PLoS ONE: Cancer-associerede carbonhydrat-antigener som Potentielle Biomarkører for hepatocellulært carcinom

Abstrakt

hepatocellulært carcinom (HCC) er en af ​​de mest almindelige menneskelige maligniteter. Derfor udvikler de tidlige, højfølsomme diagnostiske biomarkører for at forhindre HCC er et presserende behov. Serum a-føtoprotein (AFP), den kliniske biomarkør i brug, er forhøjet i kun -60% af patienter med HCC; Derfor forventes identifikation af yderligere biomarkører til at have en betydelig indvirkning på folkesundheden. I denne undersøgelse, brugte vi glycan microarray analyse for at udforske potentialet diagnostiske værdi af flere cancer-associerede kulhydrater antigener (CACAs) som biomarkører for HCC. Vi anvendte glycan microarray analyse med 58 forskellige glycan analoger til kvantitativ sammenligning af 593 humane serumprøver (293 HCC prøver; 133 kronisk hepatitis B-virus (HBV) -infektion prøver, 134 kronisk hepatitis C-virus (HCV) -infektion prøver, og 33 raske donorprøver ) at udforske den diagnostiske mulighed for serum antistof-ændringer som biomarkører for HCC. Serumkoncentrationer af anti-disialosyl galactosyl globosid (DSGG), anti-fucosyl GM1 og anti-gB2 var signifikant højere hos patienter med HCC end i kronisk HBV infektion enkeltpersoner ikke hos kronisk HCV-infektion patienter. Samlet set i vores undersøgelse befolkning, biomarkør kandidater DSGG, fucosyl GM1 og gB2 af CACAs opnåede bedre prædiktiv følsomhed end AFP. Vi identificerede potentielle biomarkører egnede til tidlig påvisning af HCC. Glycan microarray analyse giver et kraftfuldt værktøj til høj følsomhed og høj kapacitet påvisning af serum antistoffer mod CACAs, som kan være værdifulde serum biomarkører for tidlig påvisning af personer med høj risiko for HCC

Henvisning:. Wu CS , Yen CJ, Chou RH, Li ST, Huang WC, Ren CT, et al. (2012) Cancer-associerede carbonhydrat-antigener som Potentielle Biomarkører for hepatocellulært carcinom. PLoS ONE 7 (7): e39466. doi: 10,1371 /journal.pone.0039466

Redaktør: Erica Villa, University of Modena Reggio Emilia, Italien

Modtaget: Februar 16, 2012; Accepteret: 21. maj 2012; Udgivet: 13 Jul 2012

Copyright: © 2012 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Science Rådet Taiwan indrømmer NSC99-2320-B-039-030-MY3, NSC99-2632-B-039-001-MY3, NSC100-2321-B-039-004, og The University of Texas MD Anderson -Kina Medical University og Hospital Søster Institution Fund DMR-101-115. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er den femte mest almindelige kræftform i verden, med Kina og Nordamerika viser en fortsat stigning i forekomsten og dødeligheden [1]. HCC næsten altid udvikler sig i fastsættelsen af ​​kronisk hepatitis virus infektion eller skrumpelever [2] – [4]. Prognosen for patienter med HCC forbliver fattige, og 5-års overlevelse efter diagnose eller for de fleste patienter er mindre end 5%, primært fordi sygdommen ofte er diagnosticeret i et fremskredent stadium [5]. For patienter med diagnosen HCC på et tidligt stadium, kan overlevelsesraten forbedres betydeligt ved kirurgisk resektion, levertransplantation, og andre helbredende behandlinger såsom ablative behandlinger [6], [7]. Desuden overvågning af udsatte patienter forbedrer detektion og potentielt helbredende virkning af behandlinger for små tumorer. Derfor tidlige prognostiske markører er afgørende for en effektiv behandling og forebyggelse af HCC.

