PLoS ONE: Påvisning af blærekræft Brug proteomiske Profilering af urin Sediments

Abstrakt

Vi brugte protein udtryk profiler til at udvikle en klassificering regel til påvisning og prognostiske vurdering af blærekræft i annulleret urinprøver. Brug af Ciphergen PBS II ProteinChip Reader, vi analyserede protein profiler af 18 par prøver af blære tumor og tilstødende urothelium væv, et træningssæt af 85 udtømt urin prøver (32 kontroller og 53 blærecancer), og en blindet test sæt af 68 udtømt urin prøver (33 kontroller og 35 blærekræft). Brug t-tests, vi identificeret 473 toppe viser signifikant forskellig ekspression på tværs af forskellige kategorier af parrede blære tumor og tilstødende urothelial prøver sammenlignet med normal urothelium. Så intensiteten af ​​disse 473 toppe blev undersøgt i et træningssæt af annulleret urinprøver. Under anvendelse af denne fremgangsmåde identificerede vi 41 proteintoppe der blev differentielt udtrykt i begge sæt prøver. Ekspressionsmønsteret for de 41 proteintoppe blev anvendt til at klassificere udtømt urin prøver som malign eller benign. Denne fremgangsmåde gav en følsomhed og specificitet på 59% og 90%, henholdsvis på sættet uddannelse og 80% og 100%, henholdsvis på sættet testning. Den proteomisk klassificering regel udført med tilsvarende nøjagtighed i lav- og høj kvalitet blærecarcinomer. Derudover brugte vi hierarkisk clustering med alle 473 protein toppe på 65 godartede annulleret urinprøver, 88 prøver fra patienter med klinisk evident blærekræft og 127 prøver fra patienter med en historie for blærekræft at klassificere prøverne i Cluster A eller B. de tumorer i Cluster B var præget af klinisk aggressiv adfærd med betydeligt kortere metastase-fri og sygdomsspecifikke overlevelse

Henvisning:. Majewski T, Spiess PE, Bondaruk J, Sort P, Clarke C, Benedict W, et al. (2012) Påvisning af blærekræft Brug proteomiske Profilering af urin sediment. PLoS ONE 7 (8): e42452. doi: 10,1371 /journal.pone.0042452

Redaktør: William CS. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hongkong

Modtaget: April 9, 2012; Accepteret: 6 juli 2012; Udgivet: 3. august, 2012 |

Copyright: © Majewski et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health Tilskud R01 CA 151.489 (BC) og GU SPORE Grant P50 CA91846 (Projekt 1, BC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. CC var oprindelig ansat i Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Californien på tidspunktet for den første undersøgelse relateret til dette projekt. I øjeblikket er hun arbejder i kontoret for Vice President for Translationel forskning på The University of Texas M D Anderson Cancer Center. Hendes tilknytning til Ciphergen ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Nuværende patogenetiske begreber postulerer, at fælles neoplasmer i blæren opstå i sin epitelial foring (urothelium) via to forskellige, men noget overlappende veje: den papillære og nonpapillary veje. [1] Ca. 80% af de tumorer, der opstår i blæren er eksofytiske papillære læsioner, der stammer fra hyperplastiske urothelial ændringer. De typisk gentage sig, men normalt ikke invadere blærevæggen eller metastaserer. De resterende 20% af blæretumorer er aggressive, nonpapillary carcinomer med en tilbøjelighed til at invadere og metastaserer. Invasive blære kræft opstår typisk hos patienter uden en historie af papillære tumorer og stammer fra

in situ

præneoplastiske læsioner spænder fra mild til moderat dysplasi (lav kvalitet intraurothelial neoplasi, LGIN) til svær dysplasi og karcinom

i situ

(high-grade intraurothelial neoplasi, HGIN). [2] De fleste aggressive høj kvalitet ikke-papillære blære karcinomer til stede på et fremskredent stadium og nødvendiggøre kemoterapi og /eller radikal cystektomi for at forbedre overlevelsen.

