PLoS ONE: Sonic Hedgehog signalvejen Understøtter Kræft cellevækst under Cancer Radiotherapy

Abstrakt

Tumor vækst efter strålebehandling er et almindeligt anerkendt årsag til terapeutisk svigt. På den måde, vi undersøgte tumorcellevækst efter strålebehandling ved at etablere en kræftcelle vækstmodel

in vitro

. Vi opnået denne model ved podning ikke-bestrålede ildflue luciferase2 og grønt fluorescerende protein fusionsgen (Fluc) mærket levende cancer reporter celler på et fødelag af bestrålede cancerceller. De levende tumorcellevækst blev overvåget ved bioluminescens billeddannelse. De levende reporter celler voksede hurtigere når podes på letalt bestrålede feeder celler end når podes på ikke-bestrålede feeder-celler eller når podet i fravær af fødeceller. Vi fandt, at ekspressionsniveauerne af de Shh og Gli1 proteiner, som begge er kritiske proteiner i Sonic hedgehog (SHH) signalering, blev forøget efter bestråling, og at denne ekspression blev positivt korreleret med reporter cellevækst. Desuden blev den døende celle stimulation af levende tumorcellevækst forøges ved tilsætning af SHH signaling agonister og inhiberet af SHH signalering antagonister. SHH agonister forbedret også reporter cellevækst i fravær af bestrålede feederceller, tyder denne mekanisme spiller en rolle i føder cellevækst-stimulering. På baggrund af disse resultater konkluderer vi, at SHH signalering aktivering spiller en vigtig rolle under tumorrepopulation efter strålebehandling

Henvisning:. Ma J, Tian L, Cheng J, Chen Z, Xu B, Wang L, et al. (2013) Sonic Hedgehog signalvejen Understøtter Kræft cellevækst under Cancer strålebehandling. PLoS ONE 8 (6): e65032. doi: 10,1371 /journal.pone.0065032

Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA

Modtaget: Februar 16, 2013; Accepteret: 20. april, 2013; Udgivet: 10 juni 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation (81120108017, 81172030) og National Basic Research Program Kina (2010CB529902) (til Q Huang og L Tian) og delvist af tilskud fra USA National Cancer Institute (CA131408, CA136748, CA155270 ) (til CY Li). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

I mange typer af kræft, tumorrepopulation efter strålebehandling opstår og udgør en stor udfordring for klinikere. I denne proces vil de få tumorceller, som overlever efter strålebehandling regrow og erstatte tabt tumorceller. Genbefolkning under fraktioneret strålebehandling er anerkendt som en vigtig årsag til fiasko og beviser behandling tyder på, at antallet af genoprettelse af bestanden kan forekomme ved en accelereret tempo i nogle tilfælde [1]. Repopulation afhænger af aktivering af signalveje, der stimulerer proliferation af tumorceller og mange molekylære målrettet midler er blevet udviklet, som inhiberer disse veje, såsom gefitinib som er rettet mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) signalering [2]. For at skabe en model til undersøgelse af tumor cellerepopulation efter strålebehandling, har mange andre forsøgt at bruge såkaldte “feeder celler”, som er blevet behandlet med stråling for at fremme væksten af ​​ubehandlede tumorceller podet i co-kultur eksperimenter. Selv om denne model ikke direkte viser repopulation af behandlede cancerceller under strålebehandling, mener vi, at de vækstfremmende signaler frigivet fra dødeligt behandlede feeder-celler replikere betingelserne i en homogent behandlet tumor. Derfor vil vi bruge begrebet genoprettelse af bestanden og døende celle stimuleret levende tumorcellevækst synonymt hele vores studie.

