PLoS ONE: EGF-induceret Acetylering af heterogene Nuclear ribonucleoproteiner er afhængig af KRAS-mutationsstatus i Colorectal Cancer Cells

Abstrakt

KRAS

mutationsstatus betragtes som en negativ prædiktiv markør af respons på anti-EGFR behandlinger i kolorektal cancer (CRC) patienter. Der er dog modstridende data vedrørende den variable respons på EGFR-målrettet terapi. Virkningerne af onkogen

KRAS

på downstream mål blev undersøgt i cellelinjer med forskellige

KRAS

mutationer. Celler indeholdende et enkelt

KRAS

G13D

allel viste den mest tumorigen profil, med konstitutiv aktivering af downstream vej, gør dem EGF-afvisende. Omvendt

KRAS

A146T

celler viste en fuld EGF-respons i form af signaltransduktionsveje, celledeling, migration eller vedhæftning. Desuden globale acetylome af CRC celler var også afhængig af

KRAS

mutationsstatus. Flere hnRNP familiemedlemmer blev identificeret inden for de 36 acetylerede-proteiner. Acetylering status er kendt for at være involveret i modulering af EGF-respons. Efter aftale med resultater præsenteres heri, blev hnRNPA1 og L acetylering induceret i respons på Globaliseringsfonden i

KRAS

A146T

celler, hvorimod hnRNPA1 acetyl-og L-niveauer forblev uændret efter vækstfaktor behandling

KRAS

G13D

reagerer celler. Vores resultater viste, at hnRNPs induceret-acetylering er afhængig af KRAS mutationsstatus. Ikke desto mindre hnRNPs acetylering kan også være det punkt, hvor forskellige onkogene veje konvergerer

Henvisning:. Roda D, Castillo J, Telechea-Fernández M, Gil A, López-Rodas G, Franco L, et al. (2015) EGF-induceret Acetylering af heterogene Nuclear ribonucleoproteiner er afhængig

KRAS

mutationsstatus i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 10 (6): e0130543. doi: 10,1371 /journal.pone.0130543

Redaktør: Matias A. Avila, University of Navarra School of Medicine og Center for Anvendt Medical Research (CIMA), SPANIEN

Modtaget: April 1, 2015; Accepteret: 22 maj 2015; Udgivet: 25 juni 2015

Copyright: © 2015 Roda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra spanske regering, Ministerio de Economía y Competitividad og FEDER tilskud (FIS PI09 /02.480 og PI12 /02767 til AC; FIS PI12 /02.394 til ERGT og FIS PI12 /02110 til GLR) og Generalitat Valenciana (PROMETEO 2013-005 til AC). DR holdt et stipendium fra Ministerio de Ciencia e Innovación (Rio Hortega Program) og fra Sociedad Española Oncología Médica (SEOM); MTM er en pre-doc fra Generalitat Valenciana (Prometeo) og AG er en modtager af postdoc stipendium fra spanske sammenslutning Against Cancer (AECC, Provincial bestyrelse Baleares)

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke eksisterer konkurrerende interesser.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest udbredte tumorer verdensplan [1], og på trods af mange fremskridt i terapi, langsigtet overlevelse for patienter med metastatisk sygdom er stadig fattige [2]. Antistoffer mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) er blevet brugt med held i CRC patienter med fremskreden sygdom. Men mindre end halvdelen af ​​dem reagerer på sådan terapi [3].

KRAS

eller

NTM

mutationer er de vigtigste negative prædiktive markører til EGFR-respons [4]. Derfor behandling med anti-EGFR-antistoffer er kun overvejes hos patienter med en fuld

RAS

vildtype fænotype [5, 6]. RAS-proteiner sikrer signaltransduktion mellem membranreceptorer, såsom EGFR, og intra-cytoplasmatiske serin /threonin-kinaser; dermed bidrage til regulering af en række væsentlige cellulære funktioner. Muteret RAS gør proteinet til en konstitutivt aktiv form, som igen deregulerer nedstrøms signalveje [7]. Men flere kliniske og eksperimentelle data indikerer, at ikke alle

RAS

mutationer er lige i deres biologiske egenskaber, og derfor kunne de give variable effekter [8, 9]. De hyppigste KRAS mutationer findes i CRC patienter er i codon 12 og 13. Men aktivering af