Den mest almindelige HCC biomarkør til at screene patienter med levercirrose er serum a-føtoprotein (AFP), som måles ved 6-måneders interval [8]. Ikke desto mindre er AFP-niveauer ofte forhøjede hos nogle patienter med kronisk leversygdom, som ikke har kræft, og AFP-niveauer er ikke forhøjet i 30-40% af patienter med levercancer [9]. Serum AFP test har lav følsomhed, og omkring en tredjedel af patienterne med tidlige fase HCC og små tumorer ( 3 cm) har det samme niveau af AFP som i normale individer, hvilket gør AFP test utilstrækkelige til tidlig påvisning af HCC i udsatte befolkningsgrupper [10]. Derudover AFP testen har en høj falsk positiv sats på -20% blandt patienter med kronisk hepatitis og 20-50% for personer med levercirrose [5], [11]. I denne henseende er der et presserende behov for at identificere mere følsomme og pålidelige serum biomarkører til detektering af HCC [12], [13].

onkogenese er ofte forbundet med ændringer i ekspressionen af ​​celleoverflade kulhydrater. I nogle tilfælde kan det kulhydrat mønster være specifikke for sygdommen typen [14]. I andre tilfælde kan niveauer af anti-kulhydrat antistoffer markant forbedret med sygdommens begyndelse [15]. Tidligere undersøgelser har vist, at cellulære glycosylerings profiler ændre sig betydeligt under carcinogenese [14]. Kulhydrater spiller afgørende roller i forskellige biologiske begivenheder såsom celle anerkendelse [16], inter- og intracellulær signalering, fosterudvikling, celleadhæsion [17], og celle-celle-interaktioner [18]. I øjeblikket glycan markør opdagelse med glycan microarray analyse præsenterer et stort potentiale for at identificere biomarkører er relevante for diagnosticering af brystkræft [19].

glycan mikroarrays tillader direkte karakterisering af kulhydrat-protein interaktioner [20]. Microarray teknikker er effektive og følsomme metoder til hurtig analyse af specificiteten af ​​protein-kulhydrat-interaktioner og karakterisering af differentiering processer vedrørende udbrud af kræft på molekylært niveau [21]. Desuden kan fastgørelsen af ​​sukkerarter til overflader effektivt efterligne præsentationen af ​​disse forbindelser på membranen af ​​cellerne og således kan anvendes til at binde antistoffer [20]. I denne rapport har vi fokuseret på glycaner, der er kendt for at være kræft-associerede kulhydrater antigener (CACAs) i mange kræftformer, men som ikke er blevet undersøgt i HCC. Vi brugte glycan microarray analyse til at undersøge den diagnostiske mulighed for serum antistof ændringer som biomarkører for HCC. Desuden har vi sammenlignet nøjagtigheden af ​​biomarkører vi identificeret med den konventionelle AFP biomarkør for HCC.

Resultater

Patient Kendetegn

I alt 593 deltagere, herunder 293 HCC patienter , 133 kronisk hepatitis B-virus (HBV) -infektion patienter, 134 kronisk hepatitis C-virus (HCV) -infektion patienter og 33 normale forsøgspersoner blev rekrutteret til denne undersøgelse (tabel 1). Der var ingen signifikante forskelle i alder og køn mellem cases og kontroller. Hertil kommer, at HCC gruppen og raske kontroller gruppe havde statistisk forskellige laboratorieresultater for albumin, aspartataminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT) og total bilirubin (BIL-T) (p 0,05). Den patologiske iscenesættelse (AJCC) af HCC var klasse I i 96 tilfælde (41,3%), grad II i 80 tilfælde (34,5%), klasse III i 48 tilfælde (20,7%), og grad IV i 8 tilfælde (3,4%).

Påvisning af serum antistoffer mod Kulhydrat Antigener med glycan microarray analyse

Vi testede serum fra patienter med HCC for antistoffer, som binder til glycan fragmenter. Objektglas trykt i mikroarrayformat med glycan forbindelser 1-58 (Figur S1) blev inkuberet med serumprøver, og blev påvist bundne antistoffer ved anvendelse af Cy3-mærket gede-anti-humant IgG sekundært antistof (figur 1). De fluorescerende scanninger blev forarbejdet til at kvantificere intensiteten af ​​hver plet. De resulterende data blev repræsenteret som den gennemsnitlige relative fluorescens intensitet fra replikater af hver prøve. Vi bemærkede, at baggrunden intensiteten af ​​kulhydrat antigenbinding fra raske individer kunne være resultatet af ikke-specifik binding; derfor betyde fluorescensintensiteter af 35.000 blev fjernet fra analysen. Denne fremgangsmåde gav et rationale for udviklingen af ​​en glycan mikroarray at detektere tilstedeværelsen af ​​47 forskellige glycan antistoffer i serum fra patienter (efter fjernelse af prøvenumre 2, 3, 5, 7, 16, 20, 23, 24, 30, 31, og 47).

