PLoS ONE: Differential Angivelse af Phospholipase C Epsilon 1 er associeret med kronisk atrofisk gastritis og gastrisk Cancer

Abstrakt

Baggrund

Kronisk betændelse spiller en kausal rolle i gastrisk tumor initiering. Identifikationen af ​​prædiktive biomarkører fra gastrisk betændelse til tumorigenese vil hjælpe os til at skelne mavekræft fra atrofisk gastritis og etablere diagnosen tidlige fase mavekræft. Phospholipase C epsilon 1 (PLCε1) er rapporteret at spille en afgørende rolle i inflammation og tumorigenese. Denne undersøgelse havde til formål at undersøge den kliniske betydning af PLCε1 i initiering og progression af mavekræft.

Metodologi /vigtigste resultater

For det første mRNA og protein udtryk for PLCε1 blev analyseret ved revers transkription -PCR og vestlige blotting i normale gastrisk slim epitelcelle linje GES-1 og gastrisk cancer cellelinjer AGS, SGC7901, og MGC803. Resultaterne viste både mRNA og protein niveauer af PLCε1 blev opreguleret i gastriske cancerceller sammenlignet med normale gastriske mukøse epitelceller. For det andet blev dette resultat bekræftet ved immunhistokemisk påvisning i et væv microarray herunder 74 parrede mavekræft og tilstødende normalt væv. For det tredje, en uafhængighed immunhistokemisk analyse af 799 kroniske atrofisk gastritis vævsprøver viste, at PLCε1 udtryk i atrofisk gastritis væv blev nedreguleret siden PLCε1 udtryk var negativ i 524 (65,6%) atrofisk gastritis. Desuden blev matchet kliniske væv fra atrofisk svær gastritis og gastriske cancerpatienter anvendes til yderligere at bekræfte de tidligere resultater ved at analysere mRNA og protein niveauer ekspression af PLCε1 i kliniske prøver.

Konklusioner /betydninger Salg

Vores resultater foreslog, at PLCε1 protein kan være en potentiel biomarkør for at skelne mavekræft fra betændelse læsion, og kunne have stort potentiale i applikationer såsom diagnose og præ-advarsel om den tidlige fase mavekræft

Henvisning:. Chen J Wang W, Zhang T, Ji J, Qian Q, Lu L, et al. (2012) Differential ekspression af Phospholipase C Epsilon 1 er associeret med kronisk atrofisk gastritis og Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (10): e47563. doi: 10,1371 /journal.pone.0047563

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: Juni 22, 2012; Accepteret: September 18, 2012; Udgivet: 15 oktober, 2012 |

Copyright: © Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Key Basic Research Program Kina (973 Project) (2010CB933900), New Century Excellent Talent af Undervisningsministeriets Kina (NCET-08-0350), Særlige infektionssygdomme Key Projekt Kina (2009ZX10004-311), National Natural Science Foundation of China (31170961 og 31100717), Shanghai Videnskab og Teknologi Fund (12ZR1415800) og Shanghai Jiao Tong University Fund Innovation for kandidater (Z-340-007). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gastric kræft er den fjerde almindelige tumorer i verden. Forekomsten af ​​mavekræft er støt stigende på grund af de seneste ændringer af livsstil og kostvaner vaner i Kina [1]. Som for gastrisk cancer, overlevelsesrater afhænger af tidlig diagnose af sygdommen. Typisk er det ældre en cancer opdages og diagnosticeret, vil den mere vellykket behandling være. Derfor er det meget vigtigt at forbedre satserne for tidlig diagnose og tidlig behandling for mavekræft. Vi har forsøgt at etablere en tidlig mavekræft pre-varslingssystem baseret på genekspression microarray analyse siden 2005 [2]. I mellemtiden har vi også håbede at finde de tidlige gastriske kræftceller

in vivo

af multi-mode målrettet billeddiagnostiske teknikker [3] – [7]. Men mangler af biomarkør for mavekræft er stadig den største hindring for tidlig diagnose.

