PLoS ONE: Mikroindkapsling af neuroblastomceller og Mesenchymale stromacellers i Collagen mikrosfærer: En 3D model for Cancer Cell Niche Study

Abstrakt

Der er en stigende tendens for forskere at bruge

in vitro

3D-modeller i kræft undersøgelser, da de bedre kan rekapitulere komplekse

in vivo

situationen. Og det faktum, at progression og udvikling af tumor er tæt forbundet til sin stromale mikromiljø er blevet mere og mere anerkendt. Etableringen af ​​en sådan tumor støttende niche er afgørende i forståelsen tumor fremskridt og metastase. Den mesenchymal oprindelse mange celler, der er bosiddende i kræft niche giver rationalet at omfatte MSC i at efterligne den niche i neuroblastom. Her co-indkapslede vi og co-kultur NBCs og MSC i en 3D

in vitro

model og undersøge morfologi, vækst kinetik og matrix remodellering i det rekonstituerede stromale miljø. Resultaterne viste, at indarbejdelsen af ​​MSC i modellen føre til accelereret vækst af kræftceller samt sammenfatning af i det mindste delvist tumor mikromiljø

in vivo

. Den aktuelle undersøgelse viser derfor om det er muligt for kollagen mikrosfære til at fungere som en 3D

in vitro

kræft model for forskellige emner i kræft studier

Henvisning:. Yeung P, Sin HS, Chan S, Chan GCF, Chan BP (2015) Mikroindkapsling af neuroblastomceller og Mesenchymale stromacellers i Collagen mikrosfærer: En 3D model for Cancer Cell Niche Study. PLoS ONE 10 (12): e0144139. doi: 10,1371 /journal.pone.0144139

Redaktør: Stan Gronthos, The University of Adelaide, Australien

Modtaget: August 21, 2015; Accepteret: November 14, 2015; Udgivet: December 14, 2015

Copyright: © 2015 Yeung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Brug 2D monolagskulturer for kræft cellelinjer som en simpel model til at studere kræftforskningen kunne spores tilbage til 1950’erne [1, 2]. Men ligner sundt væv, tumorvæv er, 3D enheder med celler, ekstracellulære matrix og andre mikromiljø. Til dato er der generel enighed om, at monolaget cellelinien kultur dårligt repræsenterer

in vivo

fænomen [3], hvor der findes celle-celle- og celle-matrix-interaktioner, derfor begrænse dets evne til at forudsige kræft celle respons i virkelighed [4].

i de seneste år, er der en stigende tendens for forskere at bruge

in vitro

3D-modeller i kræft undersøgelser [3, 5, 6] om emner som tumor mikromiljø [7], angiogenese [8] og metastase [9]. Disse modeller omfatter sfæroider [10] og mikrosfærer [11, 12]. De støtter samdyrkning af flere celletyper, tillader celle-celle- og celle-matrix-interaktioner, og dermed bedre bevare

in vivo Salg karakteristika tumorvæv. Nogle modeller er i stand til at etablere den strukturelle mangfoldighed tumorvæv med zoner af prolifererende, hvilende eller nekrotiske celler [4]. Evnen af ​​disse 3D-modeller til at omfatte flere niche faktorer muliggør delvis sammenfatning og tæt lighed af

in vivo

mikromiljø af cancerceller [4, 13, 14], der bidrager til tumorsygdom modellering og personlig kemoterapi screening i lange løb.

tumorer er ikke homogene organer men meget komplekse væv involverende forskellige celletyper, herunder men ikke begrænset til cancerceller, kræft progenitorceller, endotelceller, inflammatoriske celler og cancerassocierede fibroblaster [3, 15-17 ]. Bortset fra de prolifererende neoplastiske parenchymale celler (cancerceller), den støttende stroma består af celler af mesenchymal oprindelse kan udgøre halvdelen af ​​det stromale masse [3]. Den progression af kræft ikke udelukkende afhænger af kræftceller, men også på stromacellerne bosiddende i tumor mikromiljø [18, 19]. Det er blevet vist, at multipotente mesenchymstamceller (MSC) bor i voksent væv [20, 21]. Selvom om disse celler stammer fra knoglemarv stadig kontroversielt, men den tætte lighed af MSC med pericytter langs blodkar væggen giver en anden tiltalende forklaring [22, 23]. Voksende beviser viser, at kræft er forbundet stroma særligt fibroblastceller accelererede tumorvækst [3] og fremmet en eftergivende mikromiljø for kræft metastaser [24, 25]. Nogle resultater indikerer, at mesenkymale stamceller (MSC) ville transit fra knoglemarv til tumor under tumor udvikling [26-29]. Ikke desto mindre forbliver rolle MSC i tumorigenese kontroversiel [26, 30-33]. En velkendt opfattelse er, at den heterotypiske interaktion mellem flere celletyper er nødvendig for nøjagtig lighed af

in vivo

responser. For at nå dette mål, 3D-modeller gør det muligt samspil mellem flere celletyper er attraktive i at studere sådanne komplicerede interaktioner.

