PLoS ONE: Enhanced Anticancer aktivitet af gemcitabin i kombination med noscapin via Antiangiogenisk og apoptosecyklus mod ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Baggrund

Formålet med denne undersøgelse var at vurdere anticancer aktivitet noscapin (nr) og kombinationen Gemcitabin (Gem) (NGC) over for ikke-småcellet lungekræft ( NSCLC) og for at belyse den underliggende virkningsmekanisme.

Metoder

isobolografiske metode blev anvendt til beregning kombination indeksværdier fra cytotoksicitetsdata. In vitro antiangiogenisk og apoptotiske aktivitet af Nos blev perle og NGC evalueret. For in vivo studier, kvindelige athymiske Nu /nu mus var xenotransplanteret med H460 tumorer og effekten af ​​Nos, Gem, eller NGC blev bestemt. Protein udtryk ved immunhistokemisk farvning blev evalueret i høstede tumorvæv

Resultater

De CI værdier ( 0,59). Antydede synergistisk adfærd mellem nr og perle. NGC behandling viste signifikant inhiberede rør dannelse og øget procentdel af apoptotiske celler. NGC, perle og Nos behandling reducerede tumor volumen med 82,9 ± 4,5 procent, 39,4 ± 5,8 procent og 34,2 ± 5,7 procent henholdsvis. Specifikt NGC behandling nedsat ekspression celleoverlevelsesforløb proteiner; VEGF, CD31 farvning og mikrokar tæthed og forbedret DNA fragmentering og kløvet caspase 3 niveauer sammenlignet med enkeltstof behandlede og kontrolgrupper.

Konklusion

Nos forstærkede anticancer aktivitet perle i et tilsætningsstof til synergistisk måde mod lungekræft via antiangiogeniske og apoptotiske veje. Disse resultater tyder på potentiale fordel for brug af NGC kemoterapi til behandling af lungekræft

Henvisning:. Chougule MB, Patel A, Sachdeva P, Jackson T, Singh M (2011) Forbedret Anticancer aktivitet af gemcitabin i kombination med noscapin via Antiangiogenisk og apoptosecyklus mod ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 6 (11): e27394. doi: 10,1371 /journal.pone.0027394

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: August 6, 2011; Accepteret: Oktober 16, 2011; Udgivet 15. november, 2011

Copyright: © 2011 Chougule et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte blev leveret af en forskningscentre i Minority institutioner (RCMI) tildeling (G12RR03020-11) og en National Institute of General Medical Sciences /Minority Biomedical Research Support (NIGMS /MBRs) award (5S06GM008111-36) fra National Institutes of Health (NIH ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald. Størstedelen af ​​patienter diagnosticeret med lungecancer stede med lokalt fremskreden eller metastatisk sygdom [1], [2]. Mere end 85 procent af patienter med lungecancer har ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Flertal af nydiagnosticerede NSCLC patienter til stede med sygdom uden for kirurgisk helbredelse og afhænger af systemisk kemoterapi til at forbedre deres resultater [3], [4]. Platinbaseret kombinationsregimer er første linie behandling mulighed i behandling af NSCLC, men deres kliniske anvendelighed har været begrænset på grund af betydelige toksiciteter [4], [5]. Trods de seneste fremskridt inden for kemoterapi, responsrater i NSCLC forblive 50 procent og en tredjedel af patienter med stadie IV sygdom har en 2-års overlevelse på 20 procent [3]. Etableringen af ​​et optimalt regime for kombinationsbehandlinger med i øjeblikket anvendes, og nyudviklede lægemidler er et vigtigt skridt for at opnå højere respons og længere overlevelse [6]. For at løse dette problem, har opmærksomheden været fokuseret på at finde nye midler mod cancer, der vil levere tilsvarende eller forbedret overlevelse til der opnås med platin regimer, men med mindre toksicitet. Gemcitabin (GEM) er et pyrimidinnukleosid antimetabolit middel, som er aktivt mod forskellige humane maligniteter, herunder NSCLC har en gunstig toksicitetsprofil [6], [7]. Flere forskere har undersøgt kombinationen af ​​Gem og cisplatin, topotecan, proteaseinhibitorer, og ginsenoside Rg3 til behandling af lungecancer [8], [9], [10], [11], [12] og rapporteres forbedret anticancer effekter [ ,,,0],8], [9], [10], [11], [12], [13].