I dag er det godt accepteret, at

Helicobacter pylori

(

H. Pylori

) skuespil en kausal rolle i at udløse kronisk inflammation (gastritis), der fører til malignitet, og er blevet klassificeret som et konkret kræftfremkaldende for mennesker af International Agency for Research on Cancer (IARC) [8] – [10]. Desuden er baseret på de histologiske forskelle mellem kronisk gastritis og gastrisk cancer, tidlige fase mavekræft er ofte påvises ved endoskopi. Således kan undersøgelse af de molekylære og biologiske ændringer, herunder genamplifikation og aktiveringer, der opstår fra kronisk gastritis til mavekræft, give nogle nye indsigter i patologien af ​​denne sygdom og nye prognostiske markører. Men ajour, der er få rapporter om adressering særlige biomarkører, der kan skelne gastrisk betændelse fra gastrisk tumorigenese.

phosphoinositid-specifik phospholipase C (PLC) repræsenterer en stor familie, der katalyserer hydrolysen af ​​phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphat i to vitale second messengers, diacylglycerol og inositol 1,4,5-triphosphat, som omfatter seks familier af pattedyr-PLC isoformer (β, γ, δ, ε, f-og η) [11] – [13]. Blandt dem, PLCε er et nyligt identificeret medlem af PLC familien [12]. Det er en vigtig nedstrøms effecter af Ras familie små GTPaser: Ras, Rap1, og Rap2 [12], [14], [15]

For nylig rapporterede meget værker, PLCε1 spillet en afgørende rolle i tumorigenese og. betændelse. PLCε1 udtryk har vist sig at korrelere med human blærecancer, og knockdown af PLCε1

in vitro

in vivo

hæmmede blære tumor vækst [16], [17]. Det er desuden blevet rapporteret, at PLCε1 er overudtrykt i hudkræft [18]. I PLCε

– /- mus, udviste markant modstand mod tumordannelse og til 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) -induce hudinflammation [18], [19]. Efterfølgende undersøgelser viste, at PLCε spillede afgørende roller i spontan intestinal tumorigenese med forøgelse af angiogenese og inflammation ved hjælp af adenomatøs polypose coli (APC)

Min /+ mus model [20].

Desuden PLCε krævedes i aktivering af cytokinproduktion i ikke-immune hudceller i en række inflammatoriske reaktioner, og denne vigtige funktion af PLCε blev yderligere bekræftet i transgene mus overudtrykker PLCε [21], [22]. På den anden side blev PLCε påkrævet for tumornekrosefaktor (TNFa) -induceret chemokin (C-C-motivet) ligand 2 (CCL2) ekspression i humane keratinocytter og samarbejder med nuklear faktor kappa B (NF-KB) pathway [23]. En sådan funktion af PLCε i inflammation er unik blandt PLC isozymer [13].

For nylig har to enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) rs2274223 og rs11187870 i PLCε1 loci blevet identificeret som en ny modtagelighed locus for mavecancer i kinesisk befolkning ved genom bred gen-forening analyse (GWAS) [24] – [26]. Disse resultater bekræftede associationen mellem PLCε1 og risikoen for gastriske cancere.

I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionsmønsteret for PLCε1 i humane gastriske væv, herunder normale, atrofisk gastritis, og tumorvæv, og foretaget en hypotese om rolle PLCε1 i kronisk inflammation og tumorigenese af gastrisk cancer. Sammenlignet med normale væv, fandt vi, at PLCε1 protein blev stærkt udtrykt i gastrisk kræft væv, mens det blev nedreguleret i atrofiske gastrisk væv. Vores resultater tyder på, at PLCε1 kan være en potentielt lovende biomarkør til at skelne mavekræft fra atrofisk gastritis og kan være en potentiel biomarkør til diagnosticering af tidlige fase mavekræft.

Materialer og metoder

Etik Udtalelser

undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité af Sun Yat-sen University Cancer center og den etiske komité i First Affiliated Sygehus af Shanghai Jiao Tong University, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver emne.