For studier af biomarkører, blære karcinom er en ideel sygdomsmodel , fordi kan overvåges dens udvikling og progression hjælp noninvasiv eller minimalt invasive teknikker. [3] slimhinde af blæren kan undersøges og biopsier kan opnås via en endoskopisk procedure. Desuden kan morfologien af ​​eksfolierede urothelial celler og deres komponenter samt udskilte produkter gennemgås på urin uden risiko for patienten. Salg

proteom teknologier, der involverer massespektrometri kombineret med ProteinChip Systems har vist sig at lette proteinet profilering af biologiske prøver. [4] – [6] De første resultater dokumenterer identifikation af serum og urin protein fingeraftryk til diagnosticering flere kræftformer [7] – [9] er blevet fulgt op af rapporter hæve bekymringer om problemer med studiedesign, reproducerbarhed, kalibrering og analytiske handlinger [10] – [13]

proteomprofilen udvikling blærekræft fra

in situ

neoplasi blev udviklet på en samling af proteomisk spektre fra parrede prøver af urothelial karcinom (UC) og tilstødende. urothelium sammenlignet med normale urothelium. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, blev 473 protein toppe udtrykt i normal urothelium identificeret. Det samme 473 blev efterfølgende identificeret i uddannelsen sæt annulleret urinprøver fra kontrolpersoner og patienter med UC. Protein- toppe først identificeret som unormalt udtrykt i vævsprøver (filtrering trin 1) og derefter i træningssættet af udtømt urin prøver (filtrering trin 2) blev anvendt til at designe en klassificering regel. Udførelsen af ​​reglen klassificeringen blev vurderet først i træningssættet og derefter i en blind test sæt. Endelig blev en klynge analyse udført ved hjælp af 473 protein toppe på al kontrol og UC prøver at identificere den proteomisk underskrift aggressiv blærekræft.

Denne rapport skitserer en strategi for protein profilering ved hjælp overflade-forstærket laser desorption og ionisering time-of-flight (SELDI-TOF) massespektroskopi at formulere en klassificering regel til detektering blærecancer i udtømt urin prøver og klassificere klinisk særskilte klasser af sygdommen.

(a) Digitaliseret proteomprofilen af ​​blæren kræft udvikling fra

in situ

neoplasi. Ekspressionsniveauer af protein toppe blev analyseret på parrede prøver fra tilstødende urothelium (AU) og UCS forhold til normal urothelium (NU). Hver søjle repræsenterer UC eller AU prøver og hver række svarer til en digitaliserede protein toppe arrangeret i henhold til

M /Z

nøgletal. Nøgletal enkelte

M /Z

peak forhold til NU vises som en farvemætning skala under diagrammet. Prøver svarende til AU og UC er grupperet efter deres patogenetiske delmængder repræsenterer lav kvalitet (Grade 1-2) overfladisk papillær UC (LGPUC) og høj kvalitet (grad 3) invasive UC (HGNPUC). Baren diagrammet til højre viser de enkelte protein toppe med højere (rød) og lavere (blå) ekspressionsniveauerne sammenlignet med NU. Kolonne 1: sammenligning mellem NU og AU LGPUC, 2: sammenligning mellem NU og LGPUC, 3: sammenligning mellem NU og AU HGNPUC, 4: sammenligning mellem NU og HGNPUC. (B) proteomprofilen af ​​annulleret urinprøver fra kontrolpersoner (normal kontrol, NC) og patienter med UC dikotomiseret ind LGPUC og HGNPUC kategorier. Baren diagrammet til højre viser de enkelte protein toppe med højere (rød) og lavere (blå) ekspressionsniveauerne sammenlignet med NU. Kolonne 1: sammenligning mellem NC og LGPUC; Kolonne 2: sammenligning mellem NC og HGNPUC. (C) Antal af protein toppe med højere (maroon) og nedre (lilla) ekspressionsniveauerne sammenlignet med NU identificeret i parrede vævsprøver af AU og i udtømt urin prøver fra patienter med UC sammenlignet med NC. (D) Andel af proteiner toppe med lignende og uens udtryk mønster.