KRAS

mutationer i codon 61 og 146 er for nylig blevet associeret med kortere progressionsfri overlevelse sammenlignet med vildtype

KRAS

i CRC-behandlede patienter [10]. Desuden tumorceller under tryk inhibere deres onkogene pathways udvikler spontane mutationer. Faktisk metastatisk CRC patienter igangværende antitumoral behandling erfaring

KRAS

genotypeforandringer [11]. Vi observerede også denne virkning i dyrkede celler; sletning af en muteret

KRAS

G13D

allel i HCT116 celler (

KRAS

G13D /WT

) inducerede en spontan

KRAS

A146T

mutation i den resterende vildtype allelen. For at afdække de molekylære mekanismer bag forskellen respons observeret i tumorceller med forskellige mutationer i

KRAS

synes et stort problem for udvikling af nye anti-tumor behandlingsformer og personlig medicin.

For nylig, en roman deacetylase-afhængig mekanisme er blevet foreslået for at forklare resistens mod anti-EGFR terapier i mutant

KRAS

lunge adenocarcinomceller [12]. Acetylering er en post-translationel reversibel modifikation reguleret af to typer af enzymer: lysin deacetylaser (KDACs) og lysin acetyltransferaser (Kats). Faktisk har deacetylase-hæmmere dukket op som potentielle antitumormidler ved at øge hyperacetylering af både histoner og nonhistone proteiner [13]. Desuden er nogle rapporter beskriver samspillet mellem KDAC inhibitorer og RAS-ERK signalering kaskade i cellelinjer udviser forskellig mutationsstatus i

KRAS

,

BRAF eller PI3KCA

[14-17].

de efterfølgende virkninger af mindre hyppige, men ikke mindre vigtigt

KRAS

A146T

mutation er endnu uklart. I denne artikel vurderer vi effekten af ​​

KRAS

A146T

mutation

versus KRAS

G13D

på celleproliferation, vedhæftning og migration af HCT116-afledte CRC cellelinjer. I betragtning af den nyligt beskrevne samspil mellem acetyleringer og RAS-ERK signalering kaskader, vi undersøgte også effekten af ​​KRAS mutations status på protein acetylering mønster for at få indsigt i de potentielle molekylære mekanismer bag den differentierede effekt af

KRAS

mutationer .

Materiale og metoder

2.1. Materialer

Antistoffer mod hnRNPA1 (ab5832, ab50492), hnRNPA3 (ab50949), hnRNPA

2 /B

1 (ab64800), hnRNPL (ab6106, ab65049) og GAPDH (ab8245) eller β- actin (ab8227) som lastning kontrol, var fra Abcam. Antistoffer mod acetyl-Lys (9441), Pakt (40.665) og AKT (9272) var fra Cell Signaling Technology. Andre anvendte antistoffer var: ERK (sc-93) og pERK (sc-7383) fra Santa Cruz Biotechnology; KRAS (05-516) fra Millipore og Talin (T3287) fra Sigma-Aldrich.

epidermal vækstfaktor (EGF 20 ng /ml), trichostatin (TSA, 0,5 uM) og natriumbutyrat var fra Sigma-Aldrich, UO126 (10 pM) fra Promega, LY294002 (10 pM) fra Calbiochem og fibronectin fra BD Biosciences.

2.2. Celledyrkning

Tyktarmskræft cellelinjer HCT116 og deres derivater HAE6 og HAF1 blev kommercielt erhvervet fra den GRCF Biorepository og Cell Center, ved Johns Hopkins University. Alle cellelinier blev dyrket i McCoys 5A Modified Medium (Gibco) suppleret med 10% FBS, penicillin /streptomycin og L-glutamin og holdt under standardbetingelser.

2.3. Proteinekstraktion og Immunblotanalyse

Total proteiner blev ekstraheret i RIPA puffer suppleret med inhibitorer og natriumbutyrat. Lige store mængder proteiner blev elektroforeret i SDS-PAGE geler og overført til nitrocellulosemembraner og immunblottet som beskrevet andetsteds [18]. Blots blev udviklet af forbedret chemoluminiscence (ECL Detection Kit, GE Healthcare). Proteinniveauer blev kvantificeret ved densitometri og normaliseret ved β-actin eller GAPDH-ekspression.

