5-FU og hele bækken bestråling

for at kontrollere, at den lokale RT moduleret de systemiske farmakokinetik af 5-FU, vi etableret en eksperimentel model ved hjælp af CT-baseret planlægning og bækken bestråling i rotter, og integreret det i en farmakokinetisk analysesystem. Interessant nok fandt vi, at bækken bestråling markant reduceret AUC for 5-FU i rotter ved 17,6% ved 0,5 Gy (

P

= 0,019) og 21,5% ved 2 Gy (

P

= 0,008 ) (fig. 1A). Af særlig interesse, strålingen ved 2 Gy til rotten hele bækkenet simuleret den daglige behandlingsdosis til et menneske, mens den lavdosisstråling (0,5 Gy) Simuleret dosis deponeres i den generøse, off-målområdet i klinisk praksis. Som vist i tabel 1, bækken bestråling faldt betydeligt mean residence time (MRT), og i modsætning hertil forøgede clearance værdi af 5-FU, når sammenlignet med ikke-bestrålede kontroller. Der var ingen signifikant forskel i værdierne af halveringstid (T

1/2), maksimal observerede plasmakoncentration (Cmax) eller fordelingsvolumen ved steady state (Vss) inden for de undersøgte grupper.

den tværgående akse illustrerer tiden i minutter og den vertikale akse repræsenterer koncentrationen af ​​5-FU. (A) plasma. (B) Bile. Hver gruppe data blev indsamlet fra seks rotter.

Bile farmakokinetiske parametre for 5-FU og hele bækken bestråling

Vi fandt, at bækken bestråling markant øgede AUC af 5- FU i galden hos rotter ved 25,1% ved 0,5 Gy og 30,6% ved 2 Gy (fig. 1B). Pelvic bestråling faldt betydeligt Cmax og clearance værdi, og i modsætning hertil steg MRT og Vss af 5-FU, når sammenlignet med ikke-bestrålede kontroller. Af interesse, 2-Gy bestråling reducerede Cmax, og i modsætning hertil steg MRT (

P

= 0,008) og Vss (

P

= 0,015) 5-FU i et omfang større end af 0,5-Gy gruppe. Der var ingen statistisk signifikant forskel mellem de 0,5-Gy og kontrolgrupper for Cmax og Vss. Desuden ingen signifikant forskel i T

1/2 blev bemærket blandt de tre grupper (tabel 2).

Nedsat funktion efter RT eller 5-FU behandling

serum koncentrationer af alaninaminotransferase (ALAT) -niveauer var ingen signifikant forskel mellem de 5-FU-behandlede, 2Gy-behandlede, 0,5 Gy efterfulgt af 5-FU-behandlede og 2 Gy efterfulgt af 5-FU-behandlede og kontrolgrupper (fig. 2 ).

De serumkoncentrationer af alaninaminotransferase (ALAT) var ikke signifikant forskellig mellem alle testede grupper. N = 5 for hver gruppe.

De cytokiner reagerer på RT eller 5-FU i plasmaet

I forhold til kontrolgruppen, var der ingen signifikante forskelle mellem RT 2Gy alene , 5-FU alene, RT 0.5 Gy efterfulgt af 5-FU og RT 2 Gy efterfulgt af 5-FU-gruppen i niveauerne af transformerende vækstfaktor-beta 1 (TGF-β1) og tumornekrosefaktor α (TNF-α) ( fig. 3A og 3B).

(A) niveauet for transformerende vækstfaktor beta 1 (TGF-β1) i plasma. (B) størrelsen af ​​tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) i plasma. Hver gruppe data blev indsamlet fra fem rotter.

