PLoS ONE: Beviser At Selen Binding Protein 1 Er en tumorsuppressor i prostata Cancer

Abstrakt

Selen protein 1 (SBP1, SELENBP1, hSP56) er en selen-associeret protein vist sig at være på lavere niveauer i tumorer og dens lavere niveauer er ofte prædiktive for en dårlig klinisk resultat. Skelne indolent fra aggressiv prostatakræft er en stor udfordring i forvaltningen af ​​sygdomme. Foreninger mellem SBP1 niveauer, tumor kvalitet og recidiv efter prostatektomi blev undersøgt ved duplex immunofluorescens billeddannelse ved hjælp af et væv microarray indeholder væv fra 202 prostatakræft patienter, som oplevede biokemiske (PSA) tilbagefald efter prostatektomi og 202 matchede kontrol patienter, hvis kræft ikke gentage sig. Prøverne blev modsvaret af alder, etnicitet, patologisk stadium og Gleason kvalitet, og billeder blev kvantificeret ved hjælp af Vectra Multispektralbilledteknik system. Fluorescerende mærker blev målrettet til SBP1 og cytokeratiner 8/18 at begrænse scoring til tumorceller, og celle til celle-kvantificering af SBP1 i kernen og cytoplasmaet blev udført. Nuklear SBP1 niveauer og den nukleare til cytoplasma forholdet blev omvendt forbundet med tumor klasse ved lineær regressionsanalyse. Efter klassificering af prøver i kvartiler baseret på SBP1 niveauer blandt kontroller, svulster i laveste kvartil var mere end dobbelt så tilbøjelige til at gentage sig i forhold til dem på anden kvartil. Inducerbar ektopisk SBP1 ekspression reduceret evne HCT-116 humane tumorceller til at vokse i blød agar, et mål for transformation uden at påvirke proliferation. Celler, der udtrykker SBP1 viste også en robust induktion i phosphorylering af p53 tumor suppressor i serin 15. Disse data indikerer, at tab af SBP1 kan spille en selvstændig spille en positiv rolle i prostatakræft progression og dets niveau kan være anvendelig til at skelne indolent fra aggressiv sygdom.

Henvisning: Ansŏng E, Ying Q, Ekoue DN, Deaton R, Hall AR, Kajdacsy-Balla A, et al. (2015) Bevis at selen Binding Protein 1 Er en tumorsuppressor i prostatakræft. PLoS ONE 10 (5): e0127295. doi: 10,1371 /journal.pone.0127295

Academic Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: 8. februar 2015; Accepteret: 13. april, 2015; Udgivet: 18 maj, 2015

Copyright: © 2015 Ansŏng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health (Grant # R01CA127943) til AMD og tilskud fra National Natural Science Foundation of China (Grant # 91229115 og 81272251) til WY

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest udbredte form for kræft blandt mænd med estimater på over 240.000 nye kræfttilfælde og 33.000 dødsfald i USA alene i 2011 [1]. Sygdommen findes primært blandt ældre mænd med ca. 91% af disse diagnosticeret med tumorer begrænset til det primære sted eller lokale lymfeknuder [2]. Tidlig påvisning af prostatakræft er forbedret dramatisk, men det bliver mere og mere klart, at behandling gives til en stor del af patienter, hvis sygdom var indolent, derfor have ringe indflydelse på deres sygelighed eller dødelighed [3]. I betragtning af de negative bivirkninger forbundet med prostatakræft behandlinger såsom radikal prostatektomi, hormonbehandling, brachyterapi og andre former for strålebehandling, er en stor udfordring i forvaltningen af ​​prostatacancer finde pålidelige midler til at skelne klinisk signifikant sygdom fra det, der er indolent og bedre ikke bliver behandlet. For at bidrage til denne indsats, har vi fokuseret på selen bindende protein 1 (SBP1, SELENBP1, hSP56), en selen-holdige protein, som udtrykkes i en række forskellige vævstyper, herunder hjernen, prostata-, lunge-, og tarmen. Form af selen i SBP1 er ukendt som er arten af ​​dets association: selen forbliver bundet til proteinet, når elektroforeret i SDS acrylamidgeler men dissocieres ved ekstreme pH-værdier [4]. Funktionen af ​​SBP1 også er ikke fastslået, men det kan være involveret i intra-Golgi transport [5], har vist sig at regulere HIF-1α [6] og er forbundet med to forskellige isoformer af von Hippel-Lindau-proteinet interagerer afubiquitinerende enzym 1, hvilket indikerer SBP1 kan have funktioner i proteinnedbrydning [6,7].