Cellelinjer

De SV40-transformerede udødelige gastriske epitel celle GES-1 blev bevaret i vores institut og vedligeholdes som anbefalet [27]. Tre gastrisk cancer cellelinjer AGS, SGC7901 og MGC803 blev opnået fra Chinese Academy of Sciences Cell Bank of Type Culture Collection og holdt i vores laboratorium. Alle cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Sigma Chemical, St. Louis, MO), 100 enheder /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin. Cellerne blev holdt ved 37 ° C i et fugtigt kammer med 5% CO

2.

RNA-ekstraktion og revers transkription-PCR

Totalt RNA fra celler og væv prøver blev ekstraheret under anvendelse den Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger. Den ekstraherede RNA blev forbehandlet med RNase-fri DNase, og 2 ug RNA fra hver prøve blev anvendt til cDNA-syntese primet med vilkårlige hexamerer. Til PCR-amplifikation af PLCε1 cDNA, en første amplifikation ved anvendelse PLCε1-specifikke primere blev udført med et denatureringstrin ved 95 ° C i 10 min efterfulgt af 30 denatureringscykler ved 95 ° C i 60 s, primerannealing ved 55 ° C i 30 s, og primerforlængelse ved 72 ° C i 30 s. Ved afslutningen af ​​cykling trin, en endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 min blev udført, inden reaktionen blev standset, og opbevaret ved 4 ° C. Ekspressionssystemer data blev normaliseret til det geometriske gennemsnit af husholdning glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) gen for at kontrollere variationen i ekspressionsniveauer. Revers transkription-PCR er designet ved hjælp af Primer Express Software version 3.0 (Applied Biosystems). Sekvenserne af sense- og antisense-primere var som følger: 5′-GCAAGAAGTGGCCTTCTCAG-3 ‘(F) og 5′-GAACTTGAAGGGAGGGCATT 3′ (R) for PLCε1, 5’-GCTCCTCCTGAGCGCAAG-3 ‘(F) og 5’- CATCTGCTGGAAGGTGGACA -. 3 ‘(R) for GAPDH

Western Blotting

Celler blev høstet i prøvetagning buffer [62,5 mmol /L Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% glycerol og 5% 2-h-mercaptoethanol]. Alle friske væv blev jordet til pulver i flydende nitrogen og derefter lyseret med prøveudtagning puffer. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-assay (Bio-Rad Laboratories). Lige store mængder proteiner blev påført på 9% polyacrylamid SDS geler (SDS-PAGE), adskilt elektroforetisk, og overført til polyvinyliden fluorid membraner (Amersham Pharmacia Biotech). Membranen blev inkuberet med anti PLCε1 kaninantistof (1:250; Sigma). PLCε1 ekspression blev påvist med peberrodsperoxidase-konjugeret gede anti-kanin IgG (1:2,000; Amersham Pharmacia Biotech) og en forøget kemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech) i overensstemmelse med producentens instruktioner. β-actin detekteret med et anti-β-actin kaninantistof (1:1,000 fortynding Sigma) blev anvendt som lastning kontrol Salg

Patienter, vævsprøver og Tissue Microarray

Patienter med atrofisk. gastritis og kræft blev udvalgt fra patienter, der blev planlagt til øvre gastrointestinal endoskopi for rutinemæssig screening for mavekræft på First Affiliated Sygehus af Shanghai Jiao Tong University og Sun Yat-sen University cancer center fra januar 2003 til december 2009. Vi ekskluderede patienter, som havde modtaget midler mod mavesår eller antibiotika i op til to måneder før undersøgelsen, og dem, der havde historier af mavekræft, gastrisk eller duodenal ulcus eller gastrisk kirurgi. . Hematoxylin og eosin (H Sigma) natten over ved 4 ° C. Normalt gedeserum blev anvendt som en negativ kontrol. Efter vask blev vævssnit behandlet med biotinyleret anti-kanin sekundært antistof (Zymed) efterfulgt af yderligere inkubation med streptavidin-peberrodsperoxidase-kompleks (Zymed). Vævssnit blev derefter nedsænket i 3, 3′-diaminobenzidin og kontrastfarvet med 10% Mayers hæmatoxylin, dehydreret, og monteret.

