PLoS ONE: Lad-7b hæmmer human Cancer Fænotype ved Målretning cytochrom P450 epoxygenase 2J2

Abstrakt

Baggrund

MikroRNA’er (miRNA) er små, ikke-kodende RNA-molekyler på 20 til 22 nukleotider, der regulerer genekspression ved binding til deres 3′-utranslaterede region (3’UTR). Stigende data implicere ændret miRNA deltagelse i udviklingen af ​​kræft. Vi har tidligere rapporteret, at CYP2J2 epoxygenase fremmer menneskelige kræft fænotyper. Men om og hvordan CYP2J2 er reguleret af miRNA er ikke forstået.

Metoder og Resultater

Brug bioinformatik analyse, fandt vi potentielle målområder for miRNA lad-7b i 3’UTR af menneskelig CYP2J2. Luciferase og Western blot-analyser afslørede, at CYP2J2 blev reguleret af Lad-7b. Desuden lad-7b faldt den enzymatiske aktivitet af endogent CYP2J2. Endvidere kan lade-7b mindske celleproliferation og fremme celle apoptose af tumorceller via posttranskriptionel undertrykkelse af CYP2J2. Tumorxenografter blev induceret i nøgne mus ved subkutan injektion af MDA-MB-435 celler. Den lad-7b ekspressionsvektor, pSilencer-let-7b, blev injiceret gennem halevenen hver 3. uge. Lad-7b inhiberede tumor fænotype betydeligt ved at målrette CYP2J2. Desuden blev kvantitativ real-time polymerasekædereaktion og western blotting anvendes til at bestemme ekspressionsniveauerne af lad-7b og

CYP2J2

protein fra 18 matchede lunge pladecellekræft og tilstødende normale lungevæv; ekspressionsniveauet af CYP2J2 var omvendt proportional med den for lade-7b.

Konklusioner

Vores resultater viste, at nedsat ekspression af lad-7b kan føre til den høje ekspression af CYP2J2 protein i kræft væv. Disse resultater tyder på, at miRNA lad-7b reducerer CYP2J2 udtryk, som kan bidrage til at hæmme tumor fænotyper

Henvisning:. Chen F, Chen C, Yang S, Gong W, Wang Y, Cianflone ​​K, et al. (2012) Lad-7b hæmmer human Cancer Fænotype ved Målretning cytochrom P450 epoxygenase 2J2. PLoS ONE 7 (6): e39197. doi: 10,1371 /journal.pone.0039197

Redaktør: Gangjian Qin, Northwestern University, USA

Modtaget: December 19, 2011; Accepteret: 16 maj 2012; Udgivet: 25 juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af bevilling fra National Basic Research Program = “973 =” (nr 2012CB517801) og NSFC (nr 30.930.039 og 81.070.236). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Menneskelig cytokrom P450 (CYP) epoxygenase, CYP2J2, katalyserer epoxidering af arachidonsyre i fire regioisomerer af cis-epoxyeicosatrienoic syre (5,6-EET, 8,9-EET; 11,12-EET, og 14,15-EET) [1]. Dette enzym synes at være primært udtrykkes i hjerte og fartøjets endotelceller [2], og det er også blevet fundet i en række forskellige væv, herunder lever, lunge, nyre og gastrointestinale væv [3]. Fordi forskelle i den katalytiske effektivitet af individuelle P450 isoformer resultater i forskellige EET profiler for hver [4], 11,12- og 14,15-Eets er de primært arachidonsyremetabolitter produceret i forskellige celler og væv [5], [6] .

Flere undersøgelser har rapporteret, at EETS har forskellige biologiske virkninger inden for hjerte-kar-systemet. EETS frigøres fra endotelet aktiverede calcium-sensitive kaliumkanaler og resulterede i hyperpolarisering af glatte muskelceller og vaskulær afslapning [7]. Desuden fysiologiske koncentrationer af EETS eller overekspression af

CYP2J2

reduceret vaskulært celleadhæsionsmolekyle-1 (VCAM-1) ekspression og forhindrede leukocytadhæsion til karvæggen [8]. De inhibitoriske virkninger af Eets viser, at de har anti-inflammatoriske virkninger i karsystemet uafhængigt af deres membran-hyperpolarisering virkninger [8]. Derudover Eets også fremmes endotelcelle formering, migrering og angiogenese ved at aktivere både mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) og phosphatidylinositol-3 (PI3) -kinase /Akt pathways [9].