Metoder

Tumor og urinprøver

Alle humane væv blev indsamlet wpith skriftligt informeret samtykke under protokoller godkendt af MD Anderson Institutional Board og anmeldelse prøverne blev analyseret anonymt. Vi analyserede protein udtryk profiler af 18 par prøver af blære tumor og tilstødende urothelium væv, 88 bortfalder urinprøver fra patienter med klinisk tydelig blærekræft, og 127 bortfalder urinprøver fra patienter med en historie for blærekræft (HIUC) og ingen cystoskopisk eller patologisk bevis (negativ blære biopsi og /eller udtømt urin cytologi) for blærekræft på tidspunktet for urinopsamling. For parrede prøver af tilstødende urothelium og blære tumorvæv, vi opnåede baseline proteinprofiler fra urothelial cellesuspensioner af 13 ureter uden tegn på urothelial neoplasi fjernet under nefrektomi for renalcellekarcinom. For urinprøver, vi opnåede baseline protein profiler fra 65 raske individer. Profilerne blev indledningsvist analyseret i parrede prøver af tilstødende urothelium og blære tumorvæv. De blev derefter sammenlignet med de profiler, der er identificeret i de indledende 85 prøver af urin (32 kontroller og 53 blærecancer) omtalt som træningssættet. Efterfølgende de proteiner, der var signifikant op- eller nedreguleret i begge sæt blev anvendt i en diagnostisk algoritme først på træningssættet (n = 85) af urinprøver og derefter på en blindet test sæt (n = 68; 33 kontroller og 35 blærekræft). Endelig blev proteomiske profiler af alle prøver (65 normale kontroller, 88 blære kræftformer, og 127 HiUCs) analyseres ved hjælp af uovervåget klyngedannelse.

(A) Op reguleret (rød) og ned reguleret (blå) protein toppe identificeret i AU og UC (øverste række) og udtømt urin prøver (midten række) og proteinet toppe konsekvent fundet i begge sæt prøver (nederste række). (B) Heat map 41 protein toppe identificeret ved filtrering trin 2. (Se figur 1) (C) Klassificering af individuelle prøver (venstre panel) og ROC-kurve (højre panel) i træningssættet. (D) Klassificering af individuelle prøver (venstre panel) og ROC-kurve (højre panel) i sættet test.

De intraurothelial precursor betingelser blev klassificeret på parallelle strækninger fra områder med tilstødende slimhinde som LGIN eller HGIN . [2] Tilstedeværelsen af ​​normale, dysplastiske eller maligne celler i afskrab fra tilstødende urothelium væv blev bekræftet under anvendelse mikroskopisk evaluering af cytospinpræparater. De tumorer blev klassificeret i henhold til trelags-WHO histologisk grading system og deres vækstmønstre (papillære versus nonpapillary). [14] Dybden af ​​invasion blev registreret i henhold til TNM (tumor-node-metastaser) iscenesættelse system. [15] Stage T

1 (lamina propria invasion) er blevet opdelt i T

1a (ingen muscularis slimhinden invasion) og T

1b (muscularis slimhinder invasion), som har en betydeligt højere risiko for progression. [16] Tumorerne blev dikotomiseret i overfladiske (T

a-T

1a) og invasive (T

1b og højere) grupper, som tidligere beskrevet. [17]

(A) Klassificering af individuelle prøver (venstre panel) og ROC-kurve (højre panel) baseret på 65 godartede kontrolprøver og 53 prøver fra patienter med LGPUC. (B) Classificatin af individuelle prøver (venstre panel) og ROC-kurve (højre panel) baseret 65 godartede kontrolprøver 35 prøver fra patienter med HGNPUC. (C) Klassificering af individuelle prøver (venstre panel) og ROC-kurve (højre panel) baseret på 65 godartede kontrolprøver og 88 prøver fra patienter med UC. (Kombineret træning og test sæt) (D) Sammenligning af diagnostisk nøjagtighed proteomics og cytologi på 39 prøver fra patienter med UC. (E) Klassificering af individuelle prøver ved proteomics baseret på den kombinerede test og træning sætter samt for LGPUC og HGNPUC separat.