Ændring af opløselige faktorer i plasma som følge af hele bækken bestråling

For at vurdere ændringer i profil af opløselige faktorer involveret med hele bækken bestråling, Rotteplasmaprøverne blev opsamlet og udsat for en cytokin-antistof-array-assay (fig. 4). Sammenlignet med kontrol (ubehandlede) gruppe (fig. 4A) og 5-FU alene gruppen (fig. 4C), omfattede de observerbare dosisafhængige ændringer i plasmaniveauerne af opløselige faktorer matrixmetalloproteinase-8 (MMP-8), monocyt-kemoattraktant protein 1 (MCP-1), cytokin-induceret neutrofil-kemoattraktant -1 (CINC-1) og vævsinhibitor af metalloproteinase-1 (TIMP-1). Blandt disse faktorer, alene stigningen i MMP-8 niveau var konsistent i tredobbelte eksperimenter. Sammenlignet med kontrolgrupper, RT 2Gy alene kunne forøge ekspressionen af ​​MMP-8 med faktorer på 3,8 (fig. 4B). Sammenlignet med 5-FU alene gruppen, plasmaniveauerne af MMP-8 steg i både RT 0.5 Gy efterfulgt af 5-FU (fig. 4D) og RT 2 Gy efterfulgt af 5-FU-grupper (fig. 4E) i en dosisafhængig måde med faktorer på 2,8 og 5,3, henholdsvis.

mængden af ​​matrixmetalloproteinase-8 (MMP-8) steg i 0,5-Gy og 2-Gy bestrålede grupper sammenlignet med kontrolgruppen. Et kort over placeringen af ​​cytokin antistoffer plettet på proteinchippen vises på op side af fig. Stiplede firkanter angiver placeringen af ​​MMP-8. Hvert cytokin er repræsenteret ved dublerede pletter i de steder, der er vist. Cytokin antistof-arrays til påvisning af (A) ubehandlede kontrolgruppe, (B) hele bækken-bestråling (RT) med 2 Gy kun, (C) 5-fluorouracil (5-FU) alene, (D) RT med 0,5 Gy efterfulgt af 5- FU og (E) RT med 2 Gy efterfulgt af 5-FU. Det cytokin vifte billedet repræsenterer resultaterne af en af ​​tre uafhængige forsøg, der viser lignende mønstre af udtryk.

Intracellulær 5-FU-niveauer med eller uden rekombinant MMP-8 ved højtryksvæskekromatografi

Vi undersøgte rollen af ​​rekombinant MMP-8 på intracellulære koncentration af 5-FU i HepG2 (human lever tumorafledte celler med biokemiske profiler karakteristiske for normale hepatocytter) uden at modtage stråling. Der var ingen signifikant effekt på AUC af 5-FU mellem det rekombinante MMP-8 plus 5-FU og 5-FU alene grupper (fig. 5). Vi fandt, at rekombinant MMP-8, ikke induceret af bestråling, vil ikke påvirke intracellulær koncentration af 5-FU i leverceller, efterligner en farmakokinetisk ændringer på celleniveau.

Modulation af 5-FU farmakokinetisk af bestråling blev vendt ved MMP-8 inhibitor

Vi undersøgte dernæst betydningen af ​​MMP-8 på virkningen af ​​RT på 5-FU farmakokinetik under anvendelse af et MMP-8 inhibitor. Hverken MMP-8 inhibitor alene eller dens køretøj haft en betydelig indvirkning på AUC af 5-FU i sammenligning med kontrollerne (fig. 6). Vi fandt, at forbehandling med MMP-8 inhibitor betydeligt svækkede faldet i AUC for 5-FU forårsaget af strålebehandling af bækkenet (AUC

bestråling versus AUC

MMP-8 inhibitor + bestråling var 3305 versus 3963 min ug /ml,

P

0,05). Desuden blev det nedsat MRT og øget clearance værdi forårsaget af bestråling helt vendes ved anvendelse af MMP-8 inhibitor (tabel 3).

Arealet under plasmakoncentration versus tid-kurven (AUC) af 5-FU 100 mg /kg administreret til rotter i kontrolgruppen uden opløsningsmiddel, kontrolgruppe med opløsningsmiddel, hel bækken 2-Gy bestråling med opløsningsmiddel og hele bækken 2-Gy bestråling med opløsningsmiddel og MMP-8 inhibitor. Den tværgående akse illustrerer tiden i minutter og den vertikale akse repræsenterer koncentrationen af ​​5-FU i plasmaet. Hver gruppe data blev indsamlet fra fire rotter.

Diskussion

Efter bevis for konceptet, at lokale RT påvirkede systemiske farmakokinetik kemoterapeutika hjælp 5-FU som model, vi næste screenet for mulige opløselige faktorer, der er ansvarlige for denne effekt, der blev identificeret som MMP-8. MMP-8, også kendt som collagenase-2 eller neutrofil collagenase, er et medlem af zink-afhængige interstitiel collagenase undergruppe af MMP familien af ​​neutrale proteinaser [18]. Vi viste, at MMP-8 besad uventet bioaktivitet i modulering farmakokinetik af 5-FU.