lav SBP1 niveauer er forbundet med dårlig klinisk resultat i flere kræfttyper. Dette blev først vist for lunge-adenocarcinomer, hvor lave niveauer af SBP1 var stærkt forbundet med dårlig overlevelse [8]. Efterfølgende blev lave niveauer af SBP1 ligeledes vist sig at være forbundet med dårlig prognose for ovarie [9], colon [10,11] og senest hepatocellulært carcinom [12]. Der vides kun lidt om SBP1 rolle i prostatacancer, selvom det er overudtrykt i normalt humant prostatavæv [13]. Her rapporterer vi om vurderingen af, om niveauet af SBP1 indikerer sandsynligheden for biokemisk recidiv for prostatakræft ved hjælp resultat væv microarrays, samt undersøgelser for at begynde at forstå SBP1 biologiske rolle i kræft.

Materialer og metoder

UIC kontor for beskyttelse af Research emner fastslået, at dette arbejde ikke opfylder definitionen på menneskelige emne forskning. Alle data fra humant væv blev analyseret anonymt.

Immunhistokemi

Prostatakræft udfald væv mikroarrays blev opnået fra Cooperative prostatakræft Tissue Ressource (CPCTR), en multi-institutionel konsortium til bank prostatektomi væv samt relevante patientdata, herunder demografi, kirurgisk patologi og opfølgning historie, under en række ensartede retningslinjer. Den CPCTR har indsamlet mere end 6.000 prostatakræft og kontrolprøver, den største samling af denne type væv findes i dette land med kliniske og patologiske udfald [14,15]. Arrayene anvendt i denne undersøgelse indbefatter væv kerner med 0,6 mm diameter, i fire eksemplarer, fra 202 mænd ( “cases”), der oplevede biokemisk tilbagefald (en enkelt post-kirurgi PSA værdi over 0,4 ng /ml eller to på hinanden følgende PSA’er over 0,2 ng /ml) efter prostatektomi og 202 ikke-tilbagevendende kontroller matchet på alder ved operation (+/- 5 år), årgang kirurgi, race, Gleason score (både primær og sekundær) og patologisk stadium. Væv på objektglassene blev blokeret med H

2O

2 blokerende reagens (Abcam) i 30 minutter, behandlet med et protein blokerende opløsning i 15 minutter ved stuetemperatur, skyllet og inkuberet med monoklonalt muse-anti-SBP-1-antistof (Cat # M061-3, MBL International.) og Ck8 /18 antistof (American Research Products), både ved en titer på 1: 100 i 60 minutter ved stuetemperatur. Objektglas blev skyllet i TBST i 5 minutter, og derefter behandlet med anti-muse Alexa Fluor 647 og anti-kanin Alexa Fluor 488-polymer i 20 minutter ved stuetemperatur. Objektglas blev skyllet i destilleret vand; Kernen blev modfarvet med DAPI, dehydreret gennem en alkohol-gradient og monteret med Micromount (Leica Microsystems). SBP1 og Ck8 /18 blev detekteret i farvede kerner ved multispektral scanning via Vectra kvantitativ billeddannende system (Perkin Elmer, Hopkinton, MA). Autofluorescens blev fjernet fra billeder og epitelial (tumor) områder af hver kerne blev identificeret ved Ck8 /18 farvning hjælp inForm (Perkin Elmer) machine learning algoritmer. Manuel redigering fjernet godartet epitel fra analysen. DAPI farvning blev anerkendt af softwaren som kernen i hver celle, og den cytoplasmatiske signal blev opnået ved prøveudtagning den peri-nukleare område. Inden for de tumor områder, vi eksporteret både nukleare og cytoplasmatiske data fra SBP1 kanal på en per-celle basis.