Cellesuspensioner fra tilstødende urothelium og blære tumorvæv blev fremstillet som beskrevet tidligere. [16] Kort sagt, cystektomi prøver af tidligere ubehandlede urothelial carcinomer blev brugt efter at have indhentet informeret samtykke fra patienterne. Hver cystektomi prøve blev åbnet i længderetningen langs den forreste væg af blæren og fastgjort ned til en paraffin blok. Et repræsentativt udsnit fra det centrale område af groft identificeret tumor blev opnået for proteomisk profilering. Tilstedeværelsen af ​​tumor i vævet blev bekræftet via analyse af frosne snit. For at minimere kontaminering med nontumor væv, vi dissekeret et område med tumorvæv fra den frosne blok. Vi forberedt urothelial cellesuspensioner fra tilstødende urothelium væv ved at skrabe slimhindeoverfladen. Renheden af ​​prøverne blev bestemt via cytologisk undersøgelse af cytospinpræparater. Kun de prøver, der kunne opnås mere end 90% mikroskopisk intakt normal, dysplastiske eller maligne urothelial celler blev anvendt til proteinanalyse. Til forarbejdning, blev cellerne overført til koniske rør indeholdende phosphatbufret saltvand (PBS). Det frosne tumorvæv blev overført til et lignende konisk rør indeholdende PBS, som var mekanisk omrørt til frigivelse tumorceller. Før forberede cellelysater, vi afrenset cellesuspensionerne via Ficoll Histopague-1077j (Sigma Diagnostics, Inc. St. Louis, MO, USA) gradient centrifugering. Til opbevaring blev cellepellets resuspenderet i PBS indeholdende 20% dimethylsulfoxid og frosset i flydende nitrogen. Udtømt urin prøver blev behandlet på samme måde. [3]

kohorte omfattede 65 normale kontroller (NC), 88 patienter med klinisk evident blærekræft (UC) og 127 patienter med tidligere blærekræft (HIUC). Clustering blev udført under anvendelse euklidiske afstand og matrixen af ​​ekspressionssystemer intensiteter for 473 proteintoppe. Hver kolonne repræsenterer en annullerede urinprøve og hver række svarer til digitaliserede protein toppe arrangeret i henhold til

M /Z

nøgletal.

Behandling af urinprøverne blev afsluttet inden for 1-4 timer efter modtagelsen. Volumenet af urin varierede fra 10 til 50 ml. Urinprøver blev centrifugeret ved 2500 rpm i 10 minutter ved stuetemperatur. Cellepelleten blev resuspenderet i 2 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM). Den nye konisk rør (50 ml) blev fyldt med 20 ml DMEM, og 5 ml Ficoll blev anbragt i bunden. Urin celler blev derefter overført til toppen af ​​opløsningen. Efter centrifugering ved 2500 rpm i 20 minutter ved stuetemperatur blev den 10-ml øvre lag fjernes, og grænsefladen (~8 ml) med urin celler blev overført til en ny konisk rør (25 ml). Prøven blev centrifugeret igen ved 2500 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Endelig blev opsamlet cellerne, resuspenderes i 2 ml DMEM med 10% dimethylsulfoxid, og opbevaret ved -80 ° C til senere brug.

(A) Fordeling af udtømt urin prøver i klynge A og B i normal kontroller (NC), patienter med klinisk evident blærekræft (UC) og patienter med historie for blærekræft (HIUC). (B) Fordeling af annulleret urinprøver i Klynger A og B i henhold til histologisk kvalitet og scene dikotomiseret i lav kvalitet invasiv overfladisk papillær UC (LGPUC, pT

a – pT

1a) og høj kvalitet ikke-papillær UC ( HGNPUC, T

1b og højere). (C) Kaplan – Mayer plots af metastaser og sygdomsspecifikke overlevelse af patienter med blærekræft i Klynger A og B.

