PLoS ONE: En kvantitativ mangel i perifert blod Vγ9Vδ2 Cells er en negativ Prognostisk Biomarkør i kræft i æggestokkene Patients

Abstrakt

Vγ9Vδ2 celler er cytotoksiske T-celler, der er i stand til at genkende epitelial ovariecancer (EOC) celler. Derfor Vγ9Vδ2 cellebaseret adoptiv overførsel er en attraktiv terapi for EOC. Men den ineffektive

ex vivo

ekspansion efter specifik stimulering af Vγ9Vδ2 celler fra nogle patienter og forholdet mellem Vγ9Vδ2 celler og kliniske forløb af EOC er spørgsmål der mangler at blive afklaret. Heri blev mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) fra 60 EOC patienter stimuleret med bromhydrin pyrophosphat (BrHPP) eller zoledronat, som er specifikke agonister af Vγ9Vδ2 celler. Forbindelserne afveg i deres effektiviteter at fremkalde

ex vivo

Vγ9Vδ2 PBMC ekspansion, men 16/60 prøver forblev ineffektivt udvidet med begge stimuli. Interessant nok Vγ9Vδ2 celler i disse lave-responderende PBMC’er vist før ekspansion (

ex vivo

PBMC’er) en ændret produktion af de pro-inflammatoriske cytokiner IFN-y og TNF-a, en nedsat naiv fraktion og en reduceret frekvens . Der blev ikke observeret tegn på en inddragelse af CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ regulatoriske celler. Vigtigere, vores data viser også, at en Vγ9Vδ2 celle frekvens på 0,35% eller mindre i EOC PBMC’er kunne anvendes til at forudsige lave reaktioner på både BrHPP og zoledronat. Desuden er vores data fremhæve, at en sådan mangel ikke er korreleret med avancerede EOC faser, men er forbundet med flere ildfaste stater til platinbaseret kemoterapi og er en uafhængig prædiktor for kortere sygdomsfri overlevelse efter behandling. Disse resultater er de første til at foreslå en potentielle bidrag Vγ9Vδ2 celler til anti-tumor effekter af kemoterapeutiske stoffer og de styrker interessen for strategier, der kan øge Vγ9Vδ2 celler hos kræftpatienter

Henvisning:. Thedrez A, Lavoué V , Dessarthe B, Daniel P, Henno S, Jaffre I, et al. (2013) En kvantitativ Mangel i perifert blod Vγ9Vδ2 Cells er en negativ Prognostisk Biomarkør i æggestokkene kræftpatienter. PLoS ONE 8 (5): e63322. doi: 10,1371 /journal.pone.0063322

Redaktør: Eric Vivier, INSERM- CNRS- Univ. Méditerranée, Frankrig

Modtaget: Januar 2, 2013; Accepteret: April 2, 2013; Udgivet: 23. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Thedrez et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Institut National du Cancer (INCA) PL2008-034, Cancéropôle Grand-Ouest og økonomisk støtte fra Medicine Fakultet Rennes Universitet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Menneskelig Vγ9Vδ2 celler er en fremherskende delmængde af perifert blod γδ T-celler, der udtrykker en unik TCR med Vγ9-Vδ2 regioner. Disse celler, som normalt udgør 0,5-10% af den perifere lymfoide pool, reagerer mod forskellige tumorceller gennem anerkendelse af phosphorylerede isoprenoid derivater defineret som phosphoantigens [1], [2]. Vγ9Vδ2 celler kan direkte dræbe deres mål og frigive pro-inflammatoriske cytokiner, der øger anti-tumor effektorceller af det adaptive immunsystem [3]. På grund af disse egenskaber, kan den selektive udløsning af disse celler være af stor interesse i cancerimmunterapi [4]. Adskillige tiden tilgængelige klinisk kvalitet forbindelser er i stand til kraftigt at aktivere Vγ9Vδ2 celler og med IL-2, kan inducere den selektive udvækst af disse celler

in vitro

in vivo

. Disse forbindelser er enten syntetiske phosphoantigens, såsom bromhydrin pyrophosphat (BrHPP, Phosphostim ™) eller farmakologiske inhibitorer af mevalonat-vejen, såsom aminobisphosphonates (dvs. zoledronat, Zometa ™). Sådanne forbindelser er for nylig blevet vurderet i passive eller aktive immunterapeutiske forsøg med patienter med hæmatologiske maligniteter eller massive tumorer [5] – [14]. Disse behandlinger er blevet generelt veltolereret og har fremkaldt opmuntrende objektive responser hos nogle patienter [12], [15], [16].