Statistisk analyse

De fluorescerende intensiteter af nukleare og cytoplasmatisk SBP1 blev vurderet for normalitet og log-transformeret til statistisk analyse. Patienterne blev inddelt i tre kategorier baseret på deres Gleason bedømmelse (kategori 1 = Gleason ≤6, kategori 2 = Gleason 7 (3 + 4) Kategori 3 = Gleason 7 (4 + 3) eller ≥8). Kerner med Gleason score 4 + 3 blev tildelt til kategori 3, den højeste Gleason gruppen, fordi dødeligheden for patienter med prostatakræft i Gleason score 4 + 3 er tre gange højere end 3 + 4 kræftformer Stark 2009 [16]. Sammenhængen mellem SBP1 niveauer og Gleason kategori blev vurderet ved hjælp af Wilcox Rank Sum test. Patient væv blev også tildelt kvartiler baseret på SBP1 intensitet blandt kontrolpersonerne. Betingede logistiske regressionsmodeller var monteret til at estimere odds ratio og 95% konfidensintervaller for risikoen for biokemisk tilbagefald for hver kvartil af SBP1. De betingede modeller indarbejdet justering for case-kontrol matchende variabler; yderligere modeller blev tilpasset med præ-kirurgisk PSA som kovariat, da PSA ikke var en matchende faktor. Alle data opnået under anvendelse af humant væv blev analyseret anonymt.

Plasmidkonstruktion

En doxycyclin-inducerbar SBP1 ekspressionskonstrukt blev genereret ved insertion af den

SBP1

åbne læseramme genereret af PCR-amplifikation ved hjælp af en tidligere genereret SBP1 konstruere som skabelon [17] og ligering ind i pRetroX-Tight-Pur vektor (Clontech, Mountain View, CA). Til amplifikation, en fremadrettet primer (5’ATAGCGGCCGCTACAGCATGGCTACGA AAT-3 ‘) og revers primer (5′-ACGAATTCGCTCAAATCCAGATGTCAGAGC-3’) blev anvendt, blev amplifikationsproduktet fordøjet med

NotI

EcoRI

og retningsbestemt ligeret ind i vektoren. Den inducerbare ekspressionssystem omfatter pRetroX-Tight-Pur-Teton-Advanced plasmid indeholdende Tet-On transaktivator gen. De Tet-On-genet koder for et protein, der binder til promotorområdet af pRetroX-Tight-Pur plasmidet og inducerer transkription af genet nedstrøms for promotoren som reaktion på doxycyclin. Den SBP1 genet blev indsat nedstrøms for doxycyclin responsiv promotor region i pRetroX-Tight-Pur plasmid giver den pRetroX-Tight-Pur-SBP1.

Cell Culture

HCT116 human coloncarcinom celle linje blev verificeret (Genetica DNA Lavoratories, Burlington, NC) og opretholdt i McCoys 5a medium (Mediatech, Manassas, VA), og den GP2-293 retrovirale pakkelinie blev opretholdt i DMEM-medium (Life Technologies, Carlsbad, CA). Alle medier blev suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO

2. Den selen koncentration af serum anvendte blev bestemt til at være 152 nM af grafit ovn atomabsorptionsspektrometri foretaget på Texas A M Veterinary Diagnostic Laboratory ved College Station, Texas. Både Tet-On transaktivator og SBP1 ekspressionskonstruktioner blev pakket ind i retrovirale partikler ved cotransfektion af hvert plasmid med p-VSV-G retroviral kuvert ekspressionskonstruktion i GP2-293 pakningscellelinie, og anvendes til at inficere HCT116 celler. Inficerede celler blev klonalt udvalgt i 400ug /ml G418 (Sigma) og 1 ug /ml puromycin (Sigma), ekspanderet og screenet for inducerbar SBP1 ekspression ved Western blotting efter behandling med 1.0ug /ml doxycyclin i 48 timer.

Western Blotting

Behandlede celler blev høstet ved lysis i 1x Cell lysis Buffer (Cell Signaling, Danvers, MA) indeholdende 1 mM PMSF (Cell Signaling). Lysater blev kogt i NuPAGE LDS prøvebuffer (Life Technologies) og 10x reduktionsmiddel (Life Technologies) i 5 minutter og påført en 4-12% gradient Bis-Tris denaturerende polyacrylamidgel (Life Technologies). Efter elektroforese blev proteiner overført til en Immobilon-FL membran (Millipore) via elektroblotting. Antistoffer mod følgende proteiner blev anvendt: SBP1 og GPX-1 (mus, MBL International, Woburn, MA), p-P53, (kanin, Cell Signaling), P53 (kanin, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), og β actin (kanin, Abcam, Cambridge, MA).