Scoring af PLCε1 Immunhistokemi

PLCε1 immunoreaktivitet blev evalueret uafhængigt af 3 patologer ( WW, QQ og LL), som blev blindet for patientresultater. Procentdelen af ​​positivt farvede celler og intensiteten af ​​farvning af celler blev bestemt ved hver observatør, og gennemsnittet af 3 scoringer blev beregnet. Vi valgte tilfældigt 10 high-power felter (forstørrelse, × 400; 100 celler pr high-power field) og tælles 1000 celler. Når gennemsnittet af den procentvise PLCε1-positive celler er tæt på 0% eller 100%, standardafvigelsen (SD) er tæt på 0; og, når middelværdien er ca. 50%, SD er cirka 5%. Således ikke SD ikke stige, når middelværdien. I denne undersøgelse blev PLCε1 ekspression gradueret som følger: væv med positiv cytoplasmatisk farvning i ≤25% af celler blev gradueret negativ, og væv med positiv cytoplasmatisk farvning i 25% af cellerne blev bedømt positive [30]

statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 17.0 statistisk programpakke. Wilcoxon-test blev anvendt til at analysere de matchede gastriske tumorer væv i væv microarray. Testen og Fishers eksakte test, der anvendes til at analysere dem, gastrisk cancer og svær atrofisk gastritis, og også blev udført for at bestemme betydningen af ​​forholdet mellem PLCε1 ekspression og clinicopathologic karakteristika. Hvert eksperiment blev udført uafhængigt mindst to gange med lignende resultater.

s

. 0,05 i alle tilfælde blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

opreguleret ekspression af PLCε1 i gastrisk kræftcellelinjer

For det første, vi opdaget mRNA og protein ekspression af PLCε1 i forskellige gastriske cellelinjer (figur 1). Revers transkription-PCR-analyse og Western blotting-analyse blev udført på disse prøver stammer fra normale gastriske mukøse celler GES-1 og tre mavekræft cellelinier AGS, SGC7901 og MGC803. Vi fandt, at alle gastrisk cancer cellelinjer afslørede højere PLCε1 udtryk end i normale gastrisk celle kontrol ved både mRNA og protein niveauer.

A, udtryk for PLCε1 mRNA i gastrisk normal cellelinje GES-1 og kræft cellelinjer SGC7901 , MGC803 og AGS ved revers transkription-PCR. B, udtryk for PLCε1 protein gastrisk normale cellelinjer GES-1 og kræft cellelinjer SGC7901, MGC803 og AGS ved Western blotting.

PLCε1 er opreguleret i Gastric Cancer Læsioner men nedreguleret i Atrofisk Gastritis Læsioner

Derefter undersøgte vi rolle PLCε1 i både tumor og normalt væv i en gastrisk cancer væv microarray. Som vist i figur 2 observerede vi, at både tumor og normale væv demonstrerede den positive ekspression af PLCε1. Men som vist i tabel 1, havde væv microarray dataanalyse vist, at procentdelen af ​​PLCε1 positiv ekspression i tumorvæv er betydeligt højere end den tilstødende normale væv ved Wilcoxon test analyse (73,0% versus 20,3%,

s

. 0,01)

Repræsentative billeder fra immunhistokemisk analyse af 74 arkiverede mavekræft og 799 atrofisk gastritis sager. A, oversigt over vævet microarray ved immunfarvning af antistof PLCε1. Boxed biopsier er vist i detaljer i (B og C). B og C matches tumor og tilstødende normale væv fra samme patient. Patienten er pTNM stadie III med dårligt differentieret adenocarcinom. Både tumor (B) og tilstødende normale (C) celler er positive for PLCε1. Repræsentant immunhistokemiske (D) /histologiske (G) observationer i en atrofisk gastritis væv, Repræsentant immunhistokemiske (E) /histologiske (H) observationer i en gastrisk normalt væv, Repræsentant immunhistokemiske (F) /histologiske (I) observationer i en gastrisk cancer væv . (Original forstørrelse, × 2 for B og C, × 200 for D, E, F, G, H og I).