(a) en repræsentativ slide billede opnået fra en fluorescens-scanning efter detektering af IgG i serumprøver. Hver grid blev trykt med glycan tal 1-20 i den øverste række, 21-40 i den midterste række, og 41-58 i den nederste række. (B) gennemsnit ± standardafvigelse bindingsspecificiteten for antistoffer mod glycan numre 1-58 i serumprøver fra patienter med HCC. Relative fluorescensintensiteter blev beregnet for hver plet (indeholdende 100 uM glycan) i glycan microarray.

Vi undersøgte serumprøver fra 155 patienter med HCC og 33 raske individer for antistoffer, der bandt til kulhydrat antigener på glycan microarray. De fluorescensdata afspejler antistofreaktivitet til hver glycan blev normaliseret til Gb5 for hver prøve, og de relative fluorescensintensiteter for IgG-antistoffer fra patienter med HCC og raske individer er præsenteret som gennemsnit glycan: Gb5 IgG-forhold (figur 2). Antistoffer, der bandt til Gb5 blev påvist hos patienter med HCC og raske donorer. Vi observerede, at de niveauer af IgG mod glycan tallene 4 (SLacNAc 6SO

3), 15 (disialosyl galactosyl-globosid, DSGG), 18 (fucosyl GM1), 35 (Gb3), 36 (GB2), 42 (B19) og 56 (Man7) var signifikant højere hos patienter med HCC end hos raske personer.

relative fluorescens forhold blev beregnet som den relative fluorescensintensitet af hver glycan analog divideret med den relative fluorescens intensitet Gb5, og de er udtrykt i procent i figuren. Figuren viser det gennemsnitlige forhold mellem ± standardafvigelse for hver glycan. Stjerner angiver glycaner, hvor den gennemsnitlige glycan: Gb5 IgG-forholdet var signifikant højere i serum fra patienter med HCC (n = 155) end i serum fra raske individer (n = 33).

p

værdier blev beregnet med en Students

t

-test (*

s

0,05; **

s

0,01).

Sammenligning af indholdet af Seven Anti-glycan Antistoffer Blandt kvindelige og mandlige patienter med HCC og raske personer

i en tidligere undersøgelse [22], mænd havde en højere forekomst af HCC end kvinder. I vores aktuelle undersøgelse, vi øget HCC prøver tal op til 293 patienter og stratificeret vores resultater efter køn for at bestemme, om anti-glycan antistofniveauer varieret efter køn. Blandt kvinder, niveauer af IgG mod glycan numre 15, 18 og 35 var signifikant højere hos patienter med HCC end hos raske individer (

P

0,01) (figur 3A). Blandt mænd niveauer af IgG mod glycan numre 15, 18, 35, 36, og 42 var signifikant højere hos patienter med HCC end hos raske individer (

P

0,05) (figur 3B). Interessant vi observeret lignende resultater for glycan numre 15, 18 og 35 mellem to grupper.

relative fluorescens-forhold blev beregnet som fluorescensintensitet for hver glycan analog divideret med fluorescensintensiteten for Gb5, og de udtrykkes som procenter i tallene. Figuren viser det gennemsnitlige forhold mellem ± standardafvigelse for hver glycan. (A) The glycan: Gb5 IgG nøgletal for glycan numre 15, 18, og 35 var signifikant højere i serum fra kvindelige patienter med HCC (n = 70) end i serum fra raske kvinder (n = 11). (B) The glycan: Gb5 IgG-forhold for glycan numre 15, 18, 35, 36 og 42 var signifikant højere i serum fra mandlige patienter med HCC (n = 223) end i serum fra raske mænd (n = 22). Stjerner angiver glycaner, hvor den gennemsnitlige glycan: Gb5 IgG-forholdet var signifikant højere i serum fra patienter med HCC end i serum fra raske individer.

s

værdier blev beregnet med en Students

t

-test (*

P

0,01).