På trods af vores viden om, at døende feeder celler kan øge væksten af ​​levende tumorceller, den mekanisme, hvormed dette sker stadig stort set ukendt. Den soniske hedgehog (SHH) signalvejen, først identificeret i Drosophila melanogaster, er impliceret i normal organudvikling og homeostase, stamcellefaktor vedligeholdelse og proliferation hos hvirveldyr og kan derfor være en kandidat til mekanismen bag overlevende tumorcellevækst [3]. Desuden er mange cancere forbundet med SHH signalering, såsom basal-celle-carcinoma, esophageal og mavekræft, småcellet lungecancer [4] og pancreas adenocarcinom [5]. SHH-aktivering initieres ved binding af den udskilte og lipid-modificeret ligand Shh til Patched1 (Ptch1) transmembrane receptor. Som følge heraf Ptch1 inhibering af Smoothened (Smo), en 7-pass transmembranspændende protein, er lettet og SHH signaleringskaskade initieres, hvilket igen aktiverer Gli transkriptionsfaktorer [6]. Der er tre Gli proteiner, der koder for både aktivator og repressor funktion. Gli1 virker som en transkriptionel aktivator, Gli2 er sammensat af positive og negative regulatoriske domæner, og GLI3 primært virker som en transkriptionel repressor [7]. I nærvær af Shh, er Gli1 transkriptionelt aktiveret og phosphorylerede og proteolytisk forarbejdning af Gli2 og GLI3 til deres trunkerede repressor former inhiberes, hvilket fører til aktivering af specifikke SHH signalvejen målgener, såsom Gli1 og Ptch1 [8].

Da mekanismerne bag tumor accelereret repopulation under strålebehandling ikke er godt forstået, vi sigter mod at undersøge en rolle for den veletablerede SHH vej i tumorcelleproliferation efter strålebehandling proces. Det er velkendt, at stråleterapi forårsager apoptose, som kan spille en kritisk rolle i tumor cellerepopulation [9]. I vores tidligere undersøgelser, har vi vist, at døende tumorceller bruge den apoptotiske proces til at generere caspase 3 medierede vækststimulerende signaler til at stimulere genoprettelse af tumorer under radioterapi [10]. Endvidere har vi også fundet “Phoenix Rising” sti gennem hvilken executioner caspaser, såsom caspase 3 og 7, i apoptotiske celler fremme sårheling og vævsregenerering i flercellede organismer [11]. I kræft i spiserøret blev SHH signalvejen udførligt aktiveres i xenotransplantater og resterende tumorer efter kemo- og stråleterapi og blokering SHH signalering forbedret stråling cytotoksicitet [12]. Derfor kan “Phoenix Rising” sti med caspase-medieret tumorvækst stimulering og SHH signalvejen både være involveret i tumor cellerepopulation efter strålebehandling.

I denne undersøgelse undersøgte vi roller SHH signalvej i døende celle stimuleret tumorcellevækst. Vores data viser klart bevis for en rolle for Shh udskilt af døende celler i at fremme en hurtig repopulation af tumorer fra et lille antal levende tumorceller. Vi mener, at dette nyopdagede vej af Shh stimuleret tumorrepopulation spiller en central rolle i cancer strålebehandling. Desuden målrette SHH pathway kan have kliniske implikationer for forbedring af kræft strålebehandling resultater.

Materialer og metoder

Cell Culture Betingelser

Humane bugspytkirtelkræft Panc1 celler og menneskelig colon cancer HT29-celler, blev købt fra Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og dyrket i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) (Thermo, Beijing, Kina) med 10% føtalt bovint serum (FBS, Holly blade, Hangzhou, Kina), 100 E ml

-1 penicillin og 100 ug ml

-1 streptomycin ved 37 ° C i fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2.

tumorrepopulation Model

In vitro

, HT29 celler eller Panc1 celler dyrket i 10 cm petriskål blev røntgen bestrålede og fireogtyve timer senere blev de trypsiniseret og podet i plader med 24 brønde (Corning, NewYork, USA) ved en densitet på 2,5 x 10

5 celler per brønd i tre eksemplarer i DMEM indeholdende 2% FBS. Fireogtyve timer senere, Fluc mærket blev ubehandlet HT29 eller Panc1 celler podet ved en celledensitet på 1000 celler pr. Mediet blev skiftet hver 2. dag i 14 dage.

Bestråling af cancerceller Salg

røntgenbestråling af celler blev udført ved anvendelse af en Oncor lineær accelerator (Siemens, Amberg, Tyskland), der ligger i afdelingen for stråling onkologi på Shanghai Jiaotong Universitet tilknyttet First Folkets Hospital. Dosis sats for maskinen er ca. 3,6 Gy /min.