På den anden hånd, andre beviser tyder på, at epoxygenase overekspression eller EETS behandling har potentielt skadelige virkninger. I de seneste publikationer, blev CYP2J2-afledte EETS sig at spille en vigtig rolle i et væld af processer relateret til kræft celle adfærd og tumor patogenese. Vi fandt høj ekspression af CYP2J2 i humane tumorer, samt i otte human-afledte carcinoma cellelinier, men ikke i tilstødende normale væv og nontumoral humane cellelinier [10]. Overekspression af CYP2J2 eller tilsætning af exogene EETS markant accelereret proliferation og metastase af cancerceller in vitro og in vivo [10], [11]. CYP2J2 overekspression eller tilsætning af exogent Eets beskyttede humane carcinomceller fra apoptose ved opregulering de antiapoptotiske proteiner, Bcl-2 og Bcl-XL, og ved nedregulering den proapoptotiske protein, Bax [10]. I modsætning hertil selektive hæmmere af CYP2J2 havde betydelige antitumor virkninger in vitro og in vivo og var forbundet med reduceret EET biosyntese [12]. Kollektivt, alle resultaterne viste de vigtige og tidligere indregnede roller CYP2J2 og dets EET produkter i carcinogenese.

Stigende beviser tyder på, at miRNA spiller en vigtig rolle i forskellige biologiske processer, såsom proliferation, differentiering og apoptose under udvikling [13], [14], [15]. Flere undersøgelser har faktisk beskrevet den afvigende ekspression i humane tumorer af miRNA og deres funktion styrer ekspressionen af ​​visse onkogener og tumorsuppressorgener [16], [17], [18]. For eksempel er MIR-15a og MIR-16 ofte deleteret eller nedreguleret i pladecellecarcinomer og adenocarcinomer i lungen [19]. MicroRNA-101 nedreguleres i blære overgangsperiode celle carcinom (TCC) væv og hæmmer celleproliferation og kolonidannelse i TCC cellelinier ved direkte undertrykke onkogen EZH2 [20]. En nylig undersøgelse viste, at miRNA-let-7a inhiberer ekspressionen af ​​MYC og reverserer MYC-induceret vækst i Burkitt lymfomceller [21]. Tidligere rapporter indikerer, at lade-7 er dårligt udtrykt i en række humane tumorer og reduceret lad-7 niveau resulterer i overekspression (cyclinD, RAS, MYC) af lad-7-responsive gener i tumorer [22], [23] , [24], [25]. Imidlertid er den nøjagtige rolle af lad-7 i cancer endnu ikke fuldt forstået. Vores foreløbige data viser, at Lad-7b er nedreguleret i humane lunge skællede tumorer, mens niveauer af CYP2J2 protein opreguleres, hvilket tyder på, at den menneskelige CYP2J2 kunne være post-transkriptionelt reguleret af lad-7b. Derfor er formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge denne hypotese, lad-7b kan virke som en tumorsuppressor ved målretning CYP2J2.

Resultater

Lad-7b Mål 3’UTR af

CYP2J2

at undersøge om CYP2J2 reguleres direkte af lad-7b, konstruerede vi en luciferase reporter plasmid indeholdende 3’UTR af CYP2J2 klonet nedstrøms for luciferasereportergenet (figur 1A). Transficerede vi luciferasen konstruktion i HepG2-celler sammen med lad-7b eller tilfældig Lad-7b. Vi fandt, at transfektion af pMIR /CYP2J2-3’UTR sammen med lad-7b resulterede i en signifikant reduktion i reporter aktivitet end gjorde dem af kontrol og tilfældige transfektioner. På den anden side kunne ingen signifikant nedregulering af pMIR reporter aktiviteten bestemmes, når vi transficeret den pMIR reporter (tom vektor) sammen med Lad-7b eller tilfældig lad-7b i HepG2-celler (figur 1b). For yderligere at bekræfte, at CYP2J2 er et mål på lad-7b, konstruerede vi syv mutanter (pMIR /CYP2J2-3? UTR mutant, mutant-1, mutant-2 … og mutant-6, henholdsvis) baseret på pMIR /CYP2J2-3? UTR. Derefter transficeres vi disse konstruktioner i cellerne (MDA-MB-435 og SK-MES-1) og analyseret luciferase reporter aktivitet. Analyserne viste, at luciferaseaktiviteten af ​​pMIR /CYP2J2-3? UTR-mutant ikke var undertrykt af lad-7b, sammenlignet med vildtype pMIR /CYP2J2-3? UTR (figur 1C og D). Blandt de resterende seks mutanter (mutant-1, mutant-2 … mutant-6), luciferase aktivitet af mutant-3 blev undertrykt af lad-7b, sammenligning med tilfældig og kontrol (

P

0,05) ( Figur 1E). Desuden bindingssted III fuldstændigt matchede frø sekvens af Lad-7b, hvis wobble baseparring var tilladt. Disse data indikerer, at CYP2J2 er et af målene for lad-7b.