Cell Proliferation og vækst i halvfaste medier

Proliferation blev vurderet ved hjælp af FluoReporter Blå fluorometrisk dsDNA Kvantificering Kit (Invitrogen), der er baseret om anvendelse af en Hoescht 33258 fluorescerende plet til at måle mængden af ​​dobbeltstrenget DNA til stede i hver brønd på en plade med 96 som en indikator for mængden af ​​levende celler til stede på et givet tidspunkt. 5×10

2 celler blev udpladet i hver brønd i en sort, klar plade med bund 96 og behandles som anført (48, 96 og 144 timer). Dyrkningsmedium blev fjernet ved de udvalgte tidspunkter, og pladerne blev straks opbevaret ved -80 ° C indtil alle tidspunkter blev afsluttet. Plader blev optøet ved stuetemperatur og cellerne lyseret med destilleret vand for at ekstrahere cellulært DNA. Hoechst 33258 farvestof blev tilsat til hver brønd for at plette DNA, og fluorescens blev kvantificeret ved anvendelse af excitations- og emissionsfiltre ved 360 nm og 460 nm hhv. For at bestemme evnen af ​​SBP1 at påvirke væksten i halvfast medium, induceres cellerne til at udtrykke SBP1 samt SBP1-nul-celler blev behandlet med doxycyclin, blandet med medier indeholdende 0,4% agarose, og hver gruppe blev udpladet i tre eksemplarer på 6 brønds plader indeholdende 0,6% agarose i medier. Hver brønd indeholdt 5×10

4 celler, og kolonier større end 0,5 mm blev optalt på dag 15.

Resultater

Fluorescerende billeddannelse af SBP1 i human prostatacancer indikerer stærk nuklear lokalisering og sporadisk intraglandular udtryk

efter dårlig kvalitet og godartet-only kerner blev udelukket, kohorten til analyse omfattede væv fra 168 case-kontrol par. Eksempler på scannede kerner fra mikroarrayet er vist i figur 1. Stærkt variable nukleare SBP1 niveauer blev ofte observeret blandt epitelceller i samme kirtel, med tilstødende celler ofte viser varierende farvningsintensitet blandt de celler, der var SBP1-positive (Fig 1A). Desuden prostatavæv med også varieres med hensyn til cytoplasmatisk og nukleær farvning, som eksemplificeret i figur 1B 1C.

Et eksempel på billedet af en kerne opnået fra resultatet CPCTR væv microarray farvet med anti-SBP1 (rød) antistoffer efterfulgt af Alexa488 gede-anti-kanin og Alexa647 gede-anti-muse hhv. Kerner blev modfarvet med DAPI (blå). A er et eksempel på nukleare lokaliserede SBP1, B viser cytoplasmatisk SBP1, og C er et eksempel på en meget lav SBP1 ekspression i prostatavæv.

The SBP1 kerne og cytoplasma forholdet er omvendt korreleret med prostatacancer Gleason score

for at vurdere sammenhængen mellem SBP1 niveauer og Gleason score, patienter blev inddelt i tre kategorier baseret på deres Gleason bedømmelse (kategori 1 = Gleason ≤6, kategori 2 = Gleason 7 (3 + 4) Kategori 3 = Gleason 7 (4 + 3) eller ≥8). Analyse af SBP1 niveauer i prostatavæv viste, at den gennemsnitlige nukleare SBP1 signal i hver celle var signifikant lavere i kategori 3 end i kategori 2 (figur 2). Derudover nukleare: cytoplasma ratio på SBP1 var signifikant lavere i kategori 3 vs. kategori 1 (figur 3). Cytoplasmatisk og totale celle SBP1 niveauer blev ikke signifikant associeret med Gleason score, heller ikke var der en signifikant forskel mellem kategori 1 og 3.

Patienter i prostatakræft resultatet væv microarray blev uddelt i tre kategorier (Gleason Kategori) baseret på Gleason score (A). Mean kvantificerede væv SBP1 blev rangeret for alle patienter og tildeles en score fra 1 til 368 er baseret på relative SBP1 niveauer, hvor patienten med den laveste væv SBP1 fik en score på 1, og patienten med de højeste SBP1 niveauer modtaget en score på 368. Box-og-knurhår plots indikerer intervallet scoringer fra patienter i hver kategori (vertikale linjer) og vifte af første og tredje kvartil i hver kategori (feltet). Den vandrette linje inde i kassen angiver medianen. Associationen mellem SBP1 og Gleason Kategori blev bestemt under anvendelse SBP1 i kernen (B), cytoplasma (C) og total celle (D).