Epithelial ovariecancer (EOC) er den femte hyppigste kræftsygdom hos kvinder og forårsager flere dødsfald end nogen anden gynækologisk kræft. De fleste EOC patienter er diagnosticeret på et fremskredent stadium. I øjeblikket alle patienter gennemgå kirurgiske procedurer, og 90% af patienterne får også en platinbaseret kemoterapi. Men den 5-års overlevelse er stadig under 40%. Derfor har øget viden om den rolle immunosurveillance i EOC førte til udforskning af innovative terapeutiske strategier, der er målrettet immunsystemet [17]. For nylig viste vores gruppe, at

in vitro

phosphoantigen-udvidet Vγ9Vδ2 celler fra EOC patienter vise high cytolytisk aktivitet mod friske æggestokkene autologe tumorceller, hvilket giver en rationel for Vγ9Vδ2 cellebaseret adoptiv overførsel i EOC patienter [18] . Men forholdet mellem Vγ9Vδ2 celler og progression eller kliniske resultater af EOC forbliver uudforsket. Derudover findes nogle bekymringer om effekten af ​​Vγ9Vδ2 celle udvidelser med konventionelle protokoller, der er baseret på den

ex vivo

stimulering af perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) med en enkelt dosis af enten BrHPP eller zoledronat og dyrkningsbetingelser, som kræver IL-2. Disse protokoller er egnede til celler fra raske donorer [19], [20]. De undlod imidlertid at effektivt udvide Vγ9Vδ2 celler fra nogle EOC patienter [18], svarende til observationer i andre kræftformer [12], [14], [20] – [22]. Det er stadig uvist, om disse fejl i nogle EOC patienter er relateret til iboende forskelle i Vγ9Vδ2 celler eller skyldes forskelle i andre miljøparametre. En forståelse af disse forskelle vil bidrage til at optimere fremtidige kliniske forsøg med Vγ9Vδ2 cellebaserede adoptiv transfer behandlinger i EOC

I denne undersøgelse undersøgte vi følgende i en kohorte af 60 EOC patienter:. Parametrene er forbundet med ineffektiv BrHPP- og zoledronat-induceret Vγ9Vδ2 celle udvidelser og muligheden for en sammenhæng mellem forekomsten af ​​Vγ9Vδ2 celler og det kliniske forløb af EOC. Vi rapporterer, at PBMC’er, der var ineffektivt udvidet med BrHPP og med zoledronat har før ekspansion (

ex vivo

PBMC’er) reducerede frekvenser af Vγ9Vδ2 celler, og at disse celler vise ændringer i deres fænotype og funktionalitet. Desuden afslører vi, at en Vγ9Vδ2 celle frekvens på 0,35% eller mindre i

ex vivo

EOC PBMC’er forudsiger lave reaktioner på både BrHPP- og zoledronat-baserede stimulation protokoller, og at en sådan cellulær mangel er relateret til den kliniske progression og gentagelse af EOC efter kemoterapi-baserede behandling.

Resultater

De udvidelser af Vγ9Vδ2 PBMC’er som reaktion på BrHPP og zoledronat er lavere i EOC Patienter end i raske donorer

Første, vi sammenlignede udvidelser af PBMC’er fra 60 EOC patienter (EOC PBMC’er) og fra 13 raske kvindelige donorer efter en specifik Vγ9Vδ2 celle stimulation med en enkelt dosis af enten BrHPP eller zoledronat (Zol), der var relevante for kliniske forsøgsprotokoller, og en kultur i to uger i nærvær af IL-2 (fig. 1). Medianen hyppighed Vγ9Vδ2 celler i ekspanderede PBMC’er (fig. 1A) og den mediane antal ekspanderede Vγ9Vδ2 celler (fig. 1B) var signifikant lavere hos EOC patienter end hos donorer på 14 dage efter stimulering med enten BrHPP eller Zol. Disse data bekræfter, at svarene fra Vγ9Vδ2 PBMC’er til både stimulationsregimer kan reduceres væsentligt i EOC patienter.

Vδ2

+ CD3

+ celle frekvenser blandt udvidede celler (A) og Vδ2

+ CD3

+ celletal genereret fra 1 × 10

6 PBMC’er (B) blev målt ved 14 dage efter BrHPP (▴) eller zoledronat (Zol) (▪) stimulation. Resultaterne fra n = 60 patient PBMC’er og n = 13 donor PBMC’er er vist.