2.4. 2D-elektroforese og acetylome analyse

Proteinekstrakter (100 ug) blev separeret ved todimensional (2D) elektroforese som tidligere beskrevet [18]. Proteomisk billeder blev erhvervet med Typhoon Trio Imager. Parallelt hermed blev 2D-geler elektroblottet på nitrocellulosemembraner og analyseres ved Western blot med anti-acetyleret lysin-antistof. Acetylerede proteiner overlappende med SYPRO Ruby-farvede geler blev skåret til MS-analyse. Gel prøver blev behandlet med en MassPrep station (Waters). NanoLC-ESI-MS /MS og dataanalyse blev udført som beskrevet [19] af den Proteomics og Bioinformatik Unit, (CIMA-Navarra Universitet, Spanien).

2.5. Immunfældning

500 ug af proteiner blev immunpræcipiteret natten over med specifikke antistoffer eller normalt serum-IgG (Dako) ved 4 ° C på en roterende indretning. Protein-antistof-komplekser blev trukket ned med 50% (v /w) Dynabeads (Invitrogen, Life Technologies). Efter flere vaske i PBS blev immunkomplekser udvundet ved kogning i LB og derefter analyseret ved Western-blot som beskrevet. 1% af protein ekstrakter anvendes til immunopræcipitation blev indlæst som Input.

2.6. RNA-isolering og ekspression analyse ved qPCR

RNA-ekstraktion, komplementær DNA-syntese og QRT-PCR blev udført som preciously beskrevet. [18]. Primer sekvenser for

hnRNPA1

,

hnRNPA3

,

hnRNPA2 /B1

,

hnRNPL

GAPDH

er vist i supplerende data. Pre-udviklede Taqman primere til

KRAS

,

ADAM19

,

Cathepsin C

,

Cathepsin L

18S

var fra Applied Biosystems. Relativ genekspression blev udtrykt som 2

-Δ (ACt) Data blev normaliseret ved

18S

kvantificering i den samme prøve reaktion. Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer.

2.7. Microarray genekspression. Hybridisering og dataanalyse

Totalt RNA (5 ug) blev anvendt til at få biotinyleret cRNA ifølge fabrikantens protokol (Affymetrix). Kvaliteten af ​​det mærkede cRNA blev bekræftet ved hybridisering til en Affymetrix test chip (Test3-chip). Mærket cRNA blev hybridiseret til en Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0ST. Microarray data blev opnået ved AGCC Affymetrix software. Rådata tre gentagelser for hver cellelinje blev analyseret ved R /BioConductor hjælp af Limma pakke [20]. F-statistik, t-statistik og log odds for differentieret udtryk blev beregnet ved empirisk Bayes moderation af de standard fejl mod en fælles værdi. Differentielt udtrykte gener blev identificeret ved parvise sammenligning, (p-værdi cutoff = 0,05). Kun gener med en fold ændring over 1,5 og under -1, blev anset differentielt udtrykte for yderligere analyser og klassificeres efter den biologiske proces kategori efter kriterierne i Gene Ontology Consortium [21].

2.8. BrdU Celleproliferationsassay

Cell proliferation blev undersøgt af en bromdeoxyuridin (BrdU) inkorporering assay kit (Calbiochem). Kort fortalt blev cellerne podet ved en densitet på 5×103 celler /brønd i en 96-brønds dyrkningsplade. Efter 24 timers sult blev celler behandlet med EGF (20 ng /ml) i serum-frit medium. BrdU reagens blev tilsat til brøndene i 4 timer i nærvær eller fravær af EGF. Ved de angivne tidspunkter blev celler fikseret i 30 min i en fiksativ /denaturerende opløsning. Celler blev inkuberet med anti-BrdU-antistof (1: 100) i 1 time, og efter adskillige vaske, inkuberet med HRP-konjugeret IgG i 30 min. Tetra-methyl-benzidin substrat blev derefter tilsat i 15 min, og reaktionen blev standset ved tilsætning af 1,25 M svovlsyre stopopløsning. Absorbansen blev målt i hver brønd ved dobbelte bølgelængder 450-540nm.

2.9. Sårhelende assay

De tre cellelinjer blev dyrket under standardbetingelser. Sammenflydende monolag blev ridset med en 10 pi pipettespids at inducere et sår. De sårede kanter blev afbildet ved hjælp af et omvendt mikroskop Nikon Eclipse Ti (10x forstørrelse). Billeder blev opsamlet ved 0, 24 og 48 timer efter bunden.