Gene transduktion i cellerne

Vi transduceret forskellige eksogene gener i målceller ved brug af lentivirus vektorer. Det mest almindeligt anvendte lentiviral vektor er pLEX systemet (Thermo Scientific Inc, Beijing, Kina), som indeholdt en puromycin-resistens gen. Gener, der blev klonet i denne vektor omfatter følgende: ildflue luciferase2 og grønt fluorescerende protein fusionsgen (Fluc) drevet af CMV-promotor, luciferasegen drives af 8 × vildtype Gli1 bindingssted eller 8 × muteret Gli1 bindingssted (dvs. vildtype Type 8 × GBS luciferasegenet eller muteret 8 × GBS luciferasegenet) samt shRNA mod Gli1. Alle lentivirale vektorer blev pakket i 293T-celler efter producentens instruktioner. De stabilt transducerede HT29 eller Panc1 celler blev opnået ved lentivirus-infektion og puromycinselektion i nærvær af 2 ug /ml puromycin i to uger.

Luciferase Assay

Luciferase Reporter Assay System E1500 (Promega , Wisconsin, USA) blev anvendt til bestemmelse ildflueluciferase aktiviteter i overensstemmelse med producentens anvisninger. HT29 og Panc1 celler, der udtrykker vildtype-8 × GBS luciferasegenet eller det muterede 8 × GBS luciferasegenet blev bestrålet med 6 Gy ioniserende stråling. Luciferaseaktiviteterne for 6 Gy bestrålede celler og ikke-bestrålede celler blev testet. Målinger blev udført med et Berthold luminometer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland), og ildflueluciferase værdier af celler, der udtrykker vildtype-luciferasegenet blev normaliseret ved ildflueluciferase værdier af celler, der udtrykker mutant luciferasegenet. Normalisering minimerer eksperimentel variabilitet. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer og derefter gentages tre gange.

Bioluminescens Imaging

Til billedet af luciferase signaler udsendt fra celler, vi brugte NC100 instrument fra Berthold Technologies (Bad Wildbad, Tyskland) placeret i School of Basic Medical Sciences, Fudan University. For Panc1 og HT29-celler, målte vi luciferase signaler ved tilsætning D-luciferin (Promega, Wisconsin, USA) i PBS i en slutkoncentration på 0,15 mg /ml. Fem minutter efter indgivelsen af ​​D-luciferin, blev billederne taget og luciferase signaler (fotoner /SEC) blev derefter bearbejdet og analyseret kvantitativt ved anvendelse af producentens medfølgende software. Billeder blev altid tages på samme tidspunkt for at minimere variabilitet. De luciferase signaler blev målt i Panc1 og HT29-celler ved 14 dages tidspunktet til at maksimere den observerede forskel mellem de ingen feeder og ubehandlede kontroller fra den bestrålede feeder forsøgsgruppen.

Antistoffer og Key Kemikalier anvendt i denne undersøgelse

Kommercielt tilgængelige antistoffer mod Shh, Gli1, β-actin, GAPDH (Cell Signaling Technology, Boston, USA) og sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (Bio-Rad, California, USA) blev indkøbt. SHH signalering antagonist cyclopamin og Gant61 blev begge opnået fra Sigma-Aldrich (Missouri, USA). GDC-0449 blev købt fra Selleck kemikalier (Texas, USA). SHH signalering agonist SAG blev opnået fra Enzo Life Sciences (NewYork, USA) og rekombinant mus sonisk pindsvin N-terminalen blev opnået fra R

0,05 betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført med SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultater

Reporter Cell Numbers var Lineært associeret med luciferaseaktivitet Når Imaging

For at bekræfte korrelationen af ​​luciferaseaktiviteten i billeder med reporter celletal, vi gjorde en række udvanding for Fluc mærkede tumorceller (betegnet “reporter celler”). 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500 og 10000 Panc1Fluc eller HT29Fluc tumorceller var frø i 96 brønds plader i 6 replikater dagen før billeddannelse. Billedtromlen blev udført 5 minutter efter tilsætning af D-luciferin under anvendelse af NC100 instrumentet. Fotonerne fra hver brønd blev opsamlet og efterfølgende analyseret ved to-halet ANOVA. Resultaterne indikerede, at fotoner /sek lineært var associeret med celleantal podet i brønde (fig. 1A, 1B, R

2 = 0,9967 i Panc1Fluc celler og R

2 = 0,9973 i HT29Fluc celler henholdsvis).