Udarbejdelse af cellelysater og proteomanalyse

Cellelysater forberedt som der henvises til i Bio-Rad-webstedet. [18] Kort beskrevet blev prøverne trukket, centrifugeret ved 5000 g i 10 minutter, vasket i PBS og resuspenderet i en lyseringsbuffer (10 mM Tris [pH = 9], 10 mM NaCl, 0,1% dodecyl mattoside). Protein- lysater blev fremstillet via sonikering under anvendelse af en probe-sonikator (Cole-Parmer Instrument Co., Chicago, IL, USA) sat til 5 watt 10 gange i 15 sekunder med 45 sekunders intervaller på afkøling på is. Samlede proteinindhold blev målt i hver prøve ved anvendelse af et Micro BCA protein analysereagenskit (Pierce, Rockford, IL, USA). Immobiliserede metal affinitet IMAC3 capture chips (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA, USA) blev anvendt til proteomanalyse. Chips aktiveres af kobbersulfat blev kortvarigt vasket i deioniseret vand og inkuberet med 100 mM natriumacetat (pH, 4,5) i 5 minutter for at fjerne overskydende Cu

+2 og igen vasket med deioniseret vand. Chips blev kortvarigt ækvilibreret med cellelysebuffer og inkuberet i 1 time med proteinlysater indeholdende 1 ug totalt protein i et volumen på 3-8 pi lysisbuffer. Før læsning, chips blev vasket tre gange med lyseringsbuffer, to gange med deioniseret vand, lufttørret og krystalliseret med 0,3 pi sinapininsyre i 50% acetonitril /1% trifluoreddikesyre. Alle forberedende skridt blev udført ved stuetemperatur. Protein- profiler blev analyseret under anvendelse af et Ciphergen PBS II ProteinChip Reader (Ciphergen Biosystems Fremont, CA, USA). Før hver måleserie blev systemet kalibreret ved hjælp af en “alt-i-en” standard fra Ciphergen Biosystems, og proteomprofilen af ​​en normal henvisning væv, dvs. af normalt urothelium væv eller af urinen sediment af normale individer, var testet.

(A) Proteinprofiler mellem 3300 og 3600 m /z af repræsentative prøver svarende til NC, LGPUC og HGNPUC viser ekspressionsmønsteret for tre proteintoppe med 3370, 3440 og 3490 ± 10 m /z omhandlede til som toppe 1-3 (PK 1-3) repræsenterer klynge af a-defensiner. (B) Zoomet varme kort, der viser udtrykket mønster af α-defensin klynge i træningssættet. (C) Udtrykket intensiteter af α-defensin klynge svarende til pk 1-3 i trak prøver af test- og uddannelse sæt NC, LGPUC og HGNPUC. Krydsede røde linjer og lodrette streger repræsenterer middelværdier og standardafvigelser. To prøve T-test blev anvendt til at sammenligne log2-transformerede topintensiteter i kræft prøver og kontroller for hver respektive top (p 0,001).

For at vurdere nøjagtigheden af ​​målingerne, vi udførte flere undersøgelser. [19] Vi evaluerede intensiteten af ​​26 toppe i 24 replikat spektre af den samme prøve fra normalt urothelium væv til at kontrollere reproducerbarhed (Figur S1). Peak variationskoefficienter (cv’er) varierede fra 13,7% til 63,1% af middelværdien. Medianen CV var 22,7%, og den interkvartile område var fra 19,4% til 27,7%. Vi testede også følsomheden af ​​masse-til-ladningsforhold (m /z) værdier til en mængde af det totale protein ved varierende belastninger fra 0,5 til 2 ug, og m /z aflæsninger varierede med mindre end 1% (data ikke vist).

analyseprocedurer

Alle spektre blev eksporteret som * .xml filer ved hjælp Ciphergen software. De rå spektre blev behandlet ved hjælp af MATLAB scripts egenudviklede til (a) fjerne tilfældig støj, (b) trække det lavfrekvente baseline, og (c) påvisning og kvantificering af de enkelte prøve toppe. Denoising og baseline subtraktion blev udført ved hjælp af wavelet tærskelværdiansættelse tilgang. [20] Efter denoising blev spektre normaliseret. Topdetektion gjort brug af den gennemsnitlige spektrum efter denoising. [21] Data fra alle spektre blev sammenfattet i en matrix af topintensiteter, med hver række svarer til en bestemt

M /Z Drømmeholdet værdi (en top), og hver kolonne svarer til en bestemt prøve.