A, skematisk fremstilling af de forudsagte mål steder af lad-7b i 3’UTR af CYP2J2. 3’UTR af CYP2J2 blev klonet ind i et luciferasereporterplasmid, betegnet pMIR /CYP2J2-3’UTR. En række mutanter gennemført muterede nukleotider i seks mulige bindingssteder for lad-7b frø region blev genereret baseret på vildtype pMIR /CYP2J2-3’UTR. Mutanter af pMIR /CYP2J2-3’UTR er konstrueret ved at mutere den komplementære stedet (mærket med understregning) i Lad-7b frø region til deres komplementære baser. B, blev luciferaseaktivitet analyseret i HepG2-celler 24 timer efter transfektion med reporterplasmid pMIR /CYP2J2-3’UTR eller pMIR (tom vektor). C-D, fuld-længde sekvensen CYP2J2-3’UTR indeholdende mutante bindingssteder for den lad-7b frø region blev genereret baseret på vildtype pMIR /CYP2J2-3’UTR. Transficerede vi disse konstruktioner i cellerne (MDA-MB-435 og SK-MES-1) og analyseret luciferase reporter aktivitet. Som vi forventede, lad-7b påvirkede ikke luciferaseaktivitet af mutanter sammenlignet med vildtype. E, de seks mutanter blev transficeret i SK-MES-1-celler, der ud over Lad-7b eller tilfældig lad-7b. Luciferaseaktiviteten af ​​de seks mutanter blev ikke undertrykt af Lad-7b. Renilla luciferase aktiviteter blev anvendt til at normalisere ildflueluciferase aktivitet. Kolonner, gennemsnit af tre eksperimenter; barer, SD. *,

P

. 0,05

Lad-7b Hæmmer Expression niveauer af endogent CYP2J2 og dens Enzymatisk aktivitet in vitro

For at undersøge virkningerne af eksogen lad -7b på proteinniveauet og enzymatisk aktivitet af endogene CYP2J2 proteiner, undersøgte vi proteinniveauer af CYP2J2 i HeLa, TCA-8113, SK-MES-1 og MDA-MB-435-celler efter behandling med lad-7b i 48 timer (100 nM). Western blot analyse viste, at overekspression af lad-7b betydeligt nedreguleret ekspression af CYP2J2 i fire cancercellelinier (figur 2A). Relativ CYP2J2 ekspression blev kvantificeret ved densitometri (figur 2B). Som i figur S1A og B viste western blots dosisafhængig effekt af lad-7b og lad-7b inhibitor på CYP2J2 proteinekspression. I betragtning af den manglende stabilitet i EETS, vi bestemt koncentration af den stabile metabolit 14,15-DHET i cellekultur medier for at bekræfte hæmning af Lad-7b på den enzymatiske aktivitet af CYP2J2. Resultaterne viste, at 14,15-DHET niveauer blev signifikant nedsat ved transfektion af lad-7b (figur 2C). Disse data viste, at menneskelig CYP2J2 direkte nedreguleres af lad-7b.

A, protein niveau CYP2J2. HeLa, TCA-8113, MDA-MB-435, og SK-MES-1-celler blev behandlet med lad-7b eller tilfældig lad-7b (100 nM) i 48 timer. Proteinet niveau af CYP2J2 blev undersøgt ved Western blot-analyse. B er proteinniveau af CYP2J2 kvantificeret ved densitometri. Kolonner, gennemsnit af tre eksperimenter; barer, SD. *,

P

0,05. C, stabil metabolit 14, 15-DHET i HeLa, TCA-8113, og MDA-MB-435-celler blev bestemt som beskrevet under materialer og metoder. Celler behandlet med eksogen HSA-lad-7b produceret færre EETS end dem behandlet med tilfældig lad-7b. Points, gennemsnit af tre eksperimenter; barer, SD. *,