BrHPP og Zoledronat forskellige i deres Kapacitet til Udvid Vγ9Vδ2 PBMC’er fra EOC Patienter

Under hensyntagen til vores resultater fra EOC patient PBMC udvidelser (fig. 1), og den minimale sats af renhed, der tidligere blev defineret for en Vγ9Vδ2 celle-baseret behandling produkt [6], [23], valgte vi den udvidede Vγ9Vδ2 celle antal 2 × 10

6 celler (genereret fra 1 × 10

6 PBMC’er) (se tabel 1 legende for detaljer) og Vγ9Vδ2 celle frekvens på 70% blandt de udvidede celler som cut-off-værdier til at skelne effektive udvidelser (≥2 × 10

6 celler og ≥70%) fra ineffektive udvidelser ( 2 × 10

6 celler eller 70%). Fire statistisk forskellige grupper af prøver blev således identificeret i vores eksperimentelle betingelser (tabel 1): de reagerende PBMC’er (R), der effektivt blev ekspanderet med begge stimuli (53%); De BrHPP-lave-responderende PBMC’er (Br-LR), der kun var effektivt udvidet med Zol (13%); De Zol-lave-responderende PBMC’er (Zol-LR), der kun var effektivt udvidet med BrHPP (7%); og de lave-responderende PBMC’er (LR), der var ineffektivt ekspanderede uanset stimulus anvendt (27%). Disse data viser de forskellige evner konventionel BrHPP- og zoledronat-baserede protokoller til effektivt at udvide Vγ9Vδ2 PBMC’er fra EOC patienter.

kapacitet Vγ9Vδ2 Celler til at formere sig og til at producere den Pro-inflammatoriske cytokiner IFN γ og TNF-α er reduceret i LR EOC PBMC’er

for at undersøge de parametre, der er forbundet med lav respons status Vγ9Vδ2 PBMC’er til både BrHPP- og zoledronat-baserede stimulation protokoller, sammenlignende analyser blev begrænset til LR og R-grupperne.

Vi først sammenlignede fold stigninger i Vγ9Vδ2 PBMC’er 14 dage efter BrHPP eller Zol stimulation (fig. 2A og 2B). De gange stigninger var signifikant lavere i LR PBMC’er end i R PBMC’er efter behandling med enten agonist (Fig. 2A). Den mediane BrHPP-induceret Vγ9Vδ2 celle dobling var 812 [352-2333] for R-gruppen og kun 132 [74-609] for LR gruppen (fig. 2A). En lignende tendens blev observeret i Zol-behandlede celler, med mediane fold stigninger på 712 [339-1854] for R-gruppen og 403 [140-872] for LR gruppen (fig. 2B). Produktionen af ​​de pro-inflammatoriske cytokiner IFN-y og TNF-a byVγ9Vδ2 celler i LR og R EOC PBMC’er før ekspansion (

ex vivo

PBMC’er) blev også behandlet med intracellulær farvning. Eksperimenter blev udført ved at stimulere

ex vivo

PBMC’er med BrHPP eller PMA /ionomycin. På grund af nogle PBMC beløb i prøver fra patienter, blev zoledronat sprunget fra følgende aktivering analyser. De produktioner af TNF-α og IFN-γ viste sig at blive reduceret betydeligt i LR PBMC’er i forhold til R PBMC’er (Fig. 2C og 2D). Vigtigt er det, doser af BrHPP der var mættende for R PBMC’er undladt at gendanne IFN-y og TNF-a-responser i LR PBMC’er (fig. S1). Alt sammen viser disse resultater en ændret funktionel profil Vγ9Vδ2 celler i LR EOC PBMC’er.

A, B) Vδ2

+ CD3

+ celle fold stigninger i LR (n = 16) og R (n = 32) EOC PBMC’er på 14 dage efter BrHPP (A) eller Zol (B) stimulering. C) Procentdelen af ​​IFN-γ

+ -celler i Vδ2

+ CD3

+ -celler målt 5 timer efter stimulering af

ex vivo

LR (n = 10) og R ( n = 10) PBMC’er med BrHPP (3 uM) eller PMA /ionomycin (PMA /IONO). D) Procentdelen af ​​IFN-γ

+ celler (

venstre panel

) og TNF-α

+ celler (

højre panel

) blandt Vδ2

+ CD3

+ -celler målt 5 timer efter stimulering af

ex vivo

LR (n = 4) og R (n = 4) PBMC’er med stigende doser af BrHPP (0,1 til 6 um). E) Ekspression af CD3ζ kæde målt på Vγ9Vδ2 PBMC’er fra LR og R-grupper. Procent (