Patienterne i prostatacancer resultatet microarray blev fordelt i tre kategorier (Gleason Kategori) baseret på Gleason score (A). Middel kvantificerede væv SBP1 blev rangeret for alle patienter og tildeles en score fra 1 til 368 er baseret på relative SBP1 niveauer, hvor patienten med den laveste væv nukleare: cytoplasma ratio på SBP1 modtaget en score på 1, og patienten med den højeste andel modtaget en score på 368. Box-og-knurhår plots indikerer intervallet scoringer fra patienter i hver kategori (vertikale linjer) og vifte af første og tredje kvartil i hver kategori (feltet). Den vandrette linje inde i kassen angiver medianen.

Prostata kræftpatienter i laveste kvartil af SBP1 udtryk er signifikant mere tilbøjelige til at gentage sig efter radikal prostatektomi

For at afgøre, om der var en associering mellem SBP1 og biokemisk tilbagefald, SBP1 niveauer i kernen, cytoplasmaet, og total celle blev først analyseret under anvendelse af en parret t-test. Ingen signifikant forskel mellem tilbagevendende tilfælde og ikke-gentaget kontroller blev observeret. For at undersøge muligheden for en ikke-lineær sammenhæng mellem SBP1 udtryk og tilbagefald, blev prøverne alternativt fordeles i kvartiler baseret på væv SBP1 niveauer blandt kontroller. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, logistisk regressionsanalyse af interkvartile odds på prostatakræft tilbagefald viste, at patienter i den laveste kvartil af nukleare SBP1 niveauer signifikant mere tilbøjelige til at gentage sig end i nogen anden kvartil (tabel 1). Alle estimater blev justeret for PSA, Gleason kvalitet, scene, race, årgang kirurgi og alder ved diagnose.

Siden meget variable intracellulær SBP1 placering ofte blev observeret inden for de enkelte kerner, vi vurderet, om forholdet mellem kerne og cytoplasma SBP1 var relateret til sandsynligheden for biokemiske gentagelse. Patienterne blev tildelt kvartiler baseret på SBP1 kerne og cytoplasma ratio, og anslået odds ratio og 95% konfidensintervaller for sammenhængen mellem prostatakræft tilbagefald og hver kvartil blev opnået. Der var ingen evidens for en signifikant sammenhæng mellem kerne og cytoplasma-forhold på SBP1 og prostatakræft tilbagefald (tabel 2). En opfølgende analyse af den procentdel af SBP1 positive celler i en given kerne afslørede en reduceret sandsynlighed for fornyet blandt patienter i de højeste kvartiler sammenlignet med den laveste kvartil. Total celle procent positivitet blev ikke signifikant associeret med tilbagefald (S1 tabel). Tærsklen for positivitet blev defineret ved synligt påviselig intensitet.

Ektopisk udtryk for SBP1 ikke påvirke spredning af HCT116 celler, men hæmmer forankring uafhængig vækst

Prostatakræft tilbagefald efter radikal prostatektomi opstår, fordi den primære tumorer har allerede metastaseret før kirurgi. Anchorage uafhængig vækst er blevet valideret som et surrogat fænotype af metastatisk potentiale ved hjælp af genekspression signaturer [18]. For at undersøge SBP1 indvirkning på forankringsuafhængig vækst blev en doxycyclin-inducerbar SBP1 ekspressionskonstrukt indføres i HCT116 celler. Disse celler blev valgt på grund af deres mangel på detekterbar SBP1 ekspression, tilstedeværelsen af ​​et vildtype p53 (se nedenfor), og fordi de tidligere har været anvendt i at studere SBP1 funktion [19]. S1A Figur viser den robuste induktion af SBP1 i HCT116 TetSBP1 celler.