Vi har tidligere etableret et kollagen mikroindkapsling platform, der indeslutter levende celler inden for en rekonstitueret nanofibrous kollagen meshwork [34 ]. Kollagenet meshwork er biokompatibel, hvilket giver en fysiologisk relevant mikromiljø permissiv til cellevedhæftning, formering, migrering og differentiering i en lang række celler, herunder MSC’er [34-37], HEK293-celler [38], embryonale stamceller [39], chondrocytter [ ,,,0],40], nucleus pulposus celler [41] og osteoblaster [42]. En væsentlig fordel ved den collagen mikroindkapsling model er den kendsgerning, at skabelonen kollagen meshwork understøtter matrix remodeling, som henviser til en samtidig nedbrydning og aflejring af ekstracellulær matrix, når dyrkning modne celler og differentiere stamceller i 3D. Dette berettiger kraftigt sin nytte i at handle som en model den gentog den

in vivo

cellulære mikromiljø under strukturel og funktionel dannelse væv. En anden stor fordel ved kollagen mikroindkapsling er dens styrbare og miniaturiserede (hundreder af mikrometer i diameter) størrelse [34], at en mikro-væv består af flere hundrede af celler muliggør evnen til økonomisk, personlig og high throughput screening.

neuroblastom (NB) er en pædiatrisk cancer tegner sig for 6% af alle maligne sygdomme, der findes i børn [43]. NB mikromiljø består af ekstracellulær matrix, stromale fibroblaster, vaskulære celler og immunceller [3]. Specifikt har stromale fibroblaster vist sig at forøge tumorvækst, angiogenese og metastase [44, 45]. Rapporter viser også, at co-kultur af neuroblastomceller (NBCs) med andre celletyper ville føre til markant forskellige adfærd. For eksempel, ikke-kontakt co-kultur af NBCs med hepatocytter føre til mindre apoptose aktivitet og højere VEGF-ekspression [46, 47]. I et andet eksempel, co-kultur af NBCs med HUVEC reducerede spores kræftcellerne til neutrofiler [48]. Desuden har cross-samtaler mellem NBCs og Schwann celler vist sig at stimulere NB differentiering, hvilket reducerer aggressivitet tumoren [49, 50] kaste lys på nye terapeutiske strategier. På den anden side har et par rapporter vist, at tilstedeværelsen af ​​MSC vil øge invasivitet af neuroblastom [27, 51, 52]. Selvom rollen som MSC på neuroblastom ikke er helt kendt, er tilstedeværelsen af ​​MSC føre til adfærdsændringer i NBCs. I mellemtiden, selv om alle disse undersøgelser har vist, at NBCs aktivt interagerer med andre celletyper, disse forsøg er alle udført i 2D modeller. En 3D-model permissive til NBCs vækst og proliferation samt interaktioner med stromale celler er endnu ikke blevet rapporteret. I denne undersøgelse, vi hypotesen, at co-mikroindkapsling af NBCs med MSC i kollagen mikrosfærer vil rekapitulere, i det mindste delvist, tumor mikromiljø

in vivo

. Konkret ønsker vi at undersøge morfologi, vækst kinetik og matrix remodeling i co-mikroindkapsling miljø.