P

. 0,05

Lad-7b Reducerer Cancer Cell Growth og fremkalder apoptose ved direkte at nedregulere CYP2J2

Vi har tidligere rapporteret, at CYP2J2 stimulerer proliferation af carcinomceller og beskytter humane carcinomceller fra apoptose [10]; så var det af interesse at vurdere effekten af ​​overekspression af lad-7b på celleproliferation og apoptose, når endogene CYP2J2 blev inhiberet af lad-7b. Vi behandlede HeLa, TCA-8113, SK-MES-1, og MDA-MB-435-celler med eksogent Lad-7b eller tilfældig lad-7b i 48 timer. Spredningen blev bestemt via Cell-Light ™ EDU DNA Cell Proliferation Kit (Ribobio, Kina). Resultaterne viste en signifikant inhibering af celleproliferation med Lad-7b. For eksempel i MDA-MB-435 og SK-MES-1-celler, lad-7b reduceret celleproliferation med 50% sammenlignet med negativ kontrol og tilfældig lad-7b (figur 3A). Apoptose, målt ved Annexin V og propidiumiodid-farvning, signifikant forøget i celler transficeret med lad-7b (figur 3B). Desuden exogen Lad-7b faldt procentdelen af ​​EDU-positive celler og øget de apoptotiske celler i HeLa og TCA-8113 celler (figur 3C og D). At give yderligere beviser for, at virkningerne af lad-7b udtryk på celleproliferation og apoptose var relateret til CYP2J2, celler transficeret med lad-7b blev behandlet med C26 (10 uM) (specifik CYP2J2 inhibitor [12]) og 14,15-EET (250 nM) i 48 timer. For at minimere sænke niveauet for 14,15-EET grund autooxidation blev celler stimuleret med 14,15-EET eller tilsvarende volumen af ​​køretøj (DMSO) hver 6 timer. Som forventet, virkningerne af lad-7b udtryk på celledeling og apoptose blev forstærket af C26 og ophævet ved 14,15-EET (figur 3E og F). Desuden at bestemme, om lad-7b behandling påvirker cellevækst af H9c2 (H9c2 celler har ingen

CYP2J2

), anvendte vi Cell-Light ™ EDU DNA Cell Proliferation Kit og Annexin V og propidiumiodid-farvning til måling celleproliferation og apoptose af H9c2 celler. Som vist i figur S2A og B, ikke kun celleproliferation men også celle apoptose af H9c2 celler blev ikke påvirket af lade-7b eller lad-7b inhibitor behandling. Disse data antydede, at overekspression af lad-7b resulterede i nedsat proliferation og aktiveret apoptose af carcinomcellelinjer.

A, proliferation assay via Cell-Light ™ edu DNA Cell Proliferation Kit viste reduceret proliferationshastighed af MDA-MB- 435 og SK-MES-1-celler behandlet med lad-7b i forhold til cellerne behandlet med tilfældig lad-7b eller kontrol. De blå-farvede celler blev farvet af Hoechst, og den røde blev edu add-i celler. Edu-positive celler blev beregnet som (EDU add-i celler /Hoechst-farvede celler) × 100%. Kolonner, gennemsnit af tre eksperimenter; barer, SD. *,

P

0,05. B, procentdelen af ​​apoptotiske celler blev forøget i MDA-MB-435 og SK-MES-1-celler behandlet med lad-7b. Apoptose målt ved annexin V-FITC (x-aksen) og propidiumiodidfarvning (y-aksen). Procenter af apoptotiske celler (procentdel af celler i øverste højre kvadrant (annexin V-positive, PI-negative) plus celler i lav-højre kvadrant (annexin V-positive, PI-positive) i total celle nummer) er givet under den relevante graf. Kolonner, gennemsnit af tre eksperimenter; barer, SD. *,

P

0,05. C-D, procentdele edu-positive celler og apoptotiske celler blev analyseret i HeLa og TCA-8113 celler transficeret med lad-7b eller tilfældig lad-7b. E-F, MDA-MB-435 og SK-MES-1 celler transficeret med lad-7b blev behandlet med C26 (specifik CYP2J2 inhibitor, 10 uM) eller 14,15-EET (250 nM). 48 timer senere, blev analyseret procentdele af edu-positive celler og apoptotiske celler. Kolonner, gennemsnit af tre eksperimenter; barer, SD. *,

P

0,05. G, lad-7b overekspression påvirket ekspression af tumor-relaterede gener i MDA-MB-35-celler. Lad-7b overekspression i MDA-MB-435 celler signifikant nedreguleret PI3K, Pakt, og pERK men steg Bax og nm-23-ekspression. De viste data blev gentaget tre gange.