Polymorfonukleære neutrofiler (PMN’er) er den vigtigste kilde til MMP-8 hos mennesker og mus [19], [20]. MMP-8 er lagret i granuler af PMN’er og frigives ved degranulering [21]. Fisher

et al

. [22] rapporterede, at MMP-8 proteinniveauer i human hud blev forøget ca. 4 gange inden for 8 timer og forblev forhøjede i 24 timer efter ultraviolet bestråling. Strålebehandling ved tumorbærende sites inducerer inflammation i det bestrålede område og rekrutterer T-lymfocytter, neutrofiler, lymfocytter, makrofager, plasmaceller og dendritiske celler [18], [23], [24]. Derudover bestråling inducerer opregulering af generne af de vigtigste proinflammatoriske chemokiner [25]. I den foreliggende undersøgelse, vi bestrålede hele bækken rotter, som kunne have leveret en strålingsdosis cirkulerende neutrofiler, væv og knoglemarv makrofager og inden bækkenet. Kollektivt, rejser dette muligheden for, at bækken bestråling kunne stimulere neutrofiler og /eller de andre inflammatoriske celler ontogeni, fremkalde inflammatorisk stress, og forbedre udskillelsen af ​​MMP-8 (fig. 4) samt forskellige andre proinflammatoriske mediatorer. Derudover viser flere undersøgelser ændringerne af plasma stof niveauer reagerer på stråling, såsom TGF-β1 [12] og TNF-α [13]. Desuden kan TGF-β være et mål for 5-FU via c-Jun NH2-terminal kinase /aktivator-protein-1-aktivering i humane fibroblaster [26]. Desuden TNF-α involverer i reguleringen af ​​fluoropyrimidinbaseret aktiverende enzymer, uridinphosphorylase (UPase), der inducerer UPase genekspression med deraf følgende forbedring af 5-FU antiproliferativ aktivitet [27]. Men i den aktuelle undersøgelse, niveauerne af TGF-β1 og TNF-α er ikke steget i RT alene, 5-FU alene eller RT, efterfulgt af 5-FU-grupper sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 3A og 3B). Disse data antyder, at MMP-8 synes at spille en vigtig rolle i den lokale RT-induceret modulering af systemiske 5-FU farmakokinetik men ikke gennem disse cytokiner.

Harty MW et al. [28] rapporterede, at polymorphonuklear celleafledt MMP8 spiller en vigtig rolle for leveren reparation i deres reversibel galdevejsobstruktion model. Den aktuelle undersøgelse viser, at anvendelsen af ​​bækken RT eller 5-FU ikke ville forårsage skader af leverfunktionen. Således ville responsen af ​​MMP-8 induceret af RT i RT-PK fænomener ikke være processen af ​​inflammatorisk infiltration til leveren såsom alvorlig skade forårsaget af biliær obstruktion. Desuden er der ingen forskelle i levedygtighed (data ikke vist) og intracellulær 5-FU-niveauer (fig. 5) for 5-FU-behandlede HepG2 med eller uden rekombinant MMP-8. HepG2-celler opretholder mange af de morfologiske og biokemiske karakteristika for normale hepatocytter, såsom sekretion af de fleste plasmaproteiner forventes af leverceller, herunder apolipoprotein B [29]. Resultatet antyder, at rekombinant MMP-8, ikke induceret af bestråling, vil ikke påvirke PK’erne af 5-FU i leverceller og har ingen signifikant toksicitet for menneskers hepatoblastoma-afledt cellelinje, HepG2. Tilsammen kan MMP-8 ikke modulere leverfunktionen.