Sammenligning af Level af Select Anti-glycan antistoffer fra HCC og kronisk leversygdom (CLD) efter køn

på verdensplan mere end 52% af HCC tilfælde er forbundet med kronisk HBV-infektion, og 25% af HCC tilfælde er forbundet med HCV-infektion [23]. Kendt HBV eller HCV-infektion kan øge risikoen for at udvikle HCC [7]. At undersøge forskellene i HCC patienter med HBV eller HCV-infektion, vi delte patienter til HBV-positive HCC (HBV-HCC n = 132) eller HCV-positive HCC (HCV-HCC; n = 65) for at sammenligne kronisk leversygdom ( HBV-CLD, n = 133 og HCV-CLD, n = 134). For begge køn, niveauer af IgG mod glycaner 15, 18, og 36 for kvinder og mænd var højere i HBV-patienter med HCC fra disse patienter uden HCC (

P

0,05) (Figur 4A og B). Der var ingen signifikante forskelle i anti-glycan niveauer mellem patienter med HCV-HCC og kroniske HCV-patienter (figur 5A og B).

relative fluorescens-forhold blev beregnet som fluorescensintensitet for hver glycan analog divideret med fluorescens intensitet for Gb5, og de er udtrykt i procent i tallene. Figuren viser det gennemsnitlige forhold mellem ± standardafvigelse for hver glycan. Forholdene for glycan numre 15, 18 og 36 var signifikant højere fra HBV-relateret HCC end CLD (HBV) hos kvinder (n = 30 og 44, separat) (A) og mænd (n = 102 og 89, separat) ( B).

s

værdier blev beregnet med en Students

t

-test (*

P

0,05, **

P

0,01, * **

P

. 0,001)

relative fluorescens nøgletal blev beregnet som fluorescensintensitet for hver glycan analog divideret med fluorescens intensitet for Gb5, og de er udtrykt i procent i figurerne. Figuren viser det gennemsnitlige forhold mellem ± standardafvigelse for hver glycan. Forholdene for glycan numre 15, 18, 35, 36 og 42 var ingen signifikant forskel mellem HCV-relaterede HCC og CLD (HCV) hos kvinder (n = 18 og 61, separat) (A) og mænd (n = 47 og 73 , separat) (B). (

P

0,05).

Vi næste sammenlignet påvisning af glycan analoger og AFP for deres diagnostiske sensitivitet for HCC fra CLD og sund. For en patient med en leversygdom, kan konsensus til diagnose af HCC opnås med en forhøjet AFP-niveau (≥200 ng /dl), sammen med en dynamisk imaging undersøgelse, der viser en levertumor. I Taiwan, er cutoff værdien af ​​serum AFP niveau for HCC diagnose sat til 200 ng /ml, og i overensstemmelse med retningslinjerne for kliniske kriterier for HCC diagnose og mellemstationer. Derfor ændrer vi cutoff værdi AFP. Når AFP

200 (AFP på en afskæringsværdi på 200 ng /ml) blev anvendt til at forudsige HCC stadium en følsomhed på 33,33% (10 af 30) blev opnået for kvinder, og 24.51% (25 af 102 ) blev opnået for hanner (tabel 2). Vi observerede, at følsomheden af ​​3 anti-glycan tal (15, 18 og 36) var bedre end den af ​​AFP til 63,33% (19 af 30) /42.16% (43 102), 56,67% (17 af 30) /35,29% (36 af 102), og 43,33% (13 af 30) /45.1% (46 af 102), henholdsvis i kvinder /mænd. (Tabel 2). For at teste, om følsomheden af ​​klassificeringen kunne øges ved at inkludere kliniske data, blev AFP-værdierne er inkluderet i analysen. Som det ses i tabel 2, inddragelse af AFP-værdier og 3 anti-glycan markører øget følsomhed af den korrekte tarifering af HCC stater til 80% (24 af 30) og 74,5% (76 af 102), henholdsvis i kvindelige og mandlige.