A. Korrelationsanalysen af ​​fotoner målt ved bioluminescens billeddannelse

vs

celletal udpladet. Fluc mærkede Panc1 celler blev udpladet i plader med 96 brønde i 6 gentagelser på det oplyste nummer dagen før Imaging. Den gennemsnitlige fotoner /sek fra 6 gentagelser på hver celleantal blev analyseret ved to-halet ANOVA (R

2 = 0,9967). Resultaterne indikerede, at intensiteten af ​​billedsignalet positivt korreleret med celletal belagt. Hvid skala søjle repræsenterer 1 cm i længde. B. Korrelation analyse af fotoner målt ved bioluminescens billeddannelse

vs

celletal i HT29-celler. Proceduren og resultat analyse var som samme som Panc1 celler nævnt ovenfor (R

2 = 0,9973). Skala søjle repræsenterer 1 cm. C. Analyse af signal intensitet Panc1Fluc celler dyrket på bestrålede Panc1 celler. 2,5 × 10

5 X-ray bestrålede Panc1 celler blev udpladet i 24-brønds plader som feeder. Doserne var 0 Gy, 2 Gy, 6 Gy, 10 Gy, 14 Gy og 20 Gy hhv. 1000 Panc1Fluc celler blev udpladet i hver brønd med eller uden fødeceller som reporter. 14 dage senere plade blev afbildet for bioluminescens intensitet. Top: Luciferaseaktivitet analyse; Nederst: repræsentativ bioluminescens billede, skala bar repræsenterer 1 cm. D. Analyse af signalintensiteten af ​​HT29Fluc celler dyrket på bestrålede HT29-celler. Proceduren og resultat analyse var som samme som Panc1 celler nævnt ovenfor. Top: Luciferaseaktivitet; Nederst:. Repræsentativ bioluminescens billede, skala søjle repræsenterer 1 cm

Bestrålet Dying Tumor Cell stimuleret Living tumorcellevækst

Vi udførte en række eksperimenter for at undersøge effekten af ​​at dø, bestrålede tumorceller ved forskellige doser på levende tumorceller. For at simulere

in vivo

scenarier, hvor det store flertal af tumorceller er dræbt af stråling eller kemoterapi, vi seedet et lille antal (10

3) i Fluc mærkede humane bugspytkirtel kræft Panc1 celler eller human colon cancer HT29 celler på en seng af et meget større antal (2,5 × 10

5) i umærkede homologus kræftceller. Sidstnævnte kræftceller betegnet “feeder celler” blev bestrålet ved 2 Gy, 6 Gy, 10 Gy, 14 Gy og 20 Gy eller ubehandlet (0 Gy) hhv. Vækst af det lille antal levende “reporter celler” blev overvåget af epi-fluorescerende mikroskopi med 3 dages mellemrum og ved bioluminescens imaging på day14 (Fig. 1C, 1D). Luciferaseaktiviteter blev brugt som surrogater for antallet af “reporter celler”, som blev bekræftet af vores lineære association eksperiment (fig. 1A, 1B). Vores resultater indikerede, at reporter-celler voksede væsentligt hurtigere når podes på døende celler end når podet alene. Desuden feeder celler bestrålet med 6 Gy viste den højeste vækstfremmende evne end andre doser gjorde, med ikke-bestrålede feederceller viser ingen støttende rolle. I tumorceller bestrålet med doser højere end 6 Gy blev vækststimulerende evne reduceres med stigende bestrålingsdosis (fig. 1C, 1D). Disse observationer var sandt for både HT29-celler og Panc1 celler.