Et andet vigtigt spørgsmål er lignende, men mindre, effekt af lavdosis RT på 5-FU farmakokinetik (fig. 1). Krop fordeling af lavdosis RT (0,5 Gy, for eksempel) i klinisk praksis bliver meget generøs med avancerede strålebehandling teknikker og fremgangsmåder, såsom intensitet-moduleret strålebehandling, spiralformet tomotherapy, hurtig bue strålebehandling, volumetrisk moduleret bue terapi og andre, i forhold med konventionel RT. Mens accepterer fordelene ved at målrette tumorer og skåne de kritiske organer ved hjælp af disse avancerede teknikker [30], [31], at man forbliver forsigtig den generøse, lavdosis bestråling kunne producere uventede eller uønskede biologiske virkninger. Klinisk vi tidligere observeret, at lav-dosis, off-target stråling leveret af højt konform tomotherapy kan forårsage alvorlig toksicitet til de kritiske organer omkring de mål, såsom lunger, og forårsage stråling pneumonitis [32]. Men det medicinske samfund ikke har nogen samlet forståelse om de biologiske virkninger af generøs, lavdosis RT. Vi håber, at denne undersøgelse vil øge vores viden om disse effekter og give en eksperimentel model til at forstå de biologiske virkninger af generøs, lavdosis RT i en tid med meget konform RT.

Omkring 80% af 5-FU er catabolyzed af leveren via dihydropyrimidindehydrogenase (DPD) pathway at generere toksisk 5-fluor-5,6-dihydro-uracil, hvorimod anabolske pathway via orotat phosphoribosyltransferase, producerer aktive metabolitter herunder 5-fluoruridin-5′-monophosphat, 5-fluoruridin, og 5-fluor-2′-deoxyuridin [33], [34]. Den samlede toksicitet var dobbelt så højt i patienter med dybe DPD mangler ( 45% af det gennemsnitlige DPD aktivitet af en kontrolpopulation) sammenlignet med patienter med moderate DPD mangler (mellem 45% og 70% af det gennemsnitlige DPD aktivitet af en kontrolpopulation), som rapporteret af Milano og medforfattere [35]. Fordi 10% til 20% af 5-FU udskilles uændret i urinen [36], for patienter med nedsat nyrefunktion, plasmakoncentrationen af ​​5-FU på nondialysis dage er signifikant højere end på dialysedage, og dette kan skyldes fjernelse af nogle faktorer fra plasma ved hæmodialyse, som hæmmer DPD aktivitet [37]. Desuden 5-FU har et relativt snævert terapeutisk indeks, en stærk korrelation er beskrevet mellem udsættelse for 5-FU og både hæmatologisk og gastrointestinal toksicitet [38]. Hvis således lever eller nyrer falder i den bestrålede volumen, [16] DPD, et hastighedsbegrænsende trin i katabolismen af ​​5-FU [39], kan blive påvirket af stråling skade på lever eller nyrer. Men i den aktuelle undersøgelse, er lever og nyrer udelukket fra hele bækken bestråling felt (fig. 7). Desuden ALAT værdierne var ikke signifikant forskellig mellem kontrol-, 5-FU-behandlede eller bækken RT grupper med eller uden 5-FU. (Fig. 2) således effekten af ​​RT på AUC af 5-FU bemærkede i denne undersøgelse, kan ikke være forårsaget af direkte modulation af leverfunktionen ved RT eller 5-FU.

kraniel margen blev fastsat til toppen af ​​bilaterale hoftebenskammen for hele bækken område. Konventionel strålebehandling blev anvendt til at levere strålingsdosis via anterior-posterior (AP) og PA portaler.

Sammenlignet med kontrolgruppen, hele bækken bestråling faldt AUC for 5-FU i plasmaet til en statistisk signifikant niveau (fig. 1A). I modsætning hertil bestråling forhøjede AUC for 5-FU i galden signifikant (fig. 1B). Den blev ledsaget af en reduktion i MRT og forøgelse af clearance værdi i plasma, men en stigning i MRT og reduktion af clearance værdi i galden. Med hensyn til farmakokinetik, dette tyder på, at bækken bestråling kunne lette udskillelse af 5-FU.

Da samtidig brug af kemoterapeutika i kombination med lokaliseret konform RT forbedrer kliniske resultater behandling for et stigende antal af maligniteter [2 ], [3], [4], [5], vores resultater viser, at både lokaliseret mål-in og generøse mål-off bestråling kan påvirke 5-FU farmakokinetik, og giver en grund til at overveje en tilpasning af kemoterapeutiske administration under RT kursus. Effekten af ​​lokaliserede RT på systemiske farmakokinetik kemoterapeutiske midler eller andre lægemidler klart behov for yderligere klinisk evaluering.