neuroblastom (NB) er en pædiatrisk cancer tegner sig for 6% af alle maligne sygdomme, der findes i børn [43]. NB mikromiljø består af ekstracellulær matrix, stromale fibroblaster, vaskulære celler og immunceller [3]. Specifikt har stromale fibroblaster vist sig at forøge tumorvækst, angiogenese og metastase [44, 45]. Rapporter viser også, at co-kultur af neuroblastomceller (NBCs) med andre celletyper ville føre til markant forskellige adfærd. For eksempel, ikke-kontakt co-kultur af NBCs med hepatocytter føre til mindre apoptose aktivitet og højere VEGF-ekspression [46, 47]. I et andet eksempel, co-kultur af NBCs med HUVEC reducerede spores kræftcellerne til neutrofiler [48]. Desuden har cross-samtaler mellem NBCs og Schwann celler vist sig at stimulere NB differentiering, hvilket reducerer aggressivitet tumoren [49, 50] kaste lys på nye terapeutiske strategier. På den anden side har et par rapporter vist, at tilstedeværelsen af ​​MSC vil øge invasivitet af neuroblastom [27, 51, 52]. Selvom rollen som MSC på neuroblastom ikke er helt kendt, er tilstedeværelsen af ​​MSC føre til adfærdsændringer i NBCs. I mellemtiden, selv om alle disse undersøgelser har vist, at NBCs aktivt interagerer med andre celletyper, disse forsøg er alle udført i 2D modeller. En 3D-model permissive til NBCs vækst og proliferation samt interaktioner med stromale celler er endnu ikke blevet rapporteret. I denne undersøgelse har vi den hypotese, at co-mikroindkapsling af NBCs med MSC’er i collagen mikrosfærer vil rekapitulere, i det mindste delvist, tumormikromiljøet in vivo. Konkret ønsker vi at undersøge morfologi, vækst kinetik og matrix remodeling i co-mikroindkapsling miljø.

Metoder

Neuroblastom cellekultur

neuroblastomcellelinje var en slags gave fra Dr. NKV Cheung fra Memorial Sloan Kettering Cancer center, USA. Celler blev dyrket ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) med højt glucoseindhold (Gibco), med tilskud af 10% kalvefosterserum (Gibco), 1% penicillin streptomycin (Gibco), 1% glutar-max (Gibco).

mesenchymstamceller /stromal celle (MSC) kultur

Menneskelige MSC fra knoglemarv [53] blev venligt leveret af prof GCF Chan, Børneafdeling, SKS og ungdomspsykiatrisk Medicin, The University of Hong Kong og dyrkes som monolag som beskrevet tidligere [53]. Den nuværende protokol er blevet godkendt af de kombinerede kliniske etiske komité for University of Hong Kong og Hong Kong West Cluster Hospitaler i Hospital Authority. Kort fortalt blev MSC’er dyrket ved 37 ° C i en CO 5%

2 inkubator i DMEM med lavt glucoseindhold (Gibco), med tillæg på 10% kalvefosterserum (Gibco), 1% penicillin streptomycin (Gibco) og 1 % glutar-max (Gibco). Vækstmediet erstattedes hver 3-4 dage. På omkring 80% konfluens blev hMSC’er isoleret ved trypsinisering med trypsin-EDTA (1X) (Gibco) kortvarigt 0,05% før genbrug suspendering i fuld medium til efterfølgende eksperimenter. Celler ved P6 blev anvendt til efterfølgende eksperimenter.

Kollagen mikroindkapsling

Celler blev mikroindkapslet som tidligere rapporteret [34]. Kort fortalt hMSC og NBCs blev dyrket til sub-konfluens og blev derefter løsrevet ved behandling NBCs og MSC’er med 0,25% og 0,05% trypsin- EDTA (1X) (Gibco) i 5 minutter. NBCs og MSC’er blev blandet ved forskellige forudbestemte nøgletal (NBCs: 100, 80, 50, 20 og 0%) før mikroindkapsling. Rotte hale type I collagen (Becton Dickenson Biosciences, Bedford, MA) blev neutraliseret ved 0,1 N NaOH og fortyndes i forskellige slutkoncentrationer (0,5, 1 og 2 mg /ml). Celleblandinger blev suspenderet i neutraliseret collagen-opløsning for at gøre op celle-matrix-blandinger med forskellige endelige celledensiteter (2.5x10e5, 5x10e5 celler /ml og 1x10e6 celler /ml, svarende til 1250, 2500 og 5000 celler /5 pi droplet, henholdsvis). Væskedråber af celle-matrix-blandinger blev dispenseret på en ikke-klæbende overflade, som er UV-bestrålet parafilm i en 90-mm diameter petriskål (Sterilin, London, England), og derefter inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2 til 45 minutter for at fremkalde gelering. Gelerede collagen mikrosfærer indeholdende både NBCs og MSC’er ved forudbestemte forhold blev forsigtigt skyllet med en co-dyrkningsmedium i en petriskål til frit flydende suspensionskulturer for forskellig varighed (7, 14 og 21 dage). I alt 100 mikrosfærer blev dyrket i hver petriskål. Co-dyrkningsmedium blev blandet ved NBC og MSC dyrkningsmedium ifølge celleindkapsling ratio, genopfyldes hver 2-3 dage.