Klassifikation nøjagtighed blev vurderet via sensitivitet og specificitet og positive og negative prædiktive værdier. Klassificeringen regel blev også bedømt under anvendelse receiver operating characteristic (ROC) kurver. Den varierende parameter i ROC-kurven var vinklen mellem beslutningen grænselinje og den normale X-akse: en vinkel på 0 ° ført til alle prøver klassificeres som normalt, og en vinkel på 90 ° ført til alle prøver klassificeres som kræft. Desuden bortfalder urin spektre blev undersøgt ved hjælp af uovervåget clustering at vurdere graden af ​​sammenhængen mellem de to klynger og diverse clinicopathologic kovariater, herunder opfølgning.

Resultater

Den analytiske strategi anvendes i vores undersøgelse at formulere et protein profil til detektering blærekræft er opsummeret i figur 1. for at identificere den optimale kombination af proteintoppe diagnostiske for blærekræft, vi først analyseret en proteomprofilen af ​​dets udvikling fra

in situ

neoplasi og sammenlignet det med proteomprofilen af ​​udtømt urin sediment fra blærecancerpatienter. For at identificere de proteiner, der var unormalt udtrykt under udviklingen tidlig blærekræft, vi analyserede de mønstre i deres udtryk i 18 parrede prøver af blære tumor og tilstødende urothelium væv og sammenlignede dem med deres udtryk mønster i 13 prøver af normal urothelium. Vi først valgte toppe, der var tydeligt kan identificeres i vævsprøver og brugte t-tests for at identificere toppe, der havde betydelig forskellen udtryk på tværs af forskellige kategorier af parrede blære tumor og tilstødende urothelial prøver. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, benævnt filtreringstrin 1, identificerede vi 473 protein toppe udtrykt i normalt urothelium væv og sæt af op- og ned-regulerede proteiner, som var lidt overlappende, men distinkte, derved at bekræfte udviklingen af ​​blærekræft fra

in situ

neoplasi via papillær og nonpapillary veje. Da udtømt urin sedimenter kan indeholde en blanding af tumor og ikke-tumorceller, herunder inflammatorisk, stromale og perifere blodceller samt nekrotiske celler med degenererede proteiner, vi fokuserede på de samme 473 toppe identificeret i vævsprøver og undersøgte deres intensiteter i en træningssættet af udtømt urin prøver fra 53 patienter med klinisk evident blærecancer og 32 raske individer. I denne fase, kaldet filtrering trin 2, vi søgte, igen ved hjælp af t-test, for toppe med betydelig forskellen udtryk mellem kræft og kontroller.

Eksempler på SELDI-TOF spektra fra prøver af normal urothelium væv og parrede prøver af tilstødende urothelium og tumorvæv samt resultaterne af filtreringstrin 1 er vist i figur 2A. Spektrene fra udtømt urin sedimenter af blærecancerpatienter og normale kontroller og resultaterne af filtreringstrin 2 er vist i figur 2B. Forskellene i protein udtryk profiler af tumorer identificeret i væv og udtømt urin prøver er opsummeret i figur 2C og D. Det er klart, at HGINs eller high-grade nonpapillary urothelial carcinomer (HGNPUC) har lidt overlappende men særskilte protein ekspressionsmønstre, der kan være også identificeret i tilstødende urothelium væv. Dette fund antyder, at abnorme protein udtryk profiler kan identificeres i overfladen urothelium væv før udviklingen af ​​klinisk evident cancer. Ved at sammenligne mønstre af abnormt udtrykte proteiner i blæretumorer, deres tilstødende urothelia, og bortfalder urinprøver fra træningssættet, vi identificeret en række forskellige op- og ned-regulerede proteiner, der var til stede i både blære tumorvæv og udtømt urin sediment prøver fra patienter med blærecancer, der var bibeholdt efter begge filtreringstrin. (Figur 3A og B).