For at bestemme PLCε1 udtryk i betændelse miljø, vi udvidet PLCε1 immunohistokemisk analyse under anvendelse af et andet uafhængigt sæt paraffinindlejrede vævssnit af 799 atrofisk gastritis vævsprøver. De immunohistokemiske resultater viste, at PLCε1 ekspression var positiv i 275 (37,0%) atrofisk gastritis herunder 106 (37,7%) mild atrofisk gastritis, 98 (26,0%) moderat atrofisk gastritis og 71 (28,1%) i svær atrofisk hhv. Desuden blev PLCε1 ekspression korrelerede med graden af ​​atrofi (

s

= 0,036) (se tabel 2). Derfor sammenlignes med tumor og normalt væv, havde atrofisk gastritis prøver faldt PLCε1 udtryk (

s

0,001) (se tabel 2)

Vi bekræftede derefter disse immunhistokemisk væv microarray. resultater efter revers-transkription-PCR og Western blotting-analyse af tre parret af mavekræft og tilstødende normale væv og tre parret af alvorlig atrofisk gastritis og tilstødende normale væv, der blev taget fra den samme patient. Sammenlignet med tilstødende normale væv, tre undersøgte gastriske tumorer viste opregulering af PLCε1 ekspression både mRNA og protein niveauer, men alle alvorlige atrofisk gastritis væv havde en lavere ekspression af PLCε1 (se Figure.3). I overensstemmelse med resultaterne af immunhistokemisk væv microarray analyse, viste også den parrede analyse PLCε1 var overudtrykt i tumor, men nedreguleret i alvorlige atrofisk gastritis i sammenligning med de matchede tilstødende normale væv.

A og C ekspression af PLCε1 mRNA og protein i hver af de gastriske tumorer (T) og gastriske tilgrænsende normale væv (N) parret fra den samme patient ved revers transkription-PCR og western blot. B og D, ekspression af PLCε1mRNA og protein i hver af de alvorlige atrofisk gastritis (S) og gastriske tilgrænsende normale væv (N) parret fra den samme patient ved revers transkription-PCR og Western blotting.

Disse observationer foreslog, at PLCε1 udtryk status var meget anderledes i forbindelse med betændelse versus tumorigenese. Vores resultater foreslå meget, at vores resultater meget tyder på, at PLCε1 protein kunne være en potentiel biomarkør for mavekræft.

Korrelationer mellem PLCε1 og Clinicopathologic Features

Der er ingen statistisk signifikant forskel på PLCε1 udtryk i clinicopathologic data, såsom alder, køn, tumorstørrelse, klassificering, klinisk fase, mellem patienter på forskellige stadier af mavecancer i vævet microarray (vist i tabel S1).

Især som vist i figur 2, PLCε1 proteinekspression i cytoplasmaet blev hyppigt fundet alle tumorvæv, normale væv men mindre hyppigt i atrofisk gastritis væv.

som vist i figur 4, i vævet microarray, positiv PLCε1 ekspression blev observeret, i inflammatoriske celler og lymfocytter i 13 (48,1%) hosliggende normale vævsprøver fra lymfeknude metastaser (N0) gastrisk kræftpatienter (vist i figur 4A). Endvidere i alvorlige atrofisk gastritis væv, viste 6 (2,37%) prøver positive PLCε1 ekspression i inflammatoriske celler eller lymfevæv (figur 4B). Således er disse resultater antyder, at ekspressionen af ​​PLCε1 kan være forbundet med inflammatoriske celler invasion under tumorigenese og tumormetastaser.

repræsentant immunhistokemisk (A) /histologiske (B) bemærkninger i en gastrisk normalt væv, repræsentant immunhistokemisk (C ) /histologiske (D) observationer i en atrofisk gastritis væv. Pile angiver positivt farvede immunceller (Original forstørrelse, × 200).