øverste panel

) og MFI (

lavere panel

) af CD3ζ farvning i Vδ2

+ CD3

+ celler fra LR EOC PBMC’er (n = 5), R EOC PBMC’er (n = 3) og R donor PBMC’er (n = 3). F) CRTAM ekspression på Vγ9Vδ2 celler målt 20 timer efter stimulering af LR (n = 8) og R (n = 8) EOC PBMC’er med BrHPP. Ingen STIM:. Ingen stimulering

Den reducerede proliferation og cytokinproduktion af Vγ9Vδ2 celler kunne medføre forskellige faktorer, herunder en reduceret ekspression af T-celle receptor CD3ζ kæder, ændrede andele af naive og hukommelse delmængder eller en ugunstige forhold mellem regulatoriske T-celler til Vγ9Vδ2 celler. Disse muligheder blev efterfølgende undersøgt.

ekspressionsniveauet af CD3ζ Chains ens for

ex vivo

LR og R EOC PBMC’er

Aktiveringen signaltransduktion af T-lymfocytter passerer gennem de cytoplasmiske haler af T-celle-receptor CD3ζ kæder. En defekt i ekspressionen af ​​disse komponenter på

ex viv

o Vγ9Vδ2 celler fra LR PBMC’er blev udforsket. Men blev påvist i de procentsatser og niveauer (MFI) af CD3ζ kæde udtryk mellem, ingen signifikante forskelle

ex vivo

LR og R Vγ9Vδ2 PBMC’er (fig. 2E). Vi sammenlignede også evner Vγ9Vδ2 celler i LR og R EOC PBMC’er til at udtrykke klasse I-begrænsede T-celle-associeret molekyle (CRTAM) [24], som blev identificeret for nylig af vores gruppe som en fænotypisk markør, der er stærkt forbundet med aktivering af Vγ9Vδ2 PBMC’er [25]. Interessant, efter BrHPP stimulering, blev CRTAM sig at blive udtrykt på lignende (procent og MFI) på Vγ9Vδ2 celler fra både LR og R PBMC’er (fig. 2F og data ikke vist).

den naive Vγ9Vδ2 cellefraktion reduceres i

ex vivo

LR EOC PBMC’er

de naive og hukommelse delmængder af Vγ9Vδ2 celler blev analyseret i

ex vivo

LR og R EOC PBMC’er efter ekspression af CD27 og CD45 -Ra markører (fig. 3). Medianen naive celle frekvens blandt Vγ9Vδ2 PBMC’er var signifikant lavere i LR-gruppen (37%) end i R-gruppen (53%;. Figur 3). Følgelig medianen hukommelsescelle frekvens højere i LR gruppen. Signifikant positiv korrelation blev fundet mellem de naive celle frekvenser blandt Vγ9Vδ2 PBMC’er og fold stigninger i Vγ9Vδ2 celler efter BrHPP stimulering (p = 0,041 i henhold til Spearman korrelation test). En sådan korrelation blev ikke fundet i forsøg udført med Zol. Inden for hukommelsen rummet, ingen statistisk blev påvist signifikante forskelle mellem LR og R-grupperne i frekvenserne af centrale, effektor eller terminalt differentierede effektor delmængder blandt Vγ9Vδ2 PBMC’er (fig. 3). Således blev der ikke hukommelse Vγ9Vδ2 delmængder beriget fortrinsvis i

ex vivo

LR EOC PBMC’er.

Procent af naive (CD27

+ CD45RA

+), central hukommelse (CM) (CD27

+ CD45RA

-), effektor memory (EM) (CD27

-CD45RA

-) og terminalt differentieret effektor memory (TEMRA) (CD27

-CD45RA

+) celler blandt Vδ2

+ CD3

+ celler i

ex vivo

LR (n = 13) og R (n = 11) EOC PBMCer.