2.10. Statistisk analyse

Data er middelværdier ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg. Signifikante forskelle blev bestemt ved én-stikprøve Students t-test. Forskelle blev betragtet som signifikante ved

s

0,05. Repræsentative blots vises.

Resultater

3 fotos.

1

. Differential effekt af

KRAS

A146T

og KRAS

G13D i EGF-behandlede CRC celler

HCT116 CRC-cellelinje, der huser en endogen aktivering

KRAS

G13D /vægt mutation, og to isogene HAF1 (

KRAS

vægt /-) og HAE6 (

KRAS

G13D /-) kloner blev anvendt til denne undersøgelse. Alle disse gener anbefales at forudsige en klinisk resultat for kræftbehandling blev sekventeret i de tre cellelinjer [22] (S1 tabel). Interessant, mens alle mutationer findes i HCT116 også blev observeret i HAE6 celler, fandt vi, at i HAF1 celler en

KRAS

A146T

hotspot mutation havde spontant opstået i hvad hidtil var hensigten at være en vildtype-allel. I betragtning af dette resultat, vi karakteriseret

KRAS

A146T

celler og sammenlignet dem med HCT116 eller HAE6 cellelinier (S1 Fig og S1 fil). HAE6 celler viste den højeste spredning sats og de laveste niveauer af celleadhæsion. En sårhelende analyse af cellemigrering afslørede forskelle blandt de tre cellelinier (med HCT116 viser et højere tempo end HAF1 men lavere end HAE6 celler. I modsætning til de tidligere resultater,

KRAS

mutationsstatus havde tilsyneladende ingen effekt på ERK og AKT phosphorylering, under basale betingelser. Dette er ikke overraskende, da de tre cellelinjer huser en PIK3CA aktiverende mutation.

KRAS

A146T

syntes at være den mindre tumorigene mutation. Alligevel usynkroniseret cellekultur under basale betingelser kunne maskere virkningen af ​​KRAS mutation som reaktion på en specifik stimulus. Derfor til yderligere at udforske nedstrøms virkning

KRAS

A146T

versus godt karakteriseret

KRAS

G13D

mutation, HAF1 og HAE6 celler blev dyrket i serum-berøvet medier og derefter stimuleret med EGF. for at udelukke muligheden for, at mutationen kan påvirke

KRAS

ekspression, qPCR blev udført, og

KRAS

mRNA-niveauer fundet i begge cellelinier var ens (data ikke vist). Selvom EGF-behandling inducerede hurtig phosphorylering af ERK1 /2 og AKT i HAF1, dette svar var dårlig i HAE6 celler (Fig 1A). Mærkbar, Perk niveauer var allerede høje i ubehandlede HAE6 kontroller. Hertil kommer, som allerede er beskrevet i andre cellelinjer med en hyperaktiveret ERK pathway [23], EGF faldt Pakt niveauer i denne HAE6 cellelinje.

A. Downstream mål for KRAS-signalvejen blev analyseret ved western blot for at bestemme Pakt og pErk1 /2-niveauer efter EGF-behandling. B. Celleadhæsion blev bestemt ved western blot-analyse af Talin spaltning i HAF1 og HAE6 celler. C. Migration-forholdet blev undersøgt efter EGF (20 ng /mL) behandling ved sårheling assay. Graf viser procentdelen af ​​celler, der migrerede til sårområdet efter 24 timer. D. Celleproliferation, målt ved BrdU-assay, til at analysere proliferativ aktivitet i EGF-behandlede (20ng /ml) celler. * P 0,05 EGF-behandlede versus ubehandlede kontroller (n = 4)

kunne ikke udføres celleadhæsion eksperimenter i serumfrie medier, fordi HAF1 celler følsomme over for trypsinbehandling efter 24h-serum deprivation.. En højere talin-spaltning er blevet forbundet med lavere celleadhæsion [24]. Derfor har vi analyseret kløvet-Tallinn som en indirekte metode til at måle celleadhæsion. I ustimulerede celler, talin-spaltning var allerede højere i HAE6 end i HAF1 celler. Endvidere medens talin-spaltning blev induceret i respons til EGF i HAF1 celler, dette proteolytisk spaltning var EGF-uafhængig i HAE6 celler (Fig 1B). Vi analyserede næste cellevandring og fandt, at HAE6 celler blev også reagerer på EGF, i modsætning til cellemigrering induceret af EGF i HAF1 cellelinje (figur 1C). Endelig celleproliferation, selvom induceret af EGF i begge cellelinier, blev forøget i mindre omfang i HAE6 end i HAF1 celler (Fig 1D). Vi ræsonnerede, at hyperaktivering af ERK1 /2 induceret af KRAS