Udbredelsen af ​​HCT116 celler blev ikke signifikant påvirket af SBP1 udtryk (figur 4). HCT116 celler, som kun indeholder pRetroX-Tight-Pur-SBP1 plasmidet uden Teton transaktivator plasmid blev brugt til at kontrollere for doxycyclin effekter på spredning og blev dyrket i takt med de TetSBP1 celler, ved hjælp af forskellen i væksten mellem kontrol- celler med og uden doxycyclin på hver gang at justere TetSBP1 spredning af data. For at gøre dette er det fluorescerende rapporterede vækst af doxycyclin behandlet HCT116-TetSBP1 celler (fluorescerende enheder, FU) blev divideret med forskellen i FU ses mellem doxycyclin behandlede og ikke-behandlede kontrolceller. At bestemme evnen af ​​SBP1 at påvirke væksten i halvfast medium, blev HCT116-TetSBP1 celler, der udtrykker SBP1 (+ Dox) samt SBP1-null (-Dox) celler suspenderet i 0,4% agarose, inkuberet, og kolonier optælles 15 dage efter plating. SBP1 reducerede signifikant cellernes evne til at vokse i halvfast medium (Fig 5)

HCT116-TetSBP1 celler med (+ Dox) og uden (-Dox) SBP1 blev dyrket i 6 dage på en 96 brønd plade. Cellerne blev behandlet med 1 ug /ml doxycyclin 48 timer før 0 timers tidspunktet. Fem hundrede celler blev podet i tre eksemplarer 24 timer før 0 timers tidspunktet. Fluorescensmærket dsDNA fra hver brønd i en plade med 96 blev kvantificeret ved fire tidspunkt punkter-0, 48, 96 og 144 timer og fejlsøjler repræsenterer standardafvigelser på hvert tidspunkt.

Evnen af HCT116 celler med og uden SBP1 at danne kolonier i blød agar blev målt. Celler induceret til at udtrykke SBP1 samt SBP1-nul-celler blev blandet med medier indeholdende 0,4% agarose, og hver gruppe blev udpladet i tredobbeltbestemmelse på plader med 6 brønde overtrukket med 0,6% agarose i medierne. Hver brønd indeholdt 5×10

4 celler, og kolonier større end 0,5 mm blev talt på dag 15 i vækst (A). Fejl- søjler repræsenterer S.D. (* P 0,05 n = 3)

SBP1 ændrer ikke udtryk for glutathionperoxidaser-1 4, Thioredoxin reduktase-1 eller NF-ĸB

En mulig forklaring på den undertrykkende virkning af SBP1 på forankringsuafhængig vækst er, at den påvirker niveauerne af selenoproteiner som har været impliceret i onkogen signalering via ændring af niveauerne af reaktive oxygenarter (ROS). For at undersøge denne mulighed blev lysater fra HCT116 TetSBP1 celler med og uden SBP1 induktion immunblottet under anvendelse af antistoffer mod TrxRD1, GPX-1, og GPX-4. Disse tre selenoproteiner er antioxidanter impliceret i ætiologien af ​​flere cancertyper [20]. SBP1 ændrede ikke niveauerne af nogen af ​​de undersøgte (S1B og S1c Fig) selenoproteiner, heller ikke påvirker niveauet af ROS følsomme transskription faktor NF-ĸB (S1A Fig).

SBP1 sensibiliserer celler til 5 -Fluorouracil

En anden mulig forklaring på sammenhængen mellem aggressiv prostatakræft og lav nukleare SBP1 er, at tumorceller, som typisk oplever høj kromosomal ustabilitet, har overlevelse fordel, når der er lav nukleare SBP1. For at undersøge, om SBP1 påvirkede celle respons på DNA beskadigelse blev HCT116-celler behandlet med 5-fluoruracil (5-FU), som blokerer syntesen af ​​thymidin og fører til DNA-beskadigelse [21,22]. SBP1 blev induceret i HCT116 TetSBP1 celler med doxycyclin og dyrket på plader med 96 brønde i 6 dage og samples ved 48 timers tidspunkter samtidig med SBP1-null kontrolceller på den samme 5um koncentrationen af ​​5-FU. Celler, der udtrykker SBP1 var mere følsomme over for 5-FU eksponering (figur 6).