Materialer og metoder

Materialer og reagenser

5-FU og højtydende væskekromatografi (HPLC) -Grade methanol blev indkøbt fra Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA) og Tedia Company, Inc. (Fairfield, OH, USA), hhv. Milli-Q kvalitet vand (Millipore, Bedford, MA, USA) blev anvendt til fremstilling af løsninger og mobile faser.

Dyr og prøve forberedelse

Voksne, Sprague-Dawley rotter (300 ± 20 g kropsvægt) blev leveret af Laboratory Animal center på National Yang-Ming University (Taipei, Taiwan). De blev anbragt i en SPF-frit miljø og havde fri adgang til mad (Laboratory Rodent Diet 5001, PMI Nutrition International, LLC, MO, USA) og vand. Alle kirurgi procedurer forsøgsdyr blev gennemgået og godkendt af dyreetik udvalg Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwan (MMH-AS-98011).

Rotterne blev bedøvet med urethan 1 g /ml og α-chloralose 0,1 g /ml (1 ml /kg ved intraperitoneal injektion) og blev immobiliseret på et bræt, når der foretages computertomografi til simulering af hele pelvic område. Den kraniel margen blev fastsat til i toppen af ​​de bilaterale iliaca Kamme til hele bækken felt (fig. 7). Konventionel strålebehandling blev anvendt til at levere strålingsdosis via anterior-posterior (AP) og PA portaler. Forsøgsdyrene blev randomiseret til kontrolgruppen, 2-Gy alene, 5-FU alene, 0,5-Gy efterfulgt af 5-FU, og 2-Gy efterfulgt af 5-FU-grupper. Hver gruppe data blev indsamlet fra seks rotter.

allometrisk skalering af strålingsdoser (0,5 og 2 Gy) mellem mennesker og rotter, henholdsvis var en vigtig overvejelse i undersøgelsen. Årsagen til anvendelsen af ​​0,5 og 2 Gy for rotterne var at simulere den relevante dosisområde for daglig behandling af det menneskelige torso, for sikkerhed og bearbejdelighed, som tidligere rapporteret [16]. Kort fortalt, var der ingen direkte sammenligning af allometrisk skalering hjælp hele strålebehandling af bækkenet. Ikke desto mindre, den allometrisk skalering af den dødelige dosis (LD50) (Gy) af total-krop bestråling for mennesker og rotter er 4 Gy og 6,75 Gy henholdsvis [40]. I betragtning af, at denne forskel er moderat, besluttede vi at bruge 0,5 og 2 Gy for rotter for at simulere den relevante dosisområde for daglig behandling af den menneskelige torso.

Ambre

et al

. [41] studerede eliminering af 5-FU og dets metabolitter efter intravenøs administration af 5-FU ved 15 og 150 mg /kg til rotter. Resultaterne af denne undersøgelse antydede, at mætning af kataboliske pathway skete efter den højere dosis. Jarugula

et al

. [42] vist, at dosis-normaliseret område under kurven (AUC) var signifikant højere efter administration af 100 mg /kg (middelværdi ± standardafvigelse, SD, 1,14 ± 0,55 mg · h /L /mg) end efter 50 mg /kg (middel ± SD, 0,50 ± 0,16 mg · h /L /mg) eller 10 mg /kg (middel ± SD, 0,43 ± 0,11 mg · h /L /mg). Således valgte vi 100 mg /kg som en gennemførlig 5-FU-dosis i rotter til undersøgelse af 5-FU farmakokinetiske parametre, baseret på tidligere rapporter [16], [41], [42].

Tyve timer efter RT blev rotterne administreret 100 mg /kg af 5-FU i 2 ml normalt saltvand ved intravenøs infusion i den femorale vene over en 2-minutters periode [42]. En prøve 150-pi blod blev udtaget fra halsvenen med en fraktionsopsamler overensstemmelse med en programmeret tidsplan ved 5, 15, 30, 45 og 60 minutter og 1,5, 2, 2,5 og 3 timer efter lægemiddelindgivelse. Blodprøverne blev straks centrifugeret ved 3300 ×

g

i 10 min. Den resulterende plasma (50 pi) sattes til 1 ml ethylacetat i et rent rør, hvirvlet i 5 min, og centrifugeret ved 5900 x

g

i 10 min. Efter centrifugering blev den øvre organiske fase indeholdende ethylacetat overført til et nyt rør og inddampet til tørhed under strømmende nitrogen. Den tørrede rest blev genfortyndet med 50 pi Milli-Q-vand (Millipore). En 20-pi aliquot af opløsningen blev injiceret i HPLC-ultraviolet (HPLC-UV) detekteringssystem.