En ubalance mellem CD4

+ CD25

highFoxP3

høje Regulatory T-celler og Vγ9Vδ2 celler Findes i

ex vivo

LR EOC PBMC’er men er ikke involveret i Nedsat Udvidelse af Vγ9Vδ2 celler

Hyppigheden af ​​CD4

+ CD25

highFoxP3

høje regulatoriske T-celler (tregs) og af forholdene tregs til Vγ9Vδ2 celler (Treg: Vγ9Vδ2 forhold) blev undersøgt i

ex vivo

LR og R EOC PBMC’er. De Treg celle frekvenser blev ikke fundet at være signifikant forskellig mellem LR og R EOC PBMC’er (fig. 4A). Men signifikante fald i de Vγ9Vδ2 celle frekvenser i LR EOC PBMC’er førte til Treg: Vγ9Vδ2 nøgletal, der var signifikant højere i LR gruppen end i R-gruppen (fig 4B.). Vigtigere, blev observeret nogen omvendte korrelationer mellem disse forhold og de gange stigninger i Vγ9Vδ2 celler, som blev målt efter stimulering med enten BrHPP eller Zol (efter Spearman korrelationskoefficient analyser, p = 0,07 og p = 0,67, henholdsvis). Derudover har udtømningen af ​​tregs i LR EOC PBMC’er med anti-CD25 mikroperler ikke forbedre ekspansion kapacitet Vγ9Vδ2 celler efter stimulation med BrHPP eller Zol (fig. 4C). Faktisk blev der ikke observeret signifikante forskelle i de frekvenser, tal eller fold stigninger i Vγ9Vδ2 celler fra CD25-udtømte LR PBMC’er i forhold til ikke-udtømte LR PBMC’er efter stimulation med enten BrHPP eller Zol (fig. 4C og data ikke vist). Notatet ingen udtynding af Vγ9Vδ2 celler og ændrede celle levedygtighed var tydeligt efter CD25-depletion (data ikke vist). Tilsammen disse observationer tyder på, at den øgede andel af tregs forhold til Vγ9Vδ2 celler i LR EOC PBMC’er ikke er involveret i nedsat respons Vγ9Vδ2 celler.

A) CD4

+ CD25

highFoxP3

høj celle (Treg) frekvenser og tilsvarende Vδ2

+ CD3

+ celle frekvenser i

ex vivo

LR (n = 13) og R (n = 11) PBMC’er. B) Forholdet mellem tregs (%) til Vδ2

+ CD3

+ celler (%) (Treg: Vδ2

+ ratio) blandt PBMC’er i LR og R-grupperne. C) LR PBMCer fra EOC patienter (n = 6) blev stimuleret med BrHPP (▴) eller Zol (▪) og IL-2 før og efter udtømning af CD25

+ celler; spredning af Vδ2

+ CD3

+ celler blev analyseret på dag 7. Vδ2

+ CD3

+ celle frekvenser blandt udvidede celler (

venstre panel

) og Vδ2

+ CD3

+ celle gange stigninger (

højre panel

) er vist.

En mindre hyppig Vγ9Vδ2 celler i

ex vivo

EOC PBMC’er ≤0.35 % Forudsiger et Ineffektiv Response to Både BrHPP og zoledronat

en analyse af den

ex vivo

Vγ9Vδ2 celle frekvenser blev derefter udført i de fire grupper, der tidligere er beskrevet i tabel 1. frekvensen af ​​Vγ9Vδ2 celler var signifikant reduceret i LR-gruppen sammenlignet med alle andre grupper (fig. 5A). De medianværdier af Vγ9Vδ2 celle frekvenser i PBMC’er var 0,28% for LR-gruppen og 1,38% for R-gruppen (fig. 5A). Mellemliggende værdier blev observeret for Br-LR og Zol-LR-grupper, med median frekvenser på 0,48% og 0,64%, hhv. Interessant, sås ingen signifikante forskelle mellem LR, Br-LR, Zol-LR og R EOC-grupper i frekvenserne af ikke-Vδ2

+ γδ T-celler (fig. 5B) eller CD3

+ celler i PBMC’er (fig. 5C). Desuden overvejer hele kohorten blev en signifikant positiv sammenhæng fundet mellem de

ex vivo

Vγ9Vδ2 celle frekvenser og fold stiger efter stimulering med BrHPP men ikke med Zol (p = 0,015 ifølge Spearman s korrelation test). Desuden positive korrelationer mellem de

ex vivo

Vγ9Vδ2 celle frekvenser og IFN-y-produktioner som reaktion på enten BrHPP eller PMA /ionomycin (. Målt i figur 2C) blev påvist (p = 0,015 og p 0,001, henholdsvis). Disse data viser en specifik reduktion i hyppigheden af ​​Vγ9Vδ2 delmængde, der er stærkt forbundet med funktionelle uregelmæssigheder i LR EOC PBMC’er.