Aktivering af SHH signalvej Korreleret Positivt med Dying Cell stimuleret Living tumorcellevækst

For at undersøge om SHH signalvej aktivering var forbundet med stimulering af tumorcellevækst ved at dø celler, vi udført Western blot eksperimenter med to cancer cellelinjer, Panc1 (fig. 2A) og HT29 (fig. 2B). Aktiveret SHH signalering blev bekræftet af proteinniveauer af Shh og Gli1 som blev kvantificeret ved at måle signalet af den 19-kD og 160-kD bånd, henholdsvis. Vi fandt, at niveauerne af Shh og Gli1 proteiner var højere i 6 Gy bestrålede cancerceller end andre doser behandlede cancerceller (fig. 2C, 2D). Endvidere i tumorceller bestrålet med doser højere end 6 Gy Shh og Gli1 proteinniveauer blev reduceret med tilvæksten af ​​strålingsdosis. Det er interessant, at udviklingen i proteinekspression niveau af SHH signalvejen udstillet den samme tendens med væksten stimulation effekt efter bestråling, som begge var højest for 6 Gy og tilspidset med stigende strålingsdosis.

A . Ekspression-profilændringer af Shh og Gli1 proteiner i Panc1 celler bestrålet i forskellige doser og påvist ved Western blot. B. Ekspression-profilændringer af Shh og Gli1 proteiner i HT29-celler bestrålet ved forskellige doser og påvist ved Western blot. C. Relativ intensitet Shh og Gli1 protein bands på Western blot i Panc1 celler bestrålet ved forskellige doser. D. Relativ intensitet Shh og Gli1 protein bands på Western blot i HT29-celler bestrålet ved forskellige doser. E. Luciferase aktivitet af Gli1 reporter i bestrålede og ikke-bestrålede Panc1 celler. ** Repræsenterer

P

0,01. F. Luciferase aktivitet af Gli1 reporter i bestrålede og ikke-bestrålede HT29-celler. ** Repræsenterer

P

. 0,01

For yderligere at bekræfte aktiveringen af ​​SHH signalvej i feeder celler blev Panc1 og HT29 kræftceller transduceret med lentivirus bærer en Wild- Type 8 × GBS luciferase reporter eller et muteret 8 × GBS luciferase reporter huser en punktmutation, der ophæver bindingen af ​​Gli1. Cellerne inficeret med lentivirus blev udvalgt med 2 ug /ml puromycin. De stabilt transducerede Panc1 og HT29-celler var ubehandlede eller bestrålet ved en dosis på 6 Gy, og derefter luciferaseaktivitet blev målt. Resultaterne antydede, at den relative luciferaseaktiviteten i 6 Gy bestrålede cancerceller var signifikant højere end i ikke-bestrålede cancerceller (

P

0,01), hvilket indikerer, at Gli1 transkriptionel faktor-aktivitet blev forøget i 6 Gy bestrålede kræft celler. De resultater, som blev observeret i begge Panc1 celler (fig. 2E) og HT29-celler (fig. 2F) var ens og i overensstemmelse med resultaterne fra bioluminence imaging vist ovenfor.

SHH Signaling antagonister Inhibit Dying Tumor Cell stimuleret Living Tumor Cell Growth

i betragtning af den markant opreguleret SHH pathway aktivitet i bestrålede celler, vi undersøgt, om manipulation af SHH vej ville hæmme eller fremme døende tumorceller stimuleret levende tumorcellevækst. Omkring 2,5 × 10

5 6 Gy bestrålede Panc1 celler blev podet i plader med 24 brønde i medium indeholdende Smo antagonist (GDC-0449) ved 0,5 uM, 1 uM, 2 uM eller vehikelkontrol henholdsvis. 1000 Fluc mærkede levende Panc1 celler podedes på den bestrålede med eller uden lægemiddel behandlede fødelag. Som vist i fig. 3A GDC-0449 reducerede Panc1 celler vækst på en dosis-afhængig måde. Sammenlignet med kontroller, der indeholdt køretøj, blev signalet i brønde, som indeholdt en uM GDC-0449 eller 2 uM GDC-0449 reduceret væsentligt (

P

0,05). Disse resultater tyder på, at GDC-0449 kunne hæmme døende tumor celle stimuleret levende tumorcellevækst.