Væksten af ​​HCT116-TetSBP1 celler blev målt efter en 6 dages behandling med 5um 5-FU. Dobbeltstrengede DNA blev målt som indikator for cellevækst ved fire tidspunkt punkter-0, 48, 96 og 144 timer og fejlsøjler repræsenterer standardafvigelse ved hvert tidspunkt (* p 0,05, ** p 0,01). Fem hundrede celler blev podet i tre eksemplarer 24 timer inden 0 timers tidspunktet, og fluorescensmærket dsDNA fra hver brønd i en plade med 96 blev kvantificeret efter cellerne blev lyseret, mens den stadig er fastgjort til pladen.

SBP1 inducerer phosphorylering af p53 i serin 15

Tidligere arbejde har beskrevet involveringen af ​​p53 i det cellulære respons på 5-FU [23,24]. Grund af mulighederne i SBP1 at sensibilisere cellerne til 5-FU, undersøgte vi, om SBP1 påvirker phosphorylering af serin 15 (Ser15) på p53, som er en post-translationel modifikation kræves for at aktivere p53-afhængige DNA beskadigelse respons [25]. Western blotting af ekstrakter fremstillet ud fra HCT116 celler ikke afsløre phosphoryleret p53-Ser15 (Fig 7A). Imidlertid induktion af SBP1 resulterede i robust phosphorylering af p53 på Ser15 (figur 7A). Det fremgår, at stimuleringen af ​​phosphoryleringen af ​​p53 på Ser15 faldt sammen med et fald på total p53 (figur 7B).

Total celleekstrakter fra doxycyclin behandlet eller ikke-behandlet HCT116-TetSBP1 celler blev analyseret ved anvendelse immunobloting for ændringer i phosphoryleret Ser15 på p53 (A) og total p53 (B) niveauer som respons på induktion af SBP1 anvendelse af anti-human SBP1, phospho p53-Ser15, p53, og p-actin-antistoffer. β-Actin blev anvendt som en endogen kontrol.

Diskussion

Sammenhængen mellem SBP1 og prostatakræft aggressivitet blev undersøgt, fordi, tidligere undersøgelser rapporteret lavere SBP1 niveauer blev forbundet med dårlig klinisk resultat af patienter med flere andre typer cancer (oversigt i [26]). Sammenhængen mellem SBP1 niveauer og flere kliniske funktioner i prostatakræft blev undersøgt ved hjælp af prostatakræft væv microarrays designet til at identificere variabler, der påvirker patientens udfald. Når en mulig sammenhæng mellem SBP1 niveauer og Gleason score blev undersøgt, blev de samlede SBP1 niveauer ikke forbundet med Gleason score, i overensstemmelse med vores tidligere western blot undersøgelse af 24 prostatektomi Prøverne [27]. Men i de data til stede i dette manuskript, der var en statistisk signifikant lavere SBP1 nukleare: cytoplasmatisk forhold i væv kategoriseret som højere lønklasse prostatakræft (kategori 3) i forhold til væv kategoriseret som lavere kvalitet (kategori 1). I den efterfølgende analyse af biokemisk tilbagefald, blev den cellulære placering af SBP1 også anvendes i analysen af ​​vævet array, hvilket indikerer, at patienter i den laveste kvartil af nuklear SBP1 ekspression var signifikant mere tilbøjelige til at gentage sig end dem i ethvert andet kvartil. Den mekanistiske betydning af den cellulære opdeling af SBP1 forbliver ukendt, og ingen kendt enzymatisk aktivitet er blevet tilskrevet dette protein. Det er muligt, men at ændringer i SBP1 s rapporterede interaktion og mulige modulerende påvirker på ikke-nukleare proteiner såsom GPX-1 og VDU1, bidrage til SBP1 biologiske funktion (er).