Vi undersøgte også de påvirkninger af Lad-7b på ekspressionen af ​​proapoptotiske protein Bax og antimetastatisk protein nm-23 og aktiveringen af ​​PI3K /Akt og MAPK signalering veje, som spiller en vigtig rolle i P450 epoxygenase- og EET-medieret tumorgenese og metastase [10], [11], [12]. Vi fandt, at lade-7b overekspression i MDA-MB-435-celler betydeligt nedreguleret PI3K, Pakt, Perk pathways men steg Bax og nm-23-ekspression (figur 3G). Lignende resultater blev også observeret i MDA-MB-435-celle, der behandles med lad-7b agomir (fig S1c og D). Men lad-7b påvirkede ikke PI3K, Pakt, og Bax af H9c2 celler (figur S2C). Vi spekulerede at dette skyldes, H9c2 celler ikke har

CYP2J2

. Disse resultater viste, at øge effekten af ​​CYP2J2 på tumordannelse kunne dæmpes ved lad-7b.

Expression niveau af CYP2J2 Protein og lad-7b i Human Lung Cancer og i tilstødende normale væv er omvendt korreleret

at undersøge en associering mellem lad-7b niveau og ekspressionen af ​​CYP2J2 i humane carcinomer, ekspressionen af ​​CYP2J2 protein og lad-7b i 18 parrede humane lunge squamous cancer væv og tilstødende nontumor væv blev undersøgt ved Western blot-analyse og reelle -Time RT-PCR, hhv. Resultaterne viste, at CYP2J2 blev højt udtrykt i størstedelen af ​​cancer vævsprøver sammenlignet med tilstødende normale væv (figur 4A). Real-time RT-PCR blev anvendt til at bestemme de modne Lad-7b niveauer i 18 parrede humane lunge squamous cancer væv og tilstødende nontumor væv. Selvom ændringer i -ΔΔCT værdier [- (ACt

ikke-tumorvæv-ACt

kræftvæv)] var relativt milde (fra -1,85 til 5,4, 2,6 ± 1,27), fold ændring (2

– ΔΔCT) af lad-7b udtryk mellem 18 parret menneskelige lunge skællede kræft væv og tilstødende nontumor væv var signifikant (0,277 til 42,22, 6,06 ± 2,43). Derfor viste resultaterne, at niveauerne af modent Lad-7b blev signifikant reduceret i 14 lungetumorer sammenlignet med deres matchede kontroller blandt 18 analyserede prøver (figur 4B). Vi næste undersøgte en sammenhæng mellem Lad-7b ekspressionsniveauet og CYP2J2 proteinniveauet i menneskelig lunge planocellulære kræft væv. Og der er statistisk signifikant omvendt korrelation mellem lad-7b udtryk-niveau og CYP2J2 proteinniveauet i 18 sæt lunge planocellulære tumorer kræft og parrede tilstødende nontumor væv (Figur 4C). Endvidere fandt vi, at CYP2J2 havde inverse ekspressionsniveauer til leje-7b i fire parrede human brystcancer og tilstødende nontumor væv (figur 4D og E). Og lad-7b udtryk i SK-MES-1 og MDA-MB-435 celler blev vist i figur S3.

A, udtryk niveauer af CYP2J2 i lunge kræft (C) og tilstødende nontumor væv (N) var målt ved Western blot-analyse. B, sammenligning mellem ekspressionsniveauerne af lad-7b i lunge kræft og tilstødende nontumor væv (n = 18). Selvom ændringer i -ΔΔCT værdier [- (ACt

ikke-tumorvæv-ACt

kræftvæv)] er relativt milde (fra -1,85 til 5,4, 2,6 ± 1,27), de fold ændringer i lad-7b udtryk mellem 18 parrede humane lunge skællede cancer og tilstødende nontumor væv er signifikant (fra 0,277 til 42.22, 6,06 ± 2,43). C, forholdet mellem CYP2J2 protein og lad-7b udtryk i lungekræft og parrede tilstødende nontumor væv. Ekspressionsniveauet af CYP2J2 protein blev forøget i 13 af 18 sæt lungekræft sammenlignet med de hosliggende normale væv (fold-change 1). Som forventet blev lad-7b niveauer almindeligvis reduceret i disse tumorer i forhold til de tilstødende normale væv (folden Change 1). D-E, ekspressionsniveauer af CYP2J2 og lad-7b i bryst kræft og tilstødende nontumor væv (n = 4). Real-time RT-PCR blev anvendt til bestemmelse modne Lad-7b niveauer. U6 snRNA ekspressionsniveauet blev anvendt til at normalisere den relative Lad-7b niveau. Kolonner, gennemsnit af tre eksperimenter; barer, SD. *,