A. GDC0449, en præklinisk SHH pathway inhibitor, inhiberer Panc1Fluc cellevækst induceret af døende Panc1 celle på en dosis-afhængig måde. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm. * Repræsenterer

P

0,05. B. Gant61 inhiberer Panc1Fluc celler vækst induceret af døende Panc1 celler på en dosisafhængig måde. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm. ** Repræsenterer

P

0,01. C. Cyclopamin inhiberer HT29Fluc cellevækst induceret af døende HT29-celler på en dosis-afhængig måde. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm. * Repræsenterer

P

0,05, ** repræsenterer

P

0,01. D. Gant61 inhiberer HT29Fluc cellevækst induceret af døende HT29-celler på en dosis-afhængig måde. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm. ** Repræsenterer

P

0,01. E. GDC0449 inhiberer HT29 Fluc cellevækst induceret af døende HT29-celler på en dosis-afhængig måde. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm.

For yderligere at bekræfte roller SHH signalering på døende tumor celle stimuleret levende tumorcellevækst testede vi en anden Gli1 antagonist (Gant61). Betingelsen var identisk med den førnævnte betingelse for GDC-0449, bortset fra at Gant61 koncentrationen var enten 5 uM, 10 uM eller 20 uM. Vi observerede en lignende reduceret vækst i Gant61 behandlede brønde sammenlignet med vehikelbehandlede kontrolbrønde (

P

0,01, figur 3B.). Men Panc1 celler behandlet med en anden Smo antagonist (cyclopamin) ikke viser en reduktion i cellevækst (data ikke vist).

Lignende forsøg blev udført i HT29-celler. Omkring 2,5 × 10

5 6 Gy bestrålede HT29-celler blev podet i plader med 24 brønde i medium med eller uden cyclopamin ved 2 uM, 5 uM eller vehikelkontrol henholdsvis hvorpå 1000 Fluc mærkede levende HT29-celler blev podet. Sammenlignet med vehikel-kontrol-behandlede gruppe, cyclopamin reduceret HT29 cellevækst på en dosis-afhængig måde (Fig. 3C). De HT29-celler dyrket i kontrol køretøj viste en signifikant større luciferaseaktivitet end de celler dyrket i 2 uM cyclopamin (

P

0,05) og 5 uM cyclopamin (

P

0,01).

Vi yderligere testet Gli1 antagonisten Gant61 (fig. 3D) og Smo antagonisten GDC-0449 (fig. 3E). I begge tilfælde blev der observeret lignende resultater. Den Gli1 antagonisten Gant61 inhiberede HT29 vækst på døende fødeceller betydeligt. Men forskellen mellem køretøjet kontrolgruppen og GDC-0449 behandlede grupper var ikke signifikant (

P

0,05),.

Gli1 knockdown af shRNA Reducerer Dying Tumor Cell stimuleret Living Tumor Cell vækst

Vi bekræftede yderligere rolle SHH signalering i døende tumor celle stimuleret levende tumorcellevækst ved anvendelse shRNA at knockdown Gli1 ekspression i fødeceller. HT29 og Panc1 celler inficeret med lentivirus transporterer Gli1 shRNA blev udvalgt i medier med 2 ug /ml puromycin, og Western blot analyse for Gli1 udtryk blev brugt til at verificere korrekt udvælgelse. Protein- niveauerne af Gli1 i både Panc1 og HT29-celler (fig. 4A, 4B) blev markant reduceret. Panc1 eller HT29-celler transduceret med Gli1 shRNA eller scramble shRNA blev bestrålet med 6 Gy og anvendes som feeder-celler. Væksten i Fluc mærket levende Panc1 eller HT29-celler podet på Gli1 knockdown feeder celler var signifikant svækket som det fremgår af betydeligt lavere luciferaseaktiviteter i brønde med Gli1 knockdown Panc1 eller HT29 celler end brønde med scramble shRNA transduceret Panc1 eller HT29-celler (

P

0,05) (fig 4A, 4B)

A… Den reducerede Gli1 proteinekspression i Gli1 shRNA transducerede Panc1 celler påvises ved Western blot (øverste panel). Den reducerede Panc1Fluc cellevækst på døende Gli1 shRNA transducerede Panc1 celler. * Repræsenterer

P

0,05; skala søjle repræsenterer 1 cm. B. Den reducerede Gli1 proteinekspression i Gli1 shRNA transducerede HT29-celler påvises ved Western blot (øverste panel). Den reducerede HT29Fluc cellevækst på døende Gli1 shRNA transducerede HT29-celler. skala søjle repræsenterer 1 cm.