Brug kun de toppe, der passerede både filtrering trin, brugte vi den matrix af 41 protein topintensiteter at konstruere en klassificering regel for individuelle prøver i uddannelsen og afprøvning sæt. (Figur 3C) Placeringen af ​​de enkelte prøver i forhold til X (normal) og Y (kræft) akse blev defineret ved hjælp af et par tal, der angiver deres sammenslutninger med både normale og cancer protein profiler. I denne regel klassifikation blev prøver med høje foreninger med normale protein profiler og lave foreninger med kræft profiler grupperet i region 1 og blev klassificeret som godartet. I modsætning hertil blev prøver med lave associationer med normale profiler og høje foreninger med kræft profiler grupperet i region 2 og blev klassificeret som kræft. Prøver med lige så svage eller stærke associationer til normale og cancer profiler dannede grupperet i region 3 og blev betegnet som tvetydig. Grænserne for disse klynger blev defineret ved hjælp leave-one-out cross-validering.

Klassifikation nøjagtighed blev oprindeligt vurderet på uddannelse indstillet med hensyn til følsomhed på 0,59, specificitet 0,90, positiv prædiktiv værdi inden træningssættet af 0,92, negativ prædiktiv værdi inden for uddannelse indstillet på 0,53, og ROC-kurve areal på 0,84. (Figur 3D) have defineret klassificeringen reglen om træningssættet, vi derefter valideret dets nøjagtighed på blindet test sæt af 33 normale kontrolprøver og 35 blærekræft prøver, der gav en følsomhed på 0,80, specificitet på 1,0, positiv prædiktiv værdi på afprøvning sæt af 1,0, negativ prædiktiv værdi på afprøvning sæt af 0,83, og ROC-kurve areal på 0,91. (Figur 3D) Sager, der blev anset tvetydige blev udelukket når computing sensitivitet, specificitet, positiv prædiktiv værdi, og negativ prædiktiv værdi. Alle sager blev godkendt til montering ROC kurver.

For at vurdere, hvordan klassifikationen reglen baseret på matrix af 41 protein topintensiteter udført i forskellige delgrupper i blærekræft, vi kombineret uddannelse og afprøvning sæt og vurderede sin diagnostiske nøjagtighed for lav kvalitet papillær urothelial karcinom (LGPUC) og HGNPUC separat. Analyse af 65 godartede kontrolprøver og 53 LGPUC prøver gav en følsomhed på 0,74, specificitet 0,95, positiv prædiktiv værdi på 0,91, negativ prædiktiv værdi på 0,84, og ROC-kurve areal på 0,88. (Figur 4A) Lignende analyse af 65 godartede kontrolprøver og 35 HGNPUC prøver gav en følsomhed på 0,77, specificitet 0,95, positiv prædiktiv værdi på 0,90, negativ prædiktiv værdi på 0,88, og ROC-kurve areal på 0,88. (Figur 4B) Analyse af den samlede nøjagtighed klassificeringen for den kombinerede træning og test sæt gav en følsomhed på 0,75, specificitet 0,95, positiv prædiktiv værdi på 0,95, negativ prædiktiv værdi på 0,75, og ROC-kurve areal på 0,88. (Figur 4C og D) Analyse af 39 prøver fra patienter med blærekræft for hvilke der forelå de parallelle data om resultaterne af udtømt urin cytologi viste, at klassifikation baseret på proteomik data korrekt diagnosticeret 28 (72%) prøver, mens udtømt urin cytologi korrekt diagnosticeret 19 (49%) prøver. (Figur 4E) Afprøvning af forskellen mellem positive prøver identificeret ved proteomics og cytologi bruger z-test for proportioner gav et tosidet p-værdi på 0,032.