P

. 0,05

Lad-7b-medieret Knockdown af CYP2J2 Hæmmer Tumor vækst og metastase

Desuden undersøgte vi indflydelsen af ​​bogstav 7b på tumorvækst i en in vivo-model. For at generere en tumor xenograft model, 2 × 10

6 MDA-MB-435 celler blev injiceret subkutant i den højre flanke hos nøgne mus. To uger efter injektion, når tumorer var vokset til ca. 40 mm

3, den lad-7b ekspressionsvektor pSilencer-let-7b blev injiceret i mus med en dosis på 4 mg /kg legemsvægt via halevenen hver 3. uge. Som forventet mus injiceret med pSilencer-let-7b via halevene viste en signifikant reduktion i tumorvolumen i forhold til kontrollerne (figur 5A). I løbet af behandlingsperioden, vi bestemmes 14,15-DHET niveau i urinen af ​​nøgne mus og fandt en signifikant reduktion i 14,15-DHET i Lad-7b behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollerne (figur 5B). Ved afslutningen af ​​behandlingsperioden, lad-7b resulterede i signifikant nedsat tumorvægt, men legemsvægt havde ikke ændret (figur 5C). Vi behandlede også MDA-MB-435-celle med lad-7b agomir (150 nM) eller agomir kontrol i 48 timer, og derefter injiceret disse celler i den højre flanke hos nøgne mus. Efter 4 uger blev obduktioner udføres, og alle tumorer per mus blev vejet. Lad-7b agomir resulterede i signifikant nedsat tumorvægt (fig S4). Desuden blev niveauet af modne Lad-7b valideret af real-time RT-PCR; Resultaterne viste, at pSilencer-let-7b behandling resulterede i en signifikant stigning i både tumor og organer (figur 5D og E). Western blot analyse viste en markant nedsat ekspressionsniveau af CYP2J2 protein og et signifikant forøget ekspressionsniveau af proapoptotiske protein Bax og antimetastatisk protein nm-23 i LET-7b-behandlede mus sammenlignet med kontroller (figur 5F). Disse resultater antyder, lad-7b kan inhibere ekspressionen og tumorfremmende funktioner CYP2J2. Salg

MDA-MB-435 celler blev injiceret subkutant i den højre flanke hos nøgne mus for at generere musemodel for brystkræft. To uger senere, mus fik Lad-7b behandling tilfældigt. Lad-7b ekspressionsvektor (pSilencer-let-7b plasmid) blev injiceret i mus via en halevene med en dosis på 4 mg /kg legemsvægt hver 3. uge. A, x-aksen var mærket som de dage af pSilencer-lad-7b behandling. Tumor volumen blev målt ugentligt og beregnet som TV (mm

3) = længde × bredde

2 × 0,5236. B, blev målingen af ​​14,15-DHET niveau i nøgne mus urin udført ved ELISA i overensstemmelse med producentens anvisninger. Points, gennemsnit af tre eksperimenter; barer, SD. *,

P

0,05. C, gennemsnitlig tumorvægt og legemsvægt kontrol og lad-7b behandlingsgrupper efter vækst i 8 uger. Kolonner, betyder; barer, SD. *,

P

0,05 versus kontrol. D-E, ekspressionen af ​​det modne Lad-7b i tumorerne og primære organer blev valideret af real-time RT-PCR. Kolonner, gennemsnit af tre eksperimenter; barer, SD. *,

P

0,05. F, viste Western blot-analyse ændring af ekspressionsniveauet af CYP2J2 protein og tumorrelaterede gener af tumorprøver.