Måling af dimensionen af ​​celle-matrix mikrosfærer

Den tidsmæssige morfologisk ændring af NBC-MSC-kollagen mikrosfærer blev registreret under et fasekontrastmikroskop op til 21 dage. Diametrene af ca. 10% af mikrokuglernes populationer blev tilfældigt udvalgt og målt ved anvendelse af en lup mikrometer.

Vækst kinetik celler

For hver 200 mikrosfærer blev indkapslet med 2.5e5 celler med forskellige NBC : MSC nøgletal på dag 0, og de var dyrket i 7, 14 og 21 dage. På hvert tidspunkt blev 200 mikrokugler fra hver gruppe spaltet enzymatisk ved collagenase fra Clostridium histolyticum (Sigma) ved 200 enheder /ml for 45-60 min. Enkelte celler suspensioner blev opnået ved behandling de fordøjede aggregater med 0,25% trypsin-EDTA (1X) (Gibco) før tælling ved trypanblåt assay. Væksten af ​​celler i mikrosfærer kunne derefter beregnes.

Flowcytometrianalyse om andelen af ​​NBCS

Enkeltcellesuspensioner (1x10e6 celler) opnået fra collagenase-trypsin fordøjelse af NBC-MSc- collagen mikrosfærer blev resuspenderet i 500 pi co-dyrkningsmedium, inkuberet ved stuetemperatur i en time for at tillade genvinding af celleoverfladen proteinekspression, og blev derefter fikseret med 0,01% PFA i 15 minutter. Celler blev derefter blokeret med 2% gedeserum (Vector Laboratories) i PBS i 30 minutter før indirekte farvning af antistoffer. Til hver prøve, 1 pi af monoklonalt muse-antistof mod Neuroblastom (NB84a, Abcam) i 2% gedeserum (fortynding 1: 100) blev tilsat. Isotypekontroller (normalt muse-IgG-antistof, Millipore) blev udført ved hvert tidspunkt. Efter farvning ved stuetemperatur i 30 minutter blev 1 ml PBS til hvert rør for at vaske de overskydende antistoffer. Efter centrifugering ved 2000 rpm i 5 min blev supernatanten fjernet, og 0,5 pi af Alexa Fluor 647 ged anti-mus sekundært antistof (Invitrogen) i 2% gedeserum (fortynding 1: 200) blev tilsat til hver prøve. Efter farvning i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter blev 1 ml PBS til hvert rør for at vaske de overskydende antistoffer. Efter centrifugering ved 2000 rpm i 5 minutter, blev supernatanten fjernet og Cellepellets blev resuspenderet og bevaret i 500 pi 1% PFA ved en celletæthed på mindst 4x10e5 celler /ml for flowcytometrianalyse i FACSCanto II flowcytometer (BD Biosciences, Bedford , MA). 10.000 begivenheder af hver prøve blev analyseret. Resultaterne blev analyseret med Flowing Software 2.5.1.

Histologi og immunhistokemi af NBC-MSC-kollagen mikrosfærer

NBC-MSC-kollagen mikrosfærer fastsat i 4% PFA ved stuetemperatur i mørke for 30 minutter, og blev dehydreret ved anvendelse af en seriel gradient ethanol behandling før behandling til paraffinsnit af 5 um tykkelse. Rutinemæssig hæmatoxylin og eosin (Sigma) farvning blev udført for at afsløre cellemorfologien i mikrosfærerne. At evaluere forekomsten af ​​NBCs, et primært antistof (ab49501, Abcam) anvendt. Anti-muse-sekundært antistof (BA-1000, Vector Laboratories) blev anvendt i immunhistokemi, efterfulgt af ABC-farvning, diaminobenzidin mærkning, og kontrafarvning hjælp hæmatoxylin. At evaluere forekomsten af ​​type I collagen, et primært antistof (C2456, Sigma), blev anvendt. Anti-muse-sekundært antistof (BA-1000, Vector Laboratories) blev anvendt i immunhistokemi, efterfulgt af ABC-farvning, diaminobenzidin mærkning, og kontrafarvning hjælp hæmatoxylin. At evaluere forekomsten af ​​Matrix-metalloproteinase 9, et primært antistof (ab38898, Abcam) anvendt. Anti-kanin sekundært antistof (BA-2000, Vector laboratorier) blev anvendt i immunhistokemi, efterfulgt af ABC farvning, diaminobenzidin mærkning, og modfarvning hjælp hæmatoxylin.