Den diagnostiske værdi af tre anti-glycan antistoffer for HCC

for at vurdere, om serum anti-glycan niveauer kan bruges som en potentiel diagnostisk markør for HCC, Receiver Operating egenskaber (ROC) kurve analyser blev udført. Det blev afsløret, at serum 3 anti-glycan markører plus AFP niveauer var en potentiel markør for at diskriminere HBV-positive HCC patienter fra raske kontrolpersoner med en AUC (arealerne under ROC-kurven) på 0,6843 (95% CI: 0,5882 til 0,7805) ( Figur 6A). Ved cut-off værdi på 0,4974, sensitivitet og specificitet for denne markør var 46,21% og 84,85%. AUC af serum 3 anti-glycan markører plus AFP niveauer for at diskriminere HBV-positive HCC af kronisk HBV var 0,6923 (95% CI: 0,6215 til 0,7631) (Figur 6B). Ved cut-off værdi på 0,5268, sensitivitet og specificitet for denne markør var 57,58% og 82,43%. Dette resultat tyder på, at disse 3 anti-glycan markører plus AFP kan gælde for diagnosticering af HBV-relateret HCC.

Disse 3 anti-glykan antistoffer gav et AUC (områderne under ROC-kurven) på 0,6843 ( 95% CI: 0,5882 til 0,7805) med 46,21% følsomhed og 84,85% specificitet for at diskriminere HCC patienter fra raske kontroller (A), og en AUC på 0,6923 (95% CI: 0,6215 til 0,7631) med 57,58% følsomhed og 82,43% specificitet for diskriminere HCC fra HBV-CLD patienter (B).

diskussion

Tumor markører i serum hos patienter med HCC kan bruges som diagnostiske værktøjer, prognostiske faktorer og behandling parametre [ ,,,0],24]. Ved hjælp af vores glycan microarray, vi undersøgte serum for at søge efter antistoffer, der kunne skelne mellem patienter med HCC og raske personer. Denne undersøgelse har vist potentialet i en glycan microarray til at identificere CACAs biomarkør kandidater i serum fra patienter med HCC. I vores aktuelle undersøgelse, forskellene i serumantistofniveauer mellem patienter med HCC og raske personer var betydelige, med antistof niveauer for 7 af 58 glycaner forskelligt rigelige (p 0,01). Disse glycaner var SLacNAc 6SO

3, DSGG, fucosyl GM1, Gb3, GB2, B19, og Man7. Ændringer i glykosylering i kræft, samt andre sygdomme, har tiltrukket megen interesse og har vist potentiale både som en kilde til sygdomsmarkører og som mål for immunterapi af tumorer [15]. Ændringer i glycosyltransferase ekspressionsniveauer almindeligvis føre til en stigning i størrelse og forgrening af N-forbundne glycaner, hvilket skaber yderligere steder til terminale sialinsyrerester [25]. En tilsvarende stigning i sialyltransferase udtryk i sidste ende fører til en samlet stigning i sialylering [26]. Overekspression af glycosyltransferaser der er involveret i at knytte terminale rester til glykaner fører til overekspression af visse terminal glycan epitoper såsom SLacNAc 6SO

3, DSGG, og fucosyl GM1 på tumorer [27] – [29].

Vi fandt, at anti-DSGG niveauer skelnes mellem patienter med HCC og CLD. DSGG er en disialyl glycosphingolipid med en globo-serie kerne struktur [27]. I en tidligere undersøgelse blev DSGG identificeret som et adhæsionsmolekyle der udtrykkes på renalcellecarcinom, og dens forhold til metastatisk cancer blev påvist [27]. Vores data er den første til at foreslå, at DSGG er stærkt udtrykt i HCC