Højtryksvæskekromatografi

Kromatografisk analyse blev udført på et model LC -20AT HPLC-system (Shimadzu, Tokyo, Japan) udstyret med et model SPD-20A bølgelængde UV-detektor, SIL-20AC autosampler og en LC Solution databehandlingssystem. En LiChroCART RP-18e-søjle (Purospher, 250 mm, 5 um, Merck, Darmstadt, Tyskland) med en LiChroCART 4-4 guard søjle blev anvendt til separation. Den mobile fase bestod 10 uM kaliumphosphat-methanol (99:1, vol /vol, pH 4,5 justeret med 85% phosphorsyre), og strømningshastigheden af ​​den mobile fase var 1 ml /min. Detektionsbølgelængden blev sat til 266 nm. Under disse betingelser, retentionstiden for 5-FU var 5,4 min. Linearitet kalibreringskurver blev påvist ved de gode bestemmelse koefficienter (

r

2) opnået for regressionslinjen. God linearitet blev opnået over intervallet 0,01-5 mg /ml, med alle koefficienter af korrelation større end 0,998. Alle prøver blev frisk fremstillede, herunder faste opløsninger, fra den samme stamopløsning (5 mg /ml). Den 0,01-mg /ml kvantifikationsgrænse blev defineret den laveste koncentration på kalibreringskurven, der kunne måles rutinemæssigt med acceptabel bias og relativ SD. Det samlede gennemsnit præcision, defineret af den relative SD, varierede fra 0,2% til 11,0%. Analytisk nøjagtighed blev udtrykt som den procentuelle forskel i de gennemsnitlige observerede værdier sammenlignet med kendte koncentrationer varierende fra -10.0% til 14,0%. De nyttiggørelse resultater for koncentrationer på 0,1-10 mikrogram /ml var 92,0% -94,0%

Evaluering af leverfunktion

plasmaniveauerne af alaninaminotransferase (ALT) blev målt til at kontrollere indflydelse forskellige modaliteter for leverfunktion ved en standard kolorimetrisk metode ved hjælp af en Synchron LX20 spektrofotometer (Beckman Coulter) og producenten leverede reagenser.

Serum cytokin analyse

De plasmaniveauerne af cytokiner (transformerende vækstfaktor beta 1 (TGF-β1) og tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α)) opnået fra muse blodprøver blev analyseret under anvendelse enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) (R &. D Systems) i overensstemmelse med producentens instruktioner

Cytokine antistof-array

rotte plasmaprøver blev analyseret ved anvendelse af et cytokin-antistof-array (RayBio® Mouse Cytokine Antibody Arrays II, RayBiotech, Inc., Norcross, Ga.) ifølge producentens anvisninger og som tidligere beskrevet [43] for at opdage mulige mediatorer af 5-FU-RT interaktion. Denne særlige matrix samtidigt detekterer 34 murine cytokiner. (Fig. 4) Kort beskrevet cytokin array-membraner blev blokeret i 2 ml 1 × blokerende buffer i 30 minutter og derefter inkuberet med 1 ml plasmaprøve ved stuetemperatur i 1-2 timer. Prøver blev derefter dekanteret fra hver beholder, og membranerne blev vasket tre gange med 2 ml l × vaskebuffer I, efterfulgt af to vaske med 2 ml l × vaskebuffer II ved stuetemperatur med omrystning. Membraner blev derefter inkuberet i 1:250 fortyndet biotin-konjugeret primære antistoffer ved stuetemperatur i 1-2 timer og vasket som beskrevet ovenfor, før inkubering i 1:1000 fortyndet peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret streptavidin. Efter inkubation i HRP-konjugeret streptavidin i 30-60 min blev membraner vasket grundigt og udsat for en peroxidsubstrat (detektion buffere C og D, RayBiotech, Inc.) i 5 minutter i mørke før billeddannelse. Membraner blev derefter eksponeret for røntgenfilm (Kodak X-OMAT AR-film) ved stuetemperatur i 1 minut. Signalintensiteter blev analyseret med Fuji Film Multi Gauge V2.1. Biotin-konjugeret IgG tjente som en positiv kontrol ved seks pletter, hvor den blev brugt til at identificere membran orientering og til at normalisere resultaterne fra forskellige membraner, der blev sammenlignet. For hver plet blev netto optisk densitet bestemmes ved at subtrahere baggrunden optiske densitet fra den samlede rå optisk densitet og den optiske densitet af hvert cytokin blev repræsenteret som en procentdel af den positive kontrol.