For at undersøge de molekylære mekanismer hvorved SBP1 kan påvirke kræft aggressivitet, vi ektopisk udtrykte det i dyrkede celler, som ikke udtrykker nogen påviselig SBP1. Induktion af SBP1 i disse celler reducerede deres evne til at vokse i halvfaste medier uden at påvirke cellernes proliferative egenskaber. Mens SBP1 tidligere er blevet vist at undertrykke forankringsuafhængig vækst i både PC3 og LNCaP human prostata tumorafledte cellelinier, SBP1 inhiberede proliferationen kun af PC3 og ikke LNCaP-celler [6]. Som et led i vores bestræbelser på at få en forståelse af den mekanisme, hvormed SBP1 forårsagede de observerede fænotyper, en robust induktion i phosphorylering af p53 på Ser15 blev observeret (Fig 5). Som for nylig udvidet på, kan fosforylering af p53 på Ser15 påvirke en bred række p53-medierede funktioner, herunder cellecyklus arrest, samt svar på DNA-skader og andre belastninger [28]. Det er derfor tænkeligt, at i det mindste nogle af konsekvenserne af tabet af SBP1 udtryk, der ofte ledsager ondartet progression kunne være medieret gennem en reduktion af p53 phosphorylering på dette websted, og de forskellige virkninger af SBP1 på HCT116, PC3 og LNCaP kan skyldes til dennes anden egenskab af p53 i disse celler; HCT116 og LNCaP har funktionelt p53 mens PC3 ikke [29,30]. Tilsvarende kan p53-afhængige processer være involveret i forøgelsen af ​​følsomhed over for 5-FU observeret, når HCT116-celler blev induceret til at udtrykke SBP1. Brug flercellede sphæroider at studere 5-FU modstand i kolorektal cancer celler, Lee et al. rapporterede, at SBP1 differentielt blev udtrykt i 5-FU-resistente celler, og disse forfattere foreslået, at SBP1 kan være en hidtil ukendt biomarkør for 5-FU kemoresistens [31]. Dataene præsenteres heri, sammen med tidligere undersøgelser, der har rapporteret om virkningerne af SBP1 i dyrkede celler eller den hyppige tab af SBP1 i humane kræftformer, kollektivt støtter idéen om en medvirkende rolle SBP1 tab i kræft progression.

kosten selen har været forbundet med nedsat risiko for prostatakræft i humane epidemiologiske undersøgelser [32], selv om resultaterne af SELECT selen tilskud forsøg fastslået, at give lave doser af selen til ældre mænd på gennemsnitlig risiko i Nordamerika reducerede ikke prostatakræft forekomst [33]. Den mekanisme, hvorved indtagelsen af ​​selen kunne tænkes at forhindre prostatakræft er fortsat ukendt, men det kan indebære selen s påvirker på selen-holdige proteiner, hvoraf flere har været impliceret i risikoen for kræft og andre sygdomme som følge af sammenslutningen af ​​specifikke genetiske polymorfier med risiko for sygdom [34,35]. Virkningerne af selen forbrug på SBP1 eller nogen af ​​de selenocystein-holdige selenoproteiner fortsat ukendt. Men oplysninger om sandsynligheden for prostata kræftpatienter tilbagevendende efter prostatektomi er af afgørende betydning i bestræbelserne på at forhindre unødvendige behandling for mænd med indolente tumorer. Fremtidige undersøgelser bør overveje den prognostiske anvendelighed undersøge SBP1 niveauer i prostata væv og yderligere at undersøge, om SBP1 tab bidrager til sygdomsprogression.

Støtte Information

S1 Fig. SBP1 ekspression ændrer ikke niveauerne af GPX-1, GPX-4, NF-ĸB eller TrxRD1.

Total celleekstrakter fra doxycyclin behandlet eller ikke-behandlet HCT116-TetSBP1 celler blev analyseret ved anvendelse af immunoblot for ændringer i NF-ĸB ( A) og TrxRD1 (B) niveauer som respons over for doxycyclin afhængig induktion af SBP1. Anti-humant SBP1 blev TrxRD1, NF-ĸB og p-actin-antistoffer anvendes til påvisning af protein niveauer. p-actin blev anvendt som en endogen kontrol. Kontrol celler indeholder kun pRetroX-SBP1 plasmidet uden transaktivator

doi:. 10,1371 /journal.pone.0127295.s001

(TIF)

S1 Table. Prostata cancer patienter med højere procentdel af positive nukleare og cytoplasmatisk SBP1 farvning i deres prostata tumorer var mindre tilbøjelige til at gentage sig.

Odds ratio (OR) og 95% konfidensintervaller (CI) for prostatakræft recidiv med kvartil af procentdelen af ​​positive nukleare og cytoplasmatisk SBP1 farvning. Positivitet blev defineret ved synligt detekterbar intensitet, og kvantificeres ved hjælp af mål opnået ved VECTRA kvantitativ billeddannende system. Alle OR estimater er korrigeret for PSA, Gleason kvalitet, tumor stadie, og patientens alder ved diagnose

doi:. 10,1371 /journal.pone.0127295.s002

(DOCX)