Interessant, har en kønsforskel blevet beskrevet for HCC i næsten alle studiepopulationer, med en mandlig:. Kvinde-forholdet for forekomsten af ​​HCC gennemsnit mellem 02:01 og 04:01 [30]. En mekanisme, der kan forklare den kønsbestemte ulighed observeret i forekomsten af ​​HCC er den øgede aktivitet af østrogener i kvindelige patienter, som kan tilbyde beskyttelse mod hepatocarcinogenese [22]. Derudover er der sandsynligvis andre cellulære regulatoriske molekyler involveret i ulighederne mellem kønnene i incidensen af ​​HCC. I vores aktuelle undersøgelse, observerede vi en ulighederne mellem kønnene i niveauer af lidt forskellige anti-kulhydrat-antistoffer. Niveauer af anti-fucosyl GM1 afveg i patienter med HCC og kronisk HBV eller raske individer. Fucosyl GM1 tilhører én slags gangliosider [28]. I en tidligere undersøgelse blev fucosyl GM1 stærkt forbundet med småcellet lungekræft, og denne tumor-associeret antigen blev påvist med høj følsomhed og specificitet ved hjælp af en immunofluorescens metode [28]. Rollen af ​​denne glycan i cancer er uklar. Glycosyleringen af ​​hormonreceptorer er blevet foreslået som en forklaring på ulighederne mellem kønnene i hjertesygdomme og prostatakræft [31], [32]. Selvom hvordan generel disse observationer skal populationer med en mere heterogen sygdom ætiologi stadig undersøges, resultaterne præsenteret her på potentielle glycan biomarkører synes ganske opmuntrende. For nylig er store analysemetoder blevet udviklet til human serum glycoproteome, som også er et effektivt værktøj til opdagelse af diagnostiske og terapeutiske mål. Brug af lectin-baserede glycoproteomic analyse, glycoprotein (GP) 73 viste sig at være en hidtil ukendt tumormarkør for HCC [33]. Serum GP73 niveauer blev signifikant forøget i patienter med HCC, selv i HCC patienter med serum AFP niveauer mindre end 20 ng /ml [24]. Fucosylering af GP73 er ​​rapporteret at være øget hos patienter med HCC [33]. En tidligere undersøgelse antydede, at fucosylering spiller en vigtig rolle i interaktionen mellem interleukin-8 og dets receptor, hvorved der induceres migrationen af ​​cancerceller i HCC [34]. Vores nuværende resultater tyder på, at fucosyl GM1 er en kandidat hepatiske CACAs biomarkører.

HCC er associeret med HBV-infektion i ca. 50% af tilfældene [35]. I denne undersøgelse observerede vi, at fem typer anti-glycan antistoffer blev øget i patienter med HCC og HBV-infektion. Derfor vi ekstrapolere, at stigningen i antistoffer og HBV-infektion er relateret. Woodchucks anvendes som en foretrukken dyremodel for kronisk HBV-infektion [36]. Denne model rekapitulerer sygdomsprogression på HBV-infektion til HCC og har dokumenteret ligheder i proteinglycosylering med human HCC [36]. Som HCC sædvanligvis tager år at udvikle sig som et resultat af kronisk HBV-infektion, kan undersøgelse af tidlige hændelser i skovmurmeldyr model af HBV-infektion give nyttig information om potentielle biomarkører for prognosen for HCC. De biologiske påvirkninger kørsel disse ændringer kræver yderligere undersøgelser.

AFP er den eneste serologiske markør øjeblikket anvendes til klinisk påvisning af HCC. Selv AFP forbedrer påvisning af HCC, behøver et betydeligt antal patienter med HCC ikke har forhøjede AFP-niveauer, og dermed er der behov for yderligere biomarkører til at øge følsomheden af ​​HCC afsløring [37], [38]. I tidligere forskning har AFP vist begrænset følsomhed (41-65%) i diagnosen af ​​HCC [39]. Derfor er der et presserende behov for at opdage yderligere biomarkører for screening og diagnosticering af HCC. Vores undersøgelse sammenlignet patienter med HCC og CLD plus sundt, og disse 3 glycan forudsat bedre følsomhed end AFP. Endvidere følsomheden af ​​3 anti-kulhydrat antistoffer plus AFP billede bedre diagnose følsomhed.