Frekvensen af ​​Vδ2

+ CD3

+ celler (A), Vδ2

-γδ

+ CD3

+ -celler (B) og CD3

+ -celler (C) blandt LR (n = 16), Br-LR (n = 8), Zol-LR (n = 4) og R (n = 32) EOC PBMC’er er vist. Forskelle mellem LR og hver af andre grupper er angivet. A) En modtager-operator karakteristik (udførtes ROC) analyse, hvor LR PBMC prøver blev sammenlignet med de andre PBMC prøver. Stiplede linjer angiver cut-offs på 0,35% og 0,8%. Sp: Specificitet. Se:. Sensibilitet

For at afgøre, om en bestemt Vγ9Vδ2 celle frekvens værdi kunne bruges til at forudsige ineffektive reaktioner på både BrHPP og Zol, en modtager-operatør karakteristik (ROC) analyse blev udført. En Vγ9Vδ2 celle frekvens blandt PBMCer fra 0,35% eller mindre var altid forbundet med lave reaktioner på både BrHPP og Zol (100% specificitet). Til frekvenser på 0,8% eller mere, alle udvidelser var effektive med mindst én stimuli. Ved frekvenser mellem 0,35% og 0,8%, blev der observeret ineffektive reaktioner på både stimuli og effektive svar. Disse resultater viser, at en Vγ9Vδ2 celle frekvens på 0,35% eller mindre blandt

ex vivo

PBMC’er er prædiktiv for ineffektive reaktioner på både BrHPP og Zol.

En Vγ9Vδ2 Cell Frekvens på 0,35% eller mindre i

ex vivo

EOC PBMC’er er en negativ Prognostisk markør i EOC patienter

for at undersøge forholdet mellem Vγ9Vδ2 celler og EOC sygdom, blev kliniske data fra patienter analyseret i forhold til Vγ9Vδ2 celle frekvenser i

ex vivo

PBMC’er (tabel 2 og fig. 5). Blandt alle de parametre, der blev optaget på tidspunktet for blodprøvetagning blev en forening stiftet kun med patientens alder (tabel 2). Den mediane patientens alder var signifikant højere i den gruppe, der havde Vγ9Vδ2 celle frekvenser i PBMCer fra 0,35% eller mindre (group≤0.35%) end i gruppen med frekvenser på mere end 0,35% (gruppe 0,35%). Vigtigere, blev der ikke fald i koncentrationerne af leukocytter og PBMC’er blod observeret i group≤0.35%, hvilket bekræfter den specifikke kvantitative mangel på Vγ9Vδ2 celler i det perifere blod. Ingen Foreningen blev etableret mellem denne mangel og administration af kemoterapi før blodprøvetagning. Desuden blev ingen korrelation fundet mellem mangel i perifert blod Vγ9Vδ2 celler og en avanceret stadium af sygdommen eller højere tumor klasse. Med hensyn til behandling af EOC patienter (tabel 2), blev der ikke observeret signifikante forskelle mellem group≤0.35% og gruppen 0,35% i effekten af ​​debulking kirurgi eller i den type modtaget kemoterapi (tabel 2). Imidlertid blev de kliniske resultater af kemoterapi-behandlede EOC patienter fundet at være tydelig mellem grupperne. Interessant, at andelen af ​​patienter, som var refraktære over for kemoterapi var signifikant højere i group≤0.35% (62,5%) end i gruppen 0,35% (17,5%) (Tabel 2). Desuden univariate analyser af sygdomsfri overlevelse med forskellige relevante faktorer afslørede, at en Vγ9Vδ2 celle frekvens på 0,35% eller mindre i PBMC’er og en ikke-optimal debulking er prædiktorer for kortere sygdomsfri overlevelse varighed (tabel 3). Med en gennemsnitlig opfølgning varighed på 13 måneder for disse patienter, den gennemsnitlige varighed af sygdomsfri overlevelse var en måned i group≤0.35% versus 10 måneder i gruppen 0,35% (. Figur 5). Vigtigt er det, blev den negative prognostiske værdi af den reducerede Vγ9Vδ2 celle frekvens opretholdes efter en justering i en multivariat analyse (tabel 3).