Dataanalyse og statistik

Kvantitative resultater, herunder mikrokugle dimension, celleantal og NBC andele blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelser hvis ikke andet er angivet. To-vejs ANOVA med passende post hoc tests blev anvendt til at afsløre statistisk signifikante forskelle blandt forskellige grupper. Betydningen niveau blev sat til 0,05 og SPSS 19,0 (IBM, NY, USA) blev anvendt til at udføre statistisk analyse.

Resultater

Morfologisk karakterisering af NBC-MSC-kollagen mikrosfærer

fig 1A1-1E6 viser brutto udseende NBC-MSC-kollagen mikrokugler i forskellige grupper. De sfæriske optrædener var ens i begyndelsen af ​​dyrkningen, men blev varieret på et senere tidspunkt, som mikrokugler i grupper med højere initial NBC andel gradvist mistet deres kugleform og blev uregelmæssige i konformation, hvilket tyder overvækst. Under dyrkning blev observeret små mikro- masser i suspension i NBC 100%, 80% og 50% grupper efter den første uge. Mens i NBC 20% gruppe, observerbare masserne viste sig efter den anden uge. Den NBC 80% gruppe havde relativt større mængde af mikro-masserne end i andre grupper. Der var ingen overvækst mikro-masserne i NBC 0% (100% MSC gruppe). Fig 1F viser ændringen i dimensionen af ​​mikrokuglerne under dyrkning. Der var betydelig sammentrækning af mikrokuglerne i den første uge i alle grupper, efterfulgt af stigninger i diameter i alle cancer celle indeholdende grupper, hvilket tyder på tumorigen vækst. I mellemtiden, fusion og sammenlægning af mikrosfærer overholdes. Grafen viser også, at omfanget af sammentrækning og udvidelse er afhængig af NBCs indhold. Alle grupper undtagen NBC 100% en dramatisk reduceret i størrelse i den første dag efter indkapsling. Mikrosfærer indeholdende sunde MSC kun (NBC 0%) kontinuerligt drop i størrelse over tid. Den NBC 20% gruppen viste en konstant dimension efter den indledende fald i størrelse, mens grupper med 50% eller mere NBCs begyndte at stige i størrelse efter 7 dage, hvilket tyder på en hurtig vækst af tumorcellerne. To-vejs ANOVA viste, at både tidsfaktoren (p 0,001) og NBC: MSC-forhold (p 0,001) væsentligt påvirket dimensionen af ​​mikrosfærerne. Bonferroni post hoc test viste, at bortset fra day1-day14 (p = 0,518) og Day3-Dag 7 (p = 1,000) par, alle andre sammenligninger var statistisk signifikant forskellig fra andre (p 0,001), mens alle NBC: MSC forholdet grupper var statistisk signifikant forskellig fra andre (p 0,001)

Mikrosfærer med forskellig procentdel af NBCs og dermed NBC:. MSC-forhold: (A): 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (20% MSC) og (E): 100% NBC (0% MSC) blev dyrket i forskellige tidsrum: 0 (A1, B1, C1, D1, E1); 1 (A2, B2, C2, D2, E2); 3 (A3, B3, C3, D3, E3), 7 (A4, B4, C4, D4, E4), 14 (A5, B5, C5, D5, E5) og 21 (A6, B6, C6, D6, E6 ) dage (skala bars: 100 um: A2, A3, A4, A5, A6, B2, B3, B4, B5, B6, C2, C3, C4, C5, D2, D3, D4, 500 um: A1, D5, E3, E4, E6, 1000 pm: B1, C1, C6, D1, D6, E1, E2, E5); (F): Linje diagram, der viser den tidsmæssige ændring i dimensionen (middelværdi ± 1SD) af NBC-MSC-kollagen mikrosfæreformuleringer populationer under kulturer

Morfologiske ændringer af NBC-MSC-kollagen mikrosfærer ved forskellige. NBC: MSC nøgletal, tidspunkter, initial celledensitet og kollagen koncentration

fig 2 viser H (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (30% MSC); (E): 100% NBC (0% MSC). A1, B1, C1, D1, E1: dag 7; A2, B2, C3, D2, E2: dag 14; B3, C3, D3, D3a, E3: dag 21 efter kultur (Scale barer: 100 um)

(A1-A3):. 1250 celler /mikrosfære; (B1-B3): 2500 celler /mikrosfære; (C1-C3): 5000 celler /mikrosfære; 1: 7 dage; 2: 14 dage; 3: 21 dage (skala barer: 100 um)

Fig 3 viser H (B): 2 mg /ml; 1: 7 dage; 2: 14 dage (skala barer: 100 um).