SHH Signaling agonister Aktiver tumorcellevækst

Vi næste spurgte hvis SHH signalvejen agonist, SAG, som virker ved direkte binding til nedstrøms Smoothened, ville fremme væksten af ​​cancerceller. Panc1 og HT29-celler blev bestrålet ved 6 Gy og podet i 24-brønds plader som foderautomater i medium med eller uden 3 nM, 5 nM, 10 nM eller 100 nM SAG hhv. SAG behandling resulterede i øget reporter cellevækst i en dosisafhængig måde (fig. 5A, 5B). For yderligere at verificere de opnåede resultater med SAG, vi tilføjet en aktiv form af Shh, dvs. rekombinante N-terminale fragmenter af Shh på 600 ng /ml i mediet. Resultaterne antydede, at den rekombinante N-terminale fragment af Shh signifikant forøget tumorcellevækst på døende fødeceller i sammenligning med vehikelkontrol (

P

0,01). (. Figur 5C, 5D)

A. Aktivering af SHH signalering med SHH signalering agonist SAG forbedrer Panc1Fluc cellevækst på bestrålede døende Panc1 celler i en dosis-afhængig måde. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm. * Repræsenterer

P

0,05, ** repræsenterer

P

0,01. B. Aktivering af SHH signalering med SAG forbedrer HT29Fluc cellevækst på bestrålede døende HT29-celler i en dosis-afhængig måde. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm. ** Repræsenterer

P

0,01. C. Aktivering af SHH signalering med SHH signaling agonister, N-terminalt fragment af Shh, øger Panc1Fluc cellevækst på bestrålede døende Panc1 celler. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm. * Repræsenterer

P

0,05. D. Aktivering af SHH signalering med N-terminalt fragment af Shh øger HT29Fluc cellevækst på bestrålede døende HT29-celler. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm. * Repræsenterer

P

. 0,05

SHH Meldefunktioner agonister Øge Living Reporter cellevækst i fravær af bestrålet feederceller

Da Shh og Gli1 udtryk steg i bestrålet Panc1 og HT29-celler og SHH signaling agonister forbedret døende tumorcelle stimulerede levende tumorcellevækst, antog vi, at øget reporter cellevæksten var forårsaget af SHH signal frigivet fra døende celler, hvorved aktivering af SHH signalvejen i levende reporter celler bør også forårsage celle vækst. For at kontrollere vores hypotese tilføjede vi SHH signalering agonister SAG og det rekombinante N-terminale fragment af Shh til brønde, der indeholder Panc1 eller HT29 reporter alene. Både SAG og den aktive form af Shh steg betydeligt Panc1 eller HT29 reporter cellevækst (fig. 6). Disse resultater tyder på, at SHH signal frigivet fra døende celler resulterede i reporter cellevækst på grund af aktiveringen af ​​SHH pathway i reportergen-celler.

A. SHH signalering agonist SAG forbedrer Panc1Fluc cellevækst på en dosis-afhængig måde. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm. ** Repræsenterer

P

0,01. B. SHH signalering agonist SAG forbedrer HT29Fluc cellevækst på en dosis-afhængig måde. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm. * Repræsenterer

P

0,05, ** repræsenterer

P

0,01. C. Panc1Fluc celler behandlet med N-terminalt fragment Shh udviser øget vækst. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm. * Repræsenterer

P

0,05. D. HT29Fluc celler behandlet med N-terminalt fragment Shh udviser øget vækst. Top: signal intensitet analyse fra bioluminescens billede; Nederst: repræsentative bioluminescens billeder; skala søjle repræsenterer 1 cm. ** Repræsenterer

P

. 0,01

Diskussion

Tumor cellerepopulation er en vigtig proces, der forårsager tumor tilbagefald under cancer kemoterapi eller strålebehandling [13]. Repopulation af overlevende tumorceller kan forekomme mellem dosis fraktioner af enten stråling eller kemoterapi og kan føre til behandlingssvigt [14].