Unsupervised klyngedannelse blev udført under anvendelse euklidiske afstand og komplet binding af alle 65 normale kontrolprøver, 88 prøver fra patienter med klinisk evident blærekræft og 127 prøver fra patienter med et HIUC. (Figur 5) Ved hjælp af matrix af ekspressionssystemer intensiteter for alle 473 proteintoppe, vi klassificeret prøverne i to hovedgrupper. Den første gruppe (klynge A) bestod af et flertal (97%) af de godartede kontrolprøver. (Figur 6A) Den anden gruppe (klynge B) bestod af 56% af prøverne fra patienter med klinisk evident blærecancer. Interessant, kun 24% af prøverne fra patienter med et HIUC co-adskilt med prøver fra patienter med klinisk tydelig blærekræft i klynge B. De resterende 76% af prøverne fra patienter med en HIUC og 44% af prøverne fra patienter med klinisk evident blærekræft co-adskilt med godartede kontrolprøver i klynge A. Vi hypotese, at dette samarbejde segregering kan betyde særskilte klasser af blærekræft og analyseret de patologiske og kliniske parametre for prøverne i klynger A og B. (figur 6B) Cluster A omfattede overvejende normale kontrolprøver (62%) ud over 27% LGPUC og 11% HGNPUC. I modsætning hertil klynge B bestod kun 4% normale kontrolprøver, 49% LGPUC, og 47% HGNPUC. Tumorerne i klynge B blev karakteriseret ved signifikant kortere metastase-fri og sygdomsspecifikke overlevelse end tumorer fra klynge A. (figurerne 6C og D) Samlet, sandsynligheden for at dø af blærekræft for patienter i klynge B var ca. 12%, mens sandsynligheden for at dø for dem i klynge a var mindre end 5%.

Selvom vi ikke udføre identifikationen af ​​toppene anvendes i en regel klassificering, vi fat deres potentiale natur ved at fokusere på de tre mest fremtrædende toppe anvendes i analysen af ​​vores protein udtryk profiler. Klyngen af ​​tre protein-toppe med m /z-værdier sandsynligvis svarer til a-defensiner var inkluderet i reglen klassificeringen. [22] – [24] Eksemplerne på SELDI-TOF spektre profiler mellem 3300 og 3600 m /z i repræsentative urinprøver fra negativ kontrol, LGPUC og HGNPUC afbilder ekspressionsmønsteret for tre toppe svarende til a-defensiner og det zoomede varme kort i træningssættet er vist i figur 7A og B. ekspressionsmønsteret for de samme proteiner i den kombinerede træning og afprøvning sæt viser deres overekspression i LGPUC og HGNPUC. (Figur 7C) Den overekspression mønster af a-defensiner er meget signifikant i både LGPUC og HGNPUC sammenlignet med normale kontroller, og selv hvis det tages ud af kontekst af de 41 anonyme protein toppe, der anvendes i reglen klassificering, disse proteiner udfører rimeligt godt som diagnostisk markører (følsomhed 0,77 og specificitet 0,84). (Figur 7C).

Diskussion

Undersøgelsen design for proteomisk profilering består typisk af en sammenligning af proteomiske mønstre af prøver fra patienter med kræft og godartede kontrolprøver hjælp kunstig intelligens algoritmer såsom genetiske algoritmer eller træ analyse. [25] – [29] En sådan fremgangsmåde identificerer et begrænset antal anonyme protein toppe for kræsne kræft fra godartet væv. Når sådanne toppe blev identificeret ved peptid sekventering, de repræsenterede, i almindelighed, de såkaldte akut fase proteiner i stedet for tumor-specifikke produkter [28].

Flere undersøgelser ved hjælp proteomisk profilering af udtømt urin til påvisning blærekræft med SELDI platform blev for nylig offentliggjort. [30], [31] Disse undersøgelser anvendes forskellige tilgange til protein spektre analyse, der spænder fra brugen af ​​kunstig intelligens algoritmer kombineret med overvåget klyngedannelse til individuel peak og peak klynge identifikation som diagnostiske diskriminerende parametre. [30], [31] som ventet de automatiske klyngedannelse algoritme adskilte kontroller fra prøver kræft med høj følsomhed (80%) og specificitet ( 90%) blev i træningssættet, men er forbundet med et dramatisk fald i både sensitivitet og specificitet i afprøvningen indstillet til en rækkevidde på ca. 50% og 60%. [30] Den kombinatoriske tilgang enkelte biomarkører og biomarkør klynger forudsat følsomhed på 87% og specificitet på 66%, men denne undersøgelse ikke omfatter særskilt uddannelse og afprøvning sæt prøver. [31] Det er interessant, de individuelle markører identificeret ved denne fremgangsmåde omfattede toppene for a-defensin-familien.