G13D kunne nå et plateau over hvilke celler ikke kan blive yderligere stimuleret af EGF.

3.2. Differential mRNA-niveauer i KRAS

G13D vs KRAS

A146T CRC cellelinjer

Vi undersøgte de mulige KRAS-afhængige transkriptionelle effekter i begge cellelinier ved hjælp Affymetrix mikromatrice (S2 og S3 filer). Under tilstedeværelse af

KRAS

G13D

mutation, mest differentielt udtrykte gener blev nedreguleret (fig 2A og 2B, S2 Fig) sammenlignet med

KRAS

A146T

mutation (HAF1). Men ekspressionen af ​​flertallet af gener ikke væsentligt ændrer, og kun få af dem blev opreguleret. For at validere disse data blev udtryk for et udvalg af up-regulerede gener analyseret af qPCR. Disse gener blev udvalgt for deres fremtrædende rolle i tumormetastase, vækstfaktor udgydelse eller CRC lægemiddel-resistens [25, 26]. Udtrykket af disse gener var dramatisk opreguleret i celler med et muteret

KRAS

G13D

allel, hvilket bekræfter de microarray data (Fig 2C og S2 Fig). Blandt generne nedreguleret i HAE6 vs. HAF1 celler, den mest repræsentative vej påvirkes var EGFR1 signalering; 43 gener blev nedreguleret ud af 156 beskrevet for EGFR1 kanoniske pathway. Imidlertid kan andre veje udløst af cytokiner og vækstfaktorer, såsom VEGF, PDGF, HGF, IGF1, TGFp, TNFa og adskillige interleukiner, blev også nedreguleret. Dette er ikke overraskende, da de fleste af dem har flere trin i RAS signalvejen.

Samlet RNA fra CRC celler dyrket i basale betingelser med 10% FBS blev analyseret ved microarray. A. Venn-diagram, der viser procentdelen af ​​op- og ned-regulerede gener fundet i cellelinjen huser et

KRAS

G13D

mutation (HAE6), når der sammenlignes med mRNA-niveauer findes i HAF1 celler (

KRAS

A146T

)

. B. Bar diagram, der repræsenterer differentielt udtrykte gener (p-værdi ≤ 0,001) blandt de to cellelinjer HAE6

versus

HAF1 celler, overvejer kun-log2 fold ændring 1,5 og -1,5. Gene symbol for hvert gen er angivet til venstre. C. Tre gener,

Cathepsin L

,

Cathepsin C

ADAM19

blev udvalgt på grundlag af deres potentielle rolle på celle invasion og migration, for microarray validering ved hjælp af qPCR. * P 0,05 versus HAF1 celler.

3.3. Effekt af KRAS-mutationer på den globale acetylome af CRC

En af de potentielle veje ramt af KRAS mutations status, som kan regulere flere biologiske processer er protein acetylering. Vi søgte at undersøge, om den globale acetylering profil i CRC blev forskelligt påvirket af aktiverede KRAS

G13D og aktiveret KRAS

A146T. Isolerede proteiner fra begge cellelinier dyrket i 10% FBS, blev immunpræcipiteret og analyseret ved Western blot med anti-acetyl-Lys-antistoffer (Fig 3A). En 2D western blot proteom fremgangsmåde blev anvendt til dybt analysere acetyleret proteiner fra de to cellelinier. Global protein Lys-acetylering blev øget i HAE6 forhold til HAF1 celler, ifølge øget antallet af opdagede pletter (Fig 3B).