Desuden vi vurderet om overekspression af lad-7b påvirket metastase. Ved slutningen af ​​forsøget blev miltene fjernet og indsnit lodret for at tælle metastatiske tumor kolonier. Metastaser i længdesnit af milten var synlige for det blotte øje som knuder. Vi observerede et signifikant fald i det gennemsnitlige antal milt metastaser i mus injiceret med pSilencer-let-7b sammenlignet med kontroller (figur 6A). Bestemte vi også omfanget af lymfeknudemetastase ved at måle vægten af ​​lymfeknuder. Vi fandt, at injektion af pSilencer-let-7b gennem halevenen reducerede gennemsnitsvægten af ​​axillære lymfeknuder (figur 6B). Yderligere histologisk analyse efter hematoxylin og eosin-farvning af paraffinsnit viste en markant forskel mellem athymiske mus behandlet med lad-7b og kontroller (figur 6C og D): den Lad-7b behandling forårsagede en signifikant stigning i incidensen af ​​nekrotiske regioner i tumor og milt. Sammenlignet med kontrolgruppen, metastaserne focis var mindre og færre i sektioner af milten på lad-7b behandlingsgruppe. Endvidere TUNEL-farvning af snit viste, at lade-7b behandling resulterede i en signifikant stigning i TUNEL-positive celler i tumorer og i mus milt (fig 6E og F). Disse data indikerer, at lade-7b behandling kan inhibere tumormetastase.

A, gennemsnitligt antal milt metastaser for hver gruppe (n = 6). Kolonner, betyder; barer, SD. *,

P

0,05 versus kontrol. B, gennemsnitsvægten af ​​axillære lymfeknuder for hver gruppe. Kolonner, betyder; barer, SD. *,

P

0,05 versus kontrol. C-D, hematoxylin og eosin-farvning af dele af tumor (C1, C2) og milt (D1, D2). E-F, TUNEL farvning af tumor (E1, E2) og milt (F1, F2) sektioner.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse har vi vist en ny mekanisme for styre tumor-promotion funktion af CYP2J2. Bioinformatik analyse forudsagde, at lade-7b er en potentiel regulator af

CYP2J2

gen. Brug CYP2J2-udtryk kræft cellelinjer og en tumor xenografs model, har vi vist, at den menneskelige

CYP2J2

er posttranscriptionally reguleret af Lad-7b, og at posttranskriptionel regulering er ansvarlig for tumor-fremme funktion af CYP2J2. Endvidere i human lunge skællede cancer og tilstødende nontumor væv, observerede vi en omvendt forhold mellem let-7b og CYP2J2 ekspressionsniveauer.

Det er blevet klart, at microRNA regulere ekspressionen af ​​målgener ved at binde til de komplementære regioner af 3’UTR af deres målgener [26], men om HSA-let-7b regulerer human CYP2J2 ekspression er ikke kendt. Tidligere undersøgelse har vist, at lade-7 regulerer RAS gennem sin 3’UTR [27]. I den foreliggende undersøgelse viste luciferaseassays at lade-7b undertrykt aktiviteten af ​​reporter konstruktion indeholdende 3’UTR region CYP2J2 mRNA. Transfektion af karcinom cellelinjer med lad-7b og injektion af pSilencer-lad-7b producerer modne lad-7b in vivo faldt CYP2J2 proteinekspression og enzymatisk aktivitet, hvilket tyder på, at

CYP2J2

er posttranscriptionally negativt reguleret af lad-7b.

Nylige undersøgelser har vist, at lade-7 kan virke som en tumorsuppressor og at nedsat lad-7 niveau resulterer i lad-7-responsive gen (cyclinD, RAS, mYC, etc.) overekspression i tumorer [22 ], [23], [24], [25]. Med western blot-analyse og real-time RT-PCR, viste vi højere ekspression af CYP2J2 protein og lavere ekspression af lad-7b i 18 parrede humane lunge squamous cancervæv sammenlignet med de hosliggende nontumor væv. Således kan høj ekspression af CYP2J2 protein i cancervæv følge af reduceret ekspression af lad-7b, i det mindste delvis. Selvfølgelig er det sandsynligt, at en anden mekanisme (r) er involveret i regulering CYP2J2 ekspression. Vores tidligere undersøgelse viste, at overekspression af CYP2J2 eller additing eksogene Eets faldt apoptose og øget celleproliferation i cancercellelinier og øget tumorvækst og lunge metastase i en murin xenograft model [10]. Desuden er vi for nylig fundet, at Compound 26, den selektiv inhibitor af CYP2J2, betydeligt undertrykt tumor-fremme funktion af CYP2J2 [12].