Bestemmelse af intracellulær 5- FU niveauer med eller uden rekombinant MMP-8 ved højtydende væskekromatografi

for at undersøge effekten af ​​MMP-8 på normale leverceller, en human hepatoblastoma-afledt cellelinje, HepG2, blev anvendt til at simulere normale leverceller i vores yderligere eksperimenter. Efter behandling med 10 ug /ml rekombinant MMP-8 plus 50 uM 5-FU eller 50 pM 5-FU alene, HepG2 (human hepatocellulær carcinom cellelinie) celler blev opsamlet hver 10 min, indtil 60 min og vasket to gange i phosphatbufret saltvand (PBS) efterfulgt af centrifugering ved 13000 rpm i 5 min. At udtrække intracellulær 5-FU, en ekstraktionsopløsning indeholdende 0,1% Triton X-100 i dimethylsulfoxid blev tilsat til cellepelleterne, og denne suspension blev hvirvlet og centrifugeret at13000 rpm i 5 min. Den resulterende opløsning blev blandet med et tilsvarende volumen af ​​acetonitril i deproteinering. Protein- præcipitater blev fjernet ved centrifugering (13000 rpm i 5 min), og en 20 pi alikvot af supernatanten blev underkastet højydelsesvæskechromatografi analyse som nævnt før.

Mediator inhibitor forberedelse og eksperimentere

MMP-8 inhibitor i (Calbiochem, La Jolla, CA) blev administreret til rotterne til at undersøge, hvorvidt RT modulering af 5-FU farmakokinetiske parametre kunne blokeres. Kort fortalt, MMP-8 inhibitor I blev opløst i PEG400 /ethanol [04:01 (vol /vol)] opløsning, hvilket giver en slutkoncentration på 5 mg /ml. To timer før bestråling, 10 mg /kg af MMP-8 inhibitor jeg blev infunderet i rottens halevene over en 2-minutters periode. Derefter blev rotterne bedøvet med urethan 1 g /ml og α-chloralose 0,1 g /ml (1 ml /kg ved intraperitoneal injektion) og blev immobiliseret på et bræt til at undergå computertomografi til simulering af hele bækken felt og modtaget bestråling, som beskrevet tidligere. Forsøgsdyrene blev randomiseret til at styre uden PEG400 /ethanol [04:01 (vol /vol)] opløsning (0 Gy), kontrol med opløsningsmiddel (0 Gy), hel strålebehandling af bækkenet (2 Gy) med opløsningsmiddel og hele strålebehandling af bækkenet (2 Gy) med MMP-8 inhibitor og opløsningsmidler grupper hhv. Efter RT sham RT 20 timer, alle rotter modtog 5-FU (100 mg /kg) injektioner og de farmakokinetiske parametre af 5-FU blev analyseret. Hver gruppe data blev indsamlet fra fire rotter.

Farmakokinetik og dataanalyse

Farmakokinetiske parametre, herunder AUC for koncentrationen mod tiden, terminal eliminationsfase t

1/2, Cmax, MRT, totale plasmaclearance og Vss blev beregnet ved hjælp af den farmakokinetiske beregning software WinNonlin Standard Edition, Version 1.1 (Scientific Consulting, Apex, NC, USA) ved hjælp af en kompartment metode.

statistiske metoder

resultatet er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelser. Forskelle i aktuarmæssige udfald mellem grupperne blev beregnet ved hjælp af envejs variansanalyse (ANOVA), med post-hoc multiple sammenligninger. Alle analyser blev udført ved anvendelse af SPSS version 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).