Diskussion

Tidligere undersøgelser har vist, at konventionel

ex vivo

Vγ9Vδ2 celle ekspansion protokoller baseret på stimulering af PBMC’er med BrHPP eller Zol mislykkedes i et gennemsnit på 35% af kræftpatienter [12], [20] – [22], [26], [ ,,,0],27]. Her har vi bekræftet disse observationer i EOC. Fra 60 EOC PBMC prøver, ineffektive udvidelser efter stimulering med enten BrHPP eller Zol forekom i 40% og 33% af tilfældene, hhv. Interessant, vores sammenlignende analyser afslørede også, at BrHPP og Zol afveg i deres evne til at udvide Vγ9Vδ2 PBMC’er fra patienter. Prøver, der blev ikke effektivt udvidet med BrHPP effektivt kunne udvides med Zol, og den reverse var også sandt. Disse resultater antyder, at hver forbindelse kan testes i små ekspansion assays for at muliggøre valget af den bedste forbindelse for hver patient. Alligevel forblev 27% af PBMC prøver fra EOC patienter ineffektivt udvidet med begge forbindelserne (LR PBMC’er). Vi viste, at Vγ9Vδ2 celler i disse

ex vivo

LR PBMC’er ikke kun havde nedsat proliferative kapacitet, men også vist en ændret produktion af pro-inflammatoriske cytokiner IFN-y og TNF-a? Sammenlignet med Vγ9Vδ2 celler fra reagere (R) PBMCer. Mætte doser af BrHPP undladt at genoprette respons Vγ9Vδ2 celler i LR PBMC’er. Disse resultater understøtter en iboende funktionel defekt af LR Vγ9Vδ2 PBMC’er og tyder på, at anvendelsen af ​​højere doser af phosphoantigens at forbedre respons Vγ9Vδ2 celler i LR EOC PBMC’er ville være forgæves. Til vores viden, er dette den første

ex vivo

demonstration af ændrede Vγ9Vδ2 celle effektorfunktioner i EOC patienter.

Mange parametre kunne relateres til denne reducerede funktionalitet. Tab eller reduceret ekspression af CD3ζ kæden på T-celler fra cancerpatienter er blevet impliceret i forringet T-celleaktivering [28]. Der blev dog ikke observeret nogen forskel i CD3ζ kæde udtryk på

ex vivo

Vγ9Vδ2 celler mellem LR og R PBMC’er i vores EOC kohorte, hvilket indikerer, at ekspressionen af ​​denne kæde er ikke sygdomsfremkaldende. Fejl i udtryk for aktivering markører kunne også være forbundet. Her molekylet CRTAM, for nylig beskrevet af vores gruppe som en fænotypisk markør, der er stærkt relateret til aktivering af Vγ9Vδ2 PBMC’er [25], viste sig at blive udtrykt på samme måde på Vγ9Vδ2 celler fra både LR og R EOC PBMC’er efter BrHPP stimulering. Denne observation tyder på, at signalering begivenheder, der førte til CRTAM udtryk ikke er defekte i Vγ9Vδ2 fra LR PBMC’er. Desuden kunne tilstedeværelsen af ​​CD4

+ CD25

highFoxP3

høje T regulatoriske celler (tregs) inddrages i Vγ9Vδ2 celle mangler i kræftpatienter [29]. De seneste data fra Kunzmann

et al

. har dokumenteret, at en stigning i treg: Vγ9Vδ2 forholdet undertrykt phosphoantigen-induceret γδ T-celle proliferation og bidrog til staten tilsyneladende immunologisk passivitet til phosphoantigens der blev observeret i nogle kræftpatienter [27]. Vores resultater i EOC patienter viste en øget treg: Vγ9Vδ2 forholdet i

ex vivo

LR PBMC’er. Men vi fandt ikke en omvendt korrelation mellem dette forhold og fold stigninger i Vγ9Vδ2 celler som respons på enten BrHPP eller Zol. Desuden Kunzmann

et al

. har rapporteret, at udtømning af tregs (ved hjælp af CD25-udtømning) i lav-reagerer PBMC’er fra patienter med tumorer andre end EOC restaureret Vγ9Vδ2 celle ekspansion i respons på phosphoantigens. Her har den samme celle depletion i LR PBMC’er fra EOC patienter ikke forbedre spredningen af ​​Vγ9Vδ2 celler som reaktion på phosphoantigens eller aminobisphosphonates. I yderligere assays testede vi en skrå fremgangsmåde til cellereduktion at fjerne tregs fra LR EOC PBMC’er samtidig bevare CD25

+ aktiverede celler med anvendelse af CD4

+ CD25

+ CD127

dim /- Regulatory T Cell Isolation Kit II fra Miltenyi Biotec (data ikke vist). Interessant, virkningerne af en sådan udtømning om spredning af Vγ9Vδ2 celler svarede til dem observeret med CD25-udtynding. Alle sammen, disse resultater viser, at tregs ikke er involveret i nedsat proliferation af Vγ9Vδ2 celler i EOC.