A. Cellehomogenater blev immunfældet med anti-acetyl-lysin-antistof, og præcipitaterne blev derefter immunblottet mod acetyl-lysin rester, herunder en lige mængde udgangsmateriale homogenat (opkaldt Input). IgG: Homogenater immunfældet med normalt serum-IgG. Molekylmassemarkører (kDa) er på venstre side af gelen. B. Proteinekspression profiler af begge cellelinier adskilt af IEF todimensional PAGE, farvet med SYPRO Ruby (venstre panel) eller immunblottet mod acetyl-lysin-antistof til at identificere acetylerede proteiner (højre panel). PH-værdien forøges fra venstre mod højre på abscissen og molekylmassen aftager fra top til bund på ordinaten. C. Fordeling af GO Biologiske opgaver til de acetylerede proteiner identificeret i acetylome af HAE6 celler.

Positive pletter fra HAE6 acetylome blev skåret ud og identificeret ved massespektrometri. 67 pletter blev opdaget, men kun dem med en sikker Mascot ion score og en høj peptid matching blev udvalgt (S2 tabel). Den (GO) biologisk funktion analyse af vores 36 acetylerede proteiner afslørede, at target proteiner blev beriget i fire hovedkategorier relateret til cellevækst, energiomsætning, RNA metaboliske proces og protein metabolisme (figur 3C). Mange af disse proteiner blev allerede beskrevet til at være mål for formodede acetyltransferaser eller deacetylaser og at blive acetyleret under forskellige eksperimentelle betingelser (anmeldt i S2 tabel). Vores microarray resultater bekræftede, at forskelle i acetyleringen mønsteret ikke var på grund af øget mRNA-ekspression. Faktisk disse gener, hvis produkter blev identificeret i vores acetylome analyse forblev uændret i HAE6 forhold til HAF1 celler (S2 og S3 filer).

3.4. Acetylering af hnRNP familiemedlemmer

Blandt de acetylerede-mål var der en interessant gruppe af RNA-bindende proteiner, der alle er medlemmer af familien af ​​heterogene nukleare ribonucleoproteiner (hnRNPs), der er involveret i en række forskellige molekylære funktioner går fra mRNA forarbejdning, transport, stabilitet eller endda oversættelse [27]. Vi analyserede i de to cellelinier, om den basale acetylering af hnRNPs var afhængig af

KRAS

mutationsstatus. Acetylering blev målt ved immunopræcipitationsforsøg med acetyl (Lys) antistoffer efterfulgt af western blot med antistoffer, der genkender den specifikke hnRNP medlem. Som vist i fig 4A, hnRNPA1 og A2 /B1 fandtes at være hyperacetylated under vækstbetingelser (10% FBS) i HAE6 sammenlignet med HAF1; Men dette mønster var ikke så klart i andre familiemedlemmer testet såsom hnRNPA3 eller L. mRNA’et og proteinniveauer af hnRNPs blev analyseret ved qPCR og Western blot (fig 4B og 4C); ekspressionen af ​​ingen af ​​hnRNPs viste en signifikant ændring sammenlignet blandt de forskellige cellelinier. Derfor bør de forskellige niveauer af acetylering observeret, er ikke et resultat af en højere genekspression eller proteinstabilisering.

A. Totale ekstrakter fra de to CRC cellelinier under basale betingelser (10% FBS) blev isoleret og immunpræcipiteret med α-acetyl-lysin antistoffer. Den immunopræcipiterede prøve blev derefter analyseret ved Western blot med antistoffer, der genkender den specifikke hnRNP element (venstre panel). Input af hver specifik hnRNP i de forskellige cellelinier er vist (højre panel). B. mRNA niveauer af hnRNPs blev analyseret ved qPCR (n = 3). Ingen statistisk signifikans blev fundet. C. Western blot-analyse, der viser proteinniveauer for de forskellige hnRNPs i HAF1 og HAE6 celler. p-actin blev anvendt som lastning kontrol.