anticanceraktivitet af mikrotubulus-interfererende midler, taxaner og vinca-alkaloider er blevet godt undersøgt [14]. Den kliniske anvendelighed af taxaner blevet begrænset på grund af medikament-resistens, behov for intravenøs (i.v.) infusion over en længere periode og associeret toxicitet [15], [16]. Dette har foranlediget søgning efter mikrotubulus-targeting middel, som kan administreres oralt, viser en gunstig toksicitetsprofiler og har bedre terapeutiske indekser. Nos dæmper mikrotubulusdynamik lige nok til at aktivere de mitotiske checkpoints for at stoppe cellecyklus [17], [18] og demonstreret anti-proliferative aktivitet mod mange forskellige kræftceller herunder mange resistente varianter, mens omgå normale celler [18], [19 ], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Desuden Nos viste også ringe eller ingen toksicitet til de normale organer og ikke hæmmer de primære humorale immunrespons i mus [19], [20]. Vores tidligere undersøgelser viste, at oral indgivelse af Nos viste signifikant anticanceraktivitet på en dosis-afhængig måde mod H460 lunge tumorxenotransplantater [24]. Landen et al. viste, at der var ingen signifikant forbedring i anticancer aktivitet af Nos når det kombineres med paclitaxel [19] muligvis som følge af konkurrence om det samme mål. Anvendelsen af ​​Nos i kombination med vincristin udviser synergistiske antitumorvirkninger i leukæmiceller in vitro [27]. Imidlertid anticancer potentiale Nos i kombination med forskellige anticancermidler i behandlingen af ​​lungecancer er ikke systematisk undersøgt. Både Nos og perle har forskellige virkningsmekanismer og Nos og perle kombination (NGC) kan føre til potentielt synergistisk antitumoraktivitet mod lungekræft.

På baggrund af den enkelte aktivitet af disse midler og deres forskellige virkningsmekanismer, vi hypotese, at NGC kan producere additiv til synergistiske cytotoksiske virkninger i humane lunge kræftceller

in vitro

in vivo

eventuelt ved nedbrydning af specificitet proteiner, der øger antiangiogenisk og apoptotisk aktivitet. I denne undersøgelse, vi evaluerede anticancer aktivitet af NGC terapi mod NSCLC celler in vitro og in vivo i H460 murine xenograft lunge tumor model, som ikke er blevet rapporteret før. Formålet med denne undersøgelse var at (a) undersøge anticancer aktivitet af kombination af mellem nr og perle mod NSCLC celler, og (b) evaluere antitumor effekt af NGC i mus med H460 xenograft lungetumorer og belyse underliggende virkningsmekanisme.

Materialer og metoder

Materialer

noscapin og Gemcitabin blev købt fra Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA og Spectrum Chemicals USA hhv. De humane H460 og A549 NSCLC-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Alle andre kemikalier var enten reagens eller vævskulturkvalitet. H460 og A549-celler blev dyrket i RPMI 1640 medium og F12K-medium (Sigma, St. Louis, MO, USA) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum henholdsvis. Alle vævskultur medier indeholdt antibiotikum antimykotisk opløsning af penicillin (5000 U /ml), streptomycin (0,1 mg /ml), og neomycin (0,2 mg /ml). Cellerne blev holdt ved 37 ° C i nærvær af 5 procent CO

2 i luft.

Dyr

Female nu /nu-mus (seks uger gamle, Harlan, Indianapolis, IN ) blev grupperet og husede (8 /bur) i sterilt microisolator bure enhed leveres med autoklaveret Tek-frisk strøelse. Dyrene blev opstaldet på Florida A og M University i overensstemmelse med standarderne i

Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr

Foreningen for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care. Den foreliggende undersøgelse blev gennemgået og godkendt af Florida A og M University (FAMU) Animal Care og brug Udvalg (AUCU) august 2009. (Protokol # 002-09).

In vitro

Cytotoksicitetsstudier

A549 eller H460 celler blev udpladet i 96-brønds mikro titer plader, ved en densitet på 1 x 10

4 celler /brønd og fik lov at inkubere natten over. Cellerne blev behandlet med forskellige fortyndinger af perle i nærvær eller fravær af Nos på 10-30 og 30-50 uM mod H460 og A549-celler henholdsvis. Pladerne blev inkuberet i 72 timer ved 37 ± 0,2 ° C i en inkubator. Cellelevedygtighed i hver behandlingsgruppe blev bestemt ved krystalviolet farvestof-assay.

induktion af apoptose i H460 og A549-celler Salg

H460 eller A549-celler blev udpladet ved en densitet på 1 x 10

6 celler /brønd i 6-brønds plader og inkuberet natten over. H460-celler blev behandlet med perle (0,4 ug /ml), eller Nos (30 uM), eller NGC og A549-celler blev behandlet med perle (0,3 ug /ml), eller Nos (50 uM), eller NGC. Efter 72 timer blev cellerne fikseret i 4% paraformaldehyd og monteret på objektglas under anvendelse Cytospin R (Shandon) og forarbejdet som pr ApoTag Red In Situ Apoptosis detektion kit R (Chemicon R International, CA, USA) protokol. Billederne på objektglassene blev visualiseret med et Olympus BX40 fluorescerende mikroskop. For at kvantificere de apoptotiske celler blev 100 celler fra 6 tilfældige mikroskopiske felter talt.

Hæmning af rør dannelsen af ​​HUVEC celler

in vitro

De antiangiogene virkninger af Nos og perle blev analyseret ved anvendelse af en

In vitro

Angiogenese Assay Kit (Millipore, Billerica, MA, USA