Vækst kinetik i NBC-MSC-kollagen mikrosfærer

Fig 5A viser linjen grafen på celletallet i NBC-MSC -collagen mikrokugler med forskellige NBC: MSC-forhold på forskellige tidspunkter i løbet af co-kultur. Mikrosfærer med 0% NBC viste dvs. 100% MSC’er en kontinuerlig fald i celletallet. På den anden side, alle grupper, der indeholder cancerceller viste en positiv vækst over tid. De 20% gruppe udviste gradvis stigning i de første 2 uger og alle i en pludselig antallet dramatisk forøget eksponentielt på dag 21. 100% NBC gruppe (0% MSC) viste signifikant flere tidlige kulturer på dag 7 end andre grupper, men at ikke gav denne gruppe yderligere vækst fordel i senere dage. Lignende tendenser blev fundet i 50% og 80% NBC: MSC-grupper. To-vejs ANOVA viste, at både tidsfaktoren (p 0,001) og NBC: MSC-forholdet faktor (p 0,001) signifikant påvirket celleantal. Bonferroni post hoc tests viste, at 0% NBC (100% MSC) signifikant forskellig fra alle andre grupper (p = 0,003). De 20% NBC gruppen viste signifikante forskelle på 0% (p = 0,003), 80% (p = 0,033) og 100% (p = 0,008), henholdsvis. De 50% NBC gruppe, og de 80% og derefter 100% var ikke signifikant forskellige indbyrdes (p = 0,342). Den 100% NBC viste kun signifikant forskel fra 0% og 20% ​​NBC: MSC-forhold (p = 0,008). Interessant, startende med det samme celleantal viste 20% NBC gruppe en meget lavere (~ 2 dage) fordoblingstid, som måler den tid, det tager for cellepopulationen at fordoble sig selv, i sammenligning med højere NBC: MSC-forhold (Fig 5B ). 0% NBC (100% MSC) gruppe viste ingen vækst, mens 100% NBC (0%) viste meget lavere fordoblingstid ( 6 dage).

På dag 7, dag 14 og dag 21, 200 mikrosfærer blev fordøjet tælle celleantallet. (A): Vækst kinetiske kurver, som viser ændringerne i antallet af celler over tid ved forskellige indkapslingsmaterialer forhold (middelværdi ± 1SD); (B):. Befolkning fordoblingstid for forskellige grupper

Temporal ændring i andelen af ​​NBC i mikrokuglernes

Fig 6A viser procenterne af NBCs blandt forskellige grupper over tid. I 20% NBC gruppe, blev procentdelen af ​​NBCs holdt ved omkring 20% ​​på dag 7 og 14, men dramatisk øget til 33% på dag 21 (figur 6A). På den anden side viste 50% og 80% NBC grupper tilsvarende niveau for NBCs over tid. Fig 6C viser den repræsentative histogram af flowcytometri-basen tælling af NBCs i forskellige grupper. Fig 6B viser procentdelen af ​​NBCs beregnet ud fra data opnået ved flowcytometri. Two-Way ANOVA viste, at NBC: MSC-forholdet faktor (p 0,001) væsentligt påvirket procentdelen af ​​NBC overtid, men ikke tidsfaktoren (p = 0,85). Bonferroni post hoc test viste, at 20% NBC gruppe signifikant forskellig fra 50% (p 0,001) og 80% (p 0,001) henholdsvis. De 50% NBC gruppen og 80% var ikke signifikant forskellige indbyrdes (p = 0,366)

(A):. Fejl søjlediagrammer viser andelen af ​​NBCs bestemt via flowcytometri (gennemsnit ± 1SD); (B): Tabel som viser den gennemsnitlige procentdel af NBCs i forskellige grupper og på forskellige tidspunkter; (C): Repræsentative histogram, der viser celler farvet med isotype kontrol antistof og celler blev farvet med NB84a antistof i forskellige grupper på forskellige tidspunkter