3.5. Acetylering af hnRNPA1 og L som reaktion på EGF

Selvom acetylering af hnRNPs allerede er beskrevet i andre cellesystemer, det i øjeblikket ikke vides, om denne acetylering er en del af reaktion EGF i CRC-celler. Skulle det være tilfældet, vil det være vigtigt at fastslå, om

KRAS

mutationsstatus kunne betinge et forskelligt induceret-acetylering af hnRNPs på EGF stimuli. Begge cellelinier blev dyrket i serumfrit medium og derefter stimuleret med EGF til en kort (20 min.) Og en lang (2h) periode (Fig 5A). Prøver fra hver betingelse blev immunpræcipiteret med enten anti-hnRNPA1 eller anti-hnRNPL antistoffer. Disse hnRNPs blev udvalgt, fordi de repræsenterer de isoformen viser de højeste og de laveste acetyleringsniveauer forskelle, når man sammenligner HAF1 og HAE6 celler. At etablere acetylering ratio (acetyl-hnRNP /total hnRNP), blev pull-down proteiner yderligere analyseret ved western blot med specifikke antistoffer mod acetyl-Lys eller tilsvarende hnRNP.

Både CRC cellelinjer blev dyrket i serum -fri medium og derefter stimuleret med EGF (20 ng /ml) i 20 og 120 min. A. Proteinekstrakter fra kontrol- eller EGF-behandlede celler blev isoleret og immunpræcipiteret med α-hnRNPA1 (øvre panel) eller hnRNPL (nederste felt) antistoffer. De immunopræcipiterede Prøverne blev derefter analyseret ved Western blot med antistoffer, der genkender acetyl-lysin rester og, enten hnRNPA1 eller hnRNPL. Input af hver specifik hnRNP i de forskellige cellelinier er vist. B. mRNA niveauer af hnRNPA1 og hnRNPL blev analyseret ved qPCR i kontrol og 2t EGF-behandlede celler. Ingen statistisk signifikans blev fundet (n = 3). C. Western blot analyse, der viser protein niveauer af begge hnRNPs i HAF1 og HAE6 celler i kontrol- og 2t EGF-behandling betingelser. Intensiteten af ​​hnRNPs båndene blev målt og normaliseret ved β-actin; grafer i nederste panel viser kvantificering for både hnRNPL og A1 i HAF1 (hvide søjler) og HAE6 (grå søjler) cellelinjer.

Under serum afsavn, basale acetyleringsniveauer begge hnRNPs var højere i HAE6 end i HAF1 celler (fig 5A, bane 0). Imidlertid acetyleringen af ​​begge, hnRNPA1 og hnRNPL ved slutpunktet af EGF-behandling var den samme i de to cellelinier. Interessant, når acetylering af EGF-behandlede prøver blev sammenlignet med ubehandlede kontroller, acetylerede-hnRNP niveauer ikke signifikant ændrer sig i løbet af tidsforløbet for EGF-behandling i HAE6 celler (Fig 5A). Omvendt EGF inducerede en dramatisk acetylering af begge hnRNPs i HAF1 celler. Interessant samme respons blev observeret efter EGF behandling i HCT116 parentale cellelinje (S3 Fig). Endelig blev mRNA og protein niveauer fra hnRNPA1 eller-L ikke induceret i nogen EGF-behandlede cellelinie ved de testede tidspunkter (Fig 5B og 5C, S3 Fig). Derfor kan EGF-induceret acetylering observeret i HAF1 ikke tilskrives den transkriptionelle eller translationelle modulation af hnRNPs.

3.6. Rolle

KRAS

A146T mutationen på hnRNP acetylering

For at undersøge, om

KRAS

A146T

mutation kan tegne sig for EGF-induceret acetylering af hnRNPs, vi inhiberede specifikt KRAS-signalvejen i HAF1 cellelinie. Uafhængigt af

KRAS

A146T mutationen, HAF1 celler også omfatte en

PI3KCA

mutation. Derfor analyserede vi acetylering af hnRNPs induceret af EGF i celler forbehandlet med hæmmere af både, MEK1 /2 (U0126) og PI3K (LY294002). Inhibering af en enkelt vej enten MEK1 /2 eller PI3K, ved anvendelse af den specifikke inhibitor alene, havde ingen virkning på protein acetylering (Fig 6A). Evnen af ​​RAS at påvirke PI3K-aktivitet og omvendt er veldokumenteret [28, 29]. Faktisk har blokerende MEK1 /2-aktivitet blevet vist at inducere AKT phosphorylering i CRC cellelinier [30]. På den anden side har blokerende PI3K-aktivitet vist sig at øge pErk1 /2 niveauer som respons på forskellige stimuli [28]. Efter aftale med dette, når begge hæmmere blev brugt samtidig, hæmning af RAS /PI3K signalveje fuldstændig blokeret EGF-induceret acetylering af både hnRNPA1 og hnRNPL (Fig 6B). Interessant nok blev basale niveauer af acetylerede hnRNPs i serum-udsultede kontroller ikke berøres af de kinaser inhibitorer.