Diskussion

Her vores undersøgelse først viste, at PLCε1 var opreguleret i humane gastrisk tumorvæv, men blev nedreguleret i inflammation miljø, sammenlignet med normale væv. Den differentielle udtryk for PLCε1 i forskellige væv meget foreslået, at ekspressionen af ​​PLCε1 kunne spille en central rolle i inflammation og tumorigenese.

Inflammation er anerkendt som en vital bestanddel af det lokale miljø opretholde tumor udvikling, herunder initiering, promotion , malign omdannelse, invasion og metastase [31]. En kausal sammenhæng mellem gastrisk tumor fremme og betændelse er blevet støttet af de indlæg, at betændelse forårsaget af

Helicobacter pylori

infektion kan øge risikoen for tumorpromotion [8] – [10]. For nylig har adskillige rapporter vist, at PLCε1 ekspressionsniveauer er stærkt associeret med inflammation og tumorigenese [19] – [21], [23]. Men den molekylære mekanisme, der ligger den biologiske betydning af PLCε1 i gastrisk cancerudvikling og progression uklart. Vores undersøgelse har dokumenteret, at PLCε1 opregulering kan være vigtigt i udviklingen af ​​mavekræft. Især dens nedregulering i betændelse miljø, meget foreslået at PLCε1 kan være en vigtig biomarkør, og kan anvendes til at skelne mavekræft status fra atrofisk læsion scenen.

Desuden er der i vores arbejde, PLCε1 protein kan være påvist i inflammatoriske celler og lymfocyt væv i nogle tilstødende normale væv hos n0 grad og nogle alvorlige atrofisk gastritis væv. I pattedyr er PLCε1 rapporteret at blive udtrykt i ikke-immune celler, såsom epidermale keratinocytter, dermale fibroblaster og epitelceller, men ikke i immunceller såsom lymfocytter, granulocytter, makrofager og dendritiske celler [21], [32], [33]. . Vores resultater antyder, at funktionen af ​​PLCε1 protein i gastrisk cancer kan være knyttet til dets ekspression i immunsystemet

Ifølge disse foreliggende resultater foreslog vi en mulig mekanisme af PLCε1 protein fungere i tumorigenese af gastrisk cancer: PLCε1 protein som en effecter af Ras og Rap små GTPaser [12], [14], [15] er først udtrykt i normal gastrisk slimhinderne. I løbet af udviklingen af ​​atrofisk gastrisk læsion, er PLCε1 proteinekspression reduceret for at forhindre tidlig inflammation infiltration, ifølge PLCε

– /- mus udviser markant modstand mod TPA-inducere hudinflammation [18], [19]. Med stigende tid og graden af ​​inflammation af atrofisk gastrisk læsion, er PLCε1 proteinet gradvist udtrykkes i immunceller fordi PLCε var påkrævet i en række inflammatoriske reaktioner [21], [22], som nu kan inducere dannelsen af ​​mavekræft. Samtidig PLCε1 protein bliver højere udtryk i gastriske kræftceller, fordi PLCε overekspression kan fremme intestinal tumorigenese i Apc

Min /+ mus [20].

Sammenfattende opregulering af PLCε1 udtryk i gastrisk kræft, men nedregulering i atrofisk gastritis blev observeret af vores undersøgelse. Vigtigheden rolle PLCε1 i mavekræft er yderligere fremhævet af vores fund af dens inverse korrelation med kronisk atrofisk gastritis. Disse resultater ikke kun tyder på, at PLCε1 kan anvendes som en prognostisk indikator for at skelne mavekræft fra atrofisk gastritis, men også garanterer yderligere undersøgelser for at etablere en mulig forbindelse mellem den biologiske funktion af PLCε1 og patogenesen af ​​mavekræft. Vores undersøgelser viser også, at PLCε1 kan have en vigtig rolle i tumorigenese af gastrisk kræft, især på tidligt tidspunkt, og kunne udgøre en ny markør til diagnosticering af tidlige fase mavekræft.

Støtte Information

Tabel S1.

Forholdet mellem PLCε1 udtryk og clinicopathologic egenskaber

doi:. 10,1371 /journal.pone.0047563.s001

(DOC)