Immunhistokemi af type I kollagen

Fig 7. viser den immunhistokemiske analyse af collagen type i i NBC-MSC-kollagen mikrosfærer. I 0% NBC (100% MSC) gruppe, type I kollagen positiv mikrosfære forblev sfæriske, selv om det bliver mere porøs på 14 dage (fig 7A og 7B). I de 20% NBC grupper, mikrosfæren var intakt på dag 7, men begyndte at nedbrydes på dag 14 og var næsten helt nedbrudt på dag 21 (fig 7B2 og 7B3). For 50% NBC gruppe, mikrosfærerne var stadig intakt på dag 7 (Fig 7C1), men mere porøs på senere tidspunkter (fig 7C2 og 7C3). Denne tendens var ens i de 80% NBC gruppe (figur 5B). Type I kollagen udtrykkende celler, som sandsynligvis vil være MSC, var for det meste begrænset inden for de mikrokugler selv om nogle blev identificeret lejlighedsvis i udvækst udenfor mikrosfærer (Fig 7F og 7G)

(A):. 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (30% MSC); (E): 100% NBC (0% MSC). A1, B1, C1, D1, E1: dag 7; A2, B2, C3, D2, E2: dag 14; B3, C3, D3, D3a, E3: dag 21 efter kultur (Scale barer: 100 um).

Immunhistokemi af MMP9

Fig 8 viser immunhistokemisk farvning af MMP9 af NBC-MSC-kollagen mikrosfærer med fast 80% NBCs og med forskellige celledensiteter og kollagen koncentrationer. De kollagen regioner viste positiv farvning mens MMP9-udtrykkende celler blev fundet både i out-vækst og de perifere lag af celle masser (Fig 8A1, 8B1, 8B2 og 8C1)

(A):. 5000 celler /ml; (B): 2500 celler /ml; (C): 1250 celler /ml; 1: 0,5 mg /ml; 2: 1 mg /ml; 3: 2 mg /ml (skala søjler: 100 um).

Diskussion

In vitro kræftmodeller

For at fremskynde præklinisk stof screening og til at opnå personlig medicin i fremtiden, udvikling af sygdom eller patient-specifikke in vitro model er af stor betydning [54]. Som beskrevet ovenfor er konventionelle 2D monolag modeller kritiseres for deres ikke-fysiologiske kultur miljø og de er ikke i stand til at rekapitulere in vivo tilstand, derfor producerer upålidelige data. Med fremskridt inden området vævsmanipulation, er anvendelsen af ​​et in vitro tredimensionel model efterligner tumorer blive mere populære. [55-57]. Et vigtigt aspekt i fremstilling af en in vitro-model ville være valget af biomaterialer, som kunne være af naturlig oprindelse eller kunstigt syntetiseret. Talrige undersøgelser har vist lovende resultater ved hjælp af naturlige biomaterialer såsom collagen, fibrin, Matrigel [58] og hyaluronsyre. Med deres lette adgang, brugervenlighed og høj bioaktivitet, de er populære og attraktive valg for forskere. Kollagen har en fremragende biokompatibilitet og ubetydelig immunogenicitet. Disse egenskaber gør det muligt for forskerne at bruge kollagen som et passende materiale til in vitro-cancer model. Men den lette nedbrydning, undefined matrixsammensætning og svage mekaniske egenskaber er deres problemer. Desuden høj batch-til-batch heterogenitet i sammensætningen gør sammenligning mellem forskellige undersøgelser meget vanskelige. På den anden side, syntetiske materialer, såsom PA, polyester, PEG besidder indstillelige parametre og muliggøre en mere præcis styring af materialeegenskaber [59], hvilket fører til mindre kompleksitet, høj reproducerbarhed og sammenlignelighed mellem forskellige undersøgelser. Endnu nogle af dem er giftige og de kræver mere sofistikerede behandlingstrin før de kan anvendes til modellering. PEG-baserede hydrogel, for eksempel, har ikke-fibrillær struktur og kræver enten fysiske eller kemiske tværbindende processer [60-62]. Disse ville påvirke cellulær adfærd og brugervenlighed sammenlignet med naturlige polymerer, såsom collagen. Faktisk er en universel biomateriale egnet til alle sygdomsmodeller ikke eksistere.