A. HAF1 celler blev behandlet med EGF i nærvær eller fravær af MAPK inhibitorer (MEK, UO0126 eller PI3KA, LY294002). Protein ekstrakter fra HAF1 celler blev immunopræcipiteret med α-hnRNPA1 eller hnRNPL antistoffer. De immunopræcipiterede Prøverne blev derefter analyseret ved Western blot med antistoffer, der genkender acetyl-lysin-rester og enten hnRNPA1 eller hnRNPL (venstre panel). Phosphorylering af ERK1 /2 og AKT i HAF1 celler blev også vurderet til at bekræfte effektiviteten af ​​individuelle hæmmere ved doser, der anvendes (Højre panel). B. Begge MAPK inhibitorer blev samtidig anvendt til at undersøge deres virkning på EGF-induceret acetylering af hnRNPs. C. rolle deacetylaser på basal acetyleringsniveauer af hnRNPs blev yderligere undersøgt i HAF1 celler behandlet med trichostatin A. Immunopræcipitation med hnRNPs antistoffer og western blot mod acetyl-lysin, hnRNPA1 eller L i HAF1 celler behandlet med EGF, TSA eller en kombination af begge er vist.

Basal niveauer af acetyl-hnRNPs kunne være afhængig af halveringstiden af ​​acetyleringer. Faktisk, acetylering af proteiner er ikke kun resultatet af acetyltransferase-induceret aktivitet, men også af deacetylaser. For at undersøge rollen af ​​deacetylaser på basal acetylering, undersøgte vi, om deacetylase inhibitor Trichostatin A (TSA) kunne efterligne virkningen af ​​EGF i HAF1 celler. Faktisk TSA øget acetylering af begge hnRNPs til samme niveau som dem, der nås med EGF-behandling, selvom ikke blev observeret nogen synergistisk effekt (Fig 6C).

Diskussion

Heri vi afdække flere aspekter af de molekylære begivenheder underliggende kolon carcinogenese, der vil blive yderligere diskuteret. Vi leverer den første rapport angiver, at acetylering af 36 specifikke proteiner er afhængig af

KRAS

mutationsstatus; blandt dem, flere medlemmer af hnRNP-familien. Desuden vores data viser, at hnRNP acetylering er en del af EGF-inducerbare respons. For det andet viser vi de molekylære konsekvenser af allel ubalance ved sletning af enten en vildtype eller en mutant allel i

KRAS

G13D /WT

CRC celler. Deletion af vildtype allelen (HAE6) fører ikke blot til hnRNP acetylering, men også til mere tumorgene og EGF-reagerer profil af disse celler. Omvendt sletning af mutant allel (HAF1) inducerer en spontan

KRAS

A146T

mutation i vildtype allelen.

Kollektivt vore observationer synes at parallel de kliniske resultater indikerer, at afbrydelse af

KRAS

vildtype allelen er en negativ prognostisk faktor for CRC [31]. Overraskende, i HAF1 celler, en spontan

KRAS

A146T

punkt mutation blev fundet. Efter aftale med dette, de seneste rapporter viser dynamiske

KRAS

genotypeforandringer hele progressionen af ​​metastatisk CRC [11]. Dette punkt mutation også gør en konstitutiv aktivering af KRAS [32], i den nærmeste fremtid, vil det være vigtigt at analysere mulige spontane mutationer i enhver anden CRC cellelinje anvendes som eksperimentel model til at studere de molekylære mekanismer i terapi-modstand eller nyt lægemiddel udvikling.

mutation screeningstest baseret på hotspot

KRAS

codon 12 og 13 har resulteret i mis-klassificering af op til en tredjedel af patienterne, der blev fejlagtigt anset som

KRAS

vildtype og var resistente over for anti-EGFR behandlinger [33, 34].

KRAS

mutationer i codon 61 og 146 er signifikant associeret med kortere progressionsfri overlevelse sammenlignet med vildtype

KRAS

i CRC patienter behandlet med en kombination af cetuximab og kemoterapi [10]. af fire uafhængige forsøg.