Desuden var der ingen korrelation mellem niveauer af disse 3 anti-glycan antistoffer og tumor fase (data ikke vist). Derfor foreslår vi, at de 3 anti-kulhydrat antistoffer kan være som biomarkører for indledningen af ​​tumor dannelse, men ikke tumor progression. Yderligere undersøgelse ved hjælp af en større patientgruppe og en valideringsproces, der omfatter prospektivt indsamlet er brug patientprøver for at bekræfte vores observationer. Disse nye CACAs biomarkører, i kombination med andre eksisterende serologiske biomarkører, kan være værdifuld ved diagnosen af ​​HCC. Baseret på vores resultater, foreslår vi, at kombinere glycan microarray analyse med AFP målinger vil give en langt bedre værktøj til HCC diagnose end brugen af ​​AFP alene.

har længe søgt Biomarkører for deres diagnostiske, prognostiske og terapeutiske bruger. Der er dog ingen pålidelige biomarkører for de fleste faste tumorer, herunder HCC. De er beskrevet i vores nuværende undersøgelse metoder er nyttige til identifikation mulige biomarkører for sygdom. Udviklingen af ​​en glycan microarray har gjort det muligt med høj følsomhed og høj kapacitet analyse af kulhydrat-protein interaktioner og har bidraget til betydelige fremskridt i Glycomics. Denne fremgangsmåde giver både et kraftfuldt værktøj til grundforskning og en lovende teknik til medicinsk diagnose og påvisning af patogener og kræft [20]. Denne metode kræver meget små mængder materiale og er mere effektiv og følsom end traditionelle ELISA-metode; Den fremlægger således en anden platform til at overvåge immunresponset på kulhydrat epitoper på forskellige stadier under differentiering, metastase, og behandling [21]. Vores nuværende forskning identificeret fem CACAs biomarkører for HCC diagnose, der skal evalueres yderligere i det fremtidige arbejde. Identifikation af CACAs vil være nyttig i udviklingen af ​​nye cancerterapier såsom generation af vacciner eller antistoffer rettet mod CACAs [14], [19], [40] – [42]. Vi mener, at glycan microarray er en levedygtig fremgangsmåde til klinisk diagnose af HCC. Denne metode bør forbedre prognose og kan tilbyde indsigt i udviklingen af ​​nye terapeutiske metoder til andre kræftformer. Nye glycan antigener kan vise sig at være nyttige mål ved eksisterende kulhydrat vacciner og dem i udvikling.

Som konklusion har vi vist, at glycan microarray analyse anvendes til at identificere nye kandidat glycan biomarkører for HCC kan være nyttige til screening af serum biomarkører for HCC. De biomarkør kandidater vi identificeret ved hjælp af glycan microarray analyse viste god prædiktiv følsomhed i undersøgelsen befolkning, og generelt var de overlegne AFP. Tilsætning af de ovenstående resultater til de konventionelle leverfunktionsprøver kan faktisk øge den diagnostiske nøjagtighed leversygdomme. Glycan microarray analyse giver et kraftfuldt værktøj til høj følsomhed og høj kapacitet påvisning af serum antistoffer mod CACAs, og de identificerede serum biomarkører kan være nyttige til tidlig opdagelse af HCC i højrisikogrupper.

Materialer og metoder

Etik Statement

undersøgelsen protokol den blev godkendt af Institutional Review Board of personmotiver Research Ethics Committee of Cheng Kung University Hospital i Taiwan (nr eR-99-176). Endvidere blev skriftligt informeret samtykke opnået fra deltagerne for brugen af ​​deres blod i denne undersøgelse.

serumprøver

Serumprøver fra raske individer (n = 33), kronisk HBV (n = 133 ), blev kronisk HCV (n = 134) og patienter med HCC (n = 293) indsamlet på National Cheng Kung University Hospital i Tainan, Taiwan. Prøverne blev krypteret for at beskytte patientens fortrolighed og blev brugt under en protokol godkendt af Institutional Review Board of Human Emner Forskning etiske komité af Cheng Kung University Hospital i Tainan, Taiwan. Patienterne blev diagnosticeret med en kombination af data (kliniske, laboratorie og billedbehandling resultater og /eller biopsi). Alle prøver blev opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse.