I den foreliggende undersøgelse, beskrev vi en ny mekanisme til undertrykkelse af CYP2J2. Vi behandlede carcinoma cellelinier med lad-7b og fundet, at overekspression af lad-7b resulterede i nedsat proliferation og aktiveret apoptose af cancerceller. Vi fandt også, pSilencer-let-7b behandling signifikant inhiberede tumorvækst i en tumor xenograft model. Selv nedregulering af CYP2J2 af pSilencer-lad-7b resulterede ikke i udryddelse af tumorer, omvendt korrelation mellem ekspressionsniveauet af CYP2J2 og lad-7b i humant kræftvæv og effektiviteten af ​​at hæmme tumor-fremmende funktioner CYP2J2 afslørede potentiel terapeutisk fordel ved lad-7b i humane cancere.

i vores tidligere undersøgelse har vi rapporteret at Eets beskytte endothelceller fra apoptose ved at aktivere phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt og MAPK signalveje [25] . I den aktuelle undersøgelse, overekspression af lad-7b undertrykt ekspression af CYP2J2 protein og dets EET produkter in vitro og in vivo. Vi fandt også, lad-7b kunne hæmme proliferation og øge apoptose af humane tumorceller ved at hæmme de PI3K /Akt og MAPK signalveje og ved at aktivere proapoptotiske protein Bax og antimetastatisk protein nm-23, som begge er involveret i P450 epoxygenase- og EET-medieret tumorgenese og metastase [10]. Vore data tyder på, at virkningen af ​​CYP2J2-afledte Eets på tumordannelse blev medieret af Lad-7b. De 11 medlemmer af Lad-7 familie har lignende målgener og funktioner på celleproliferation grund af den høje lighed blandt deres sekvenser [23], [28]. I nærværende undersøgelse har vi fokuseret på effekten af ​​Lad-7b på ekspressionen af ​​CYP2J2. Virkninger af de andre medlemmer af lad-7 familie på CYP2J2 udtryk og kræft celledeling brug for yderligere undersøgelse.

Som konklusion vores data bekræftede, at lade-7b udtryk ofte faldt i lunge planocellulært kræftformer. Vores arbejde anførte desuden, at human CYP2J2 posttranscriptionally reguleres af Lad-7b, hvilket resulterer i høj ekspression af CYP2J2 protein i humane carcinomer. Vores undersøgelse viste en ny mekanisme, hvorved CYP2J2- og EET-medieret tumorgenese og metastase er forbundet med lad-7b. Udover MYC og RAS, lad-7b kan fungere som en tumor suppressor ved at blokere CYP2J2.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af Review Board of Tongji Hospital og Tongji Medical College. De rekrutterede emner forudsat skriftligt informeret samtykke. Undersøgelsen overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Alle dyr forsøgsprotokoller efterkommet “Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr” udgivet af de amerikanske National Institutes of Health.

cellelinier

Den menneskelige livmoderhalsen adenocarcinom cellelinie HeLa, human hepatoma liver HepG2, human tunge pladecellecarcinom TCA-8113, og human lunge skællede cancercellelinie SK-MES-1 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, Californien) med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i nærvær af 5% CO

2 ved konstant fugtighed. MDA-MB-435 humane brystcarcinom cellelinie blev også opnået fra American Type Culture Collection og blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og holdt ved 37 ° C i 95% luft /5% CO

2 .

MicroRNA target forudsigelse

RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/rnahybrid_submit) blev anvendt til miRNA target forudsigelse. Vi fandt fire potentielle target sites (site I, sted III, side IV, og stedet VI) i 3’UTR af menneskelig CYP2J2 for lad-7b. Derudover har vi også sammenlignet LET-7b sekvens til sekvensen i fuld længde af CYP2J2-3’UTR med DNAMAN software (LynnonBiosoft, Quebec, Canada). Vi fandt også en anden to potentielle bingding sites (sted II og sted V), foruden de fire potentielle target sites tidligere beskrevet (figur 1A).

Plasmid Construction

Den fulde længde sekvens af human CYP2J2 -3? UTR blev amplificeret ved PCR under anvendelse af primerne 5′-GCGACTAGTGTATCACCATTTCCCCAGTCAGTCA-3 ‘(CYP2J2-3’UTR-tidligere primer) og 5′-GCGAAGCTTCATGGGAATAAGTGTCTGATGGAGG-3’ (CYP2J2-3’UTR-reverse primer). barer, SD. barer, SD. Kolonner, betyder; barer, SD.