Alternativt forskelle i

ex vivo

andele af naive og hukommelse Vγ9Vδ2 celle delmængder kunne være forbundet med den reducerede funktionalitet Vγ9Vδ2 EOC PBMC’er, som det er blevet observeret i andre kræftformer [12], [21], [22]. Heri fandt vi, at den naive delmængde blev signifikant reduceret i

ex vivo

LR EOC PBMC’er. Dette fald kan være blevet udløst af den gentagne antigenpriming af Vγ9Vδ2 celler

in vivo

under udviklingen af ​​sygdommen og med alderen, hvilket fører til en markant differentiering af naive celler til hukommelsescellen rum hos nogle patienter. De Vγ9Vδ2 celle frekvenser i

ex vivo

PBMC’er fra patienter kunne også være relateret til ineffektive Vγ9Vδ2 celle udvidelser. Data fra litteraturen om dette emne er divergerende. En sammenhæng mellem baseline procentdele af Vγ9Vδ2 celler i PBMC’er fra forskellige kræftpatienter og

ex vivo

ekspansion kapacitet er blevet etableret for nylig [12], mens en anden tidligere undersøgelse rapporterede ingen sammenhæng mellem de samme parametre i en stor kohorte af patienter med forskellige typer cancer [27]. Vores undersøgelse af EOC patienter understøtter den seneste observation af specifikt reducerede Vγ9Vδ2 celle frekvenser i

ex vivo

LR PBMC’er. Disse mangler i Vγ9Vδ2 PBMC’er kombineret med fald i andelen af ​​den naive delmængde, der er udstyret med proliferative kapaciteter [30], kan være delvis ansvarlig for de reduktioner i Vγ9Vδ2 celledeling, der blev observeret i nogle LR EOC PBMC’er. Notatet blev de perifere blod Vγ9Vδ2 celle frekvenser i EOC patienter ikke påvirket af kemoterapi og vi bekræftede en aldersbetinget fald i Vγ9Vδ2 celle frekvenser i EOC patienter, som blev observeret af andre forfattere i raske forsøgspersoner [31], [32]. Vigtigere, viste vi, at en Vγ9Vδ2 celle frekvens blandt

ex vivo

PBMC’er fra EOC patienter af 0,35% eller mindre var altid forbundet med ineffektive udvidelser i respons til BrHPP og til Zol. Disse data identificerer Vγ9Vδ2 celle frekvens i PBMCer fra 0,35% eller mindre som en unik biomarkør, der kan være nyttige til forudsigelse af ineffektive udvidelser af PBMC’er fra EOC patienter som reaktion på både konventionelle BrHPP- eller Zol-baserede γδ ekspansion protokoller.

Et andet vigtigt punkt behandlet i denne undersøgelse var forholdet mellem Vγ9Vδ2 celler og de kliniske resultater af EOC patienter, der blev behandlet med kirurgi plus platinbaseret kemoterapi. Platinderivater er blevet beskrevet som immunomodulatoriske forbindelser og kandidat immune biomarkører såsom ap T-celler er allerede blevet impliceret i virkningen af ​​disse anticancermidler [33], [34]. To studier i menneskelig avanceret ovariekarcinom har rapporteret, at tilstedeværelsen af ​​tumor-infiltrerende CD3

+ T celler er korreleret med forbedrede kliniske resultater hos patienter, der blev behandlet med kirurgi plus platinbaseret kemoterapi [35], [36]. Af disse to studier, har man også rapporteret en korrelation mellem tilstedeværelsen af ​​infiltrerende γδ T-celler og en kort sygdomsfrit interval efter behandling [36]. Men denne undersøgelse, der var baseret på en molekylær vurdering af TCRγ ved PCR-analyse, ikke diskriminere mellem Vγ9Vδ2 og andre γδ celler. Her vil vi vise, at EOC patienter med en nedsat perifert blod Vγ9Vδ2 celle frekvens på 0,35% eller derunder, som er korreleret kraftigt med et svækket Vγ9Vδ2 PBMC funktionel profil, er mere tilbøjelige til at være resistente over for platinbaseret kemoterapi og vise en kortere sygdomsfri overlevelsestid efter behandlingen. En multivariat analyse bekræfter, at denne reducerede frekvens er en uafhængig prædiktor for sygdomsfri overlevelse tid. Derfor kunne Vγ9Vδ2 cellefrekvensen i PBMC’er anvendes som prognostisk biomarkør i EOC patienter. Tilsammen understøtter vore observationer den konklusion, at resultater for kemoterapi-behandlede patienter er mere fordelagtige, når der ikke er nogen mangler i antal og funktionalitet af perifere blod Vγ9Vδ2 celler.