Generelle metoder Salg

NEXTERION slide H blev indkøbt fra SCHOTT Nordamerika. Belægningen på SCHOTT NEXTERION Slide H består af en tværbundet, multi-komponent polymerlag aktiveret med N-hydroxysuccinimid (NHS) -estere at tilvejebringe kovalent immobilisering af amingrupper. Den generelle procedure for syntesen af ​​glykaner blev udført som rapporteret [20], [21], [43]

Glycan Microarray Fabrication

Mikroarrays blev trykt. (BioDot, kartesiske Technologies) med en robotic pin (SMP3; TeleChem International) med en aflejring af ≈ 0,7 nL af forskellige koncentrationer af aminholdige glycaner i trykning puffer (300 mM phosphatbuffer [pH 8,5] indeholdende 0,005% Tween-20) fra en 96-brønds mikrotiterplade på NHS-coatede objektglas. Glassene blev spottet med 50 uM løsninger af hver glycan, med to rækker fra bund til top og fem lodrette gentagelser i hvert undergrupperingen. Hvert objektglas designet i 14 net. Trykte objektglas blev tilladt at reagere i en atmosfære af 80% fugtighed i 1 time efterfulgt af tørring natten over. Objektglassene blev opbevaret ved stuetemperatur i en ekssikkator indtil anvendelse. Før bindingsassayet blev objektglassene blokeret med ethanolamin (50 mM ethanolamin i 50 mM boratbuffer [pH 9,2]) og derefter vasket to gange med vand og phosphatpuffer saltvand (PBS) (pH 7,4).

Microarray analyse af serumprøver

serumprøver fra patienter med HCC og raske individer blev fortyndet 1:20 med en buffer bestående af 0,05% Tween 20 og 3% BSA i PBS (pH 7,4), påføres på gitre af den glycan mikroarrays og derefter inkuberet i et fugtigt kammer under omrystning i 1 time. Objektglassene blev derefter vasket tre gange hver med 0,05% Tween 20 i PBS (pH 7,4), PBS (pH 7,4), og H

2O. Dernæst blev Cy3-konjugeret gede-anti-humant IgG-antistof (Jackson ImmunoResearch) blev tilsat til objektglassene, som beskrevet ovenfor, og objektglassene blev inkuberet under en coverlid i et fugtigt kammer under omrystning i 1 time. Objektglassene blev vasket tre gange hver med 0,05% Tween 20 i PBS (pH 7,4), PBS (pH 7,4), og H derefter tørret

2O, og. Glassene blev scannet ved 532 nm (for Cy3-konjugeret sekundært antistof) med en microarray fluorescens chip-læser (arrayWoRx microarray læser).

Dataanalyse

Den software GenePix Pro (Axon Instruments) blev anvendes til fluorescens-analyse af de ekstraherede data. Den lokale baggrund blev subtraheret fra signalet ved hvert antistof plet. De “medianer af nøgletal” fra gentagne pletter blev midlet inden for samme array. For at opnå de relative binding intensiteter af glycaner i humane sera, satte vi det bindende intensitet for Gb5 til 100% og normaliseret relative binding intensiteter af hver glycan analog for hver serumprøve. Forholdet mellem anti-glycan: anti-Gb5 i sera blev beregnet ved at dividere den gennemsnitlige relative binding intensitet for glycan replikater ved den gennemsnitlige relative binding intensitet for Gb5 replikerer, og resultaterne blev udtrykt i procent. Følsomhed blev beregnet som forholdet mellem antallet af HCC prøver, der blev klassificeret korrekt som HCC (ægte positive) til det samlede antal HCC prøver. Endelig blev statistisk analyse af IgG-niveauer i patienter med HCC og raske individer udført under anvendelse af en uparret Students

t

-test. Receiver Operating karakteristik (ROC) kurver blev konstrueret og arealet under kurven (AUC) blev beregnet til at evaluere specificiteten og følsomheden af ​​forudsige og kontrolpersoner. Dataanalyse blev udført ved hjælp af Prism 5 (GraphPad Software, Inc.) og SigmaPlot 9.0 software (SigmaPlot).

Støtte oplysninger

figur S1.

Syntese af glykaner. Kemien komponere metode blev anvendt til at syntetisere 58 kulhydrat antigener

doi:. 10,1371 /journal.pone.0039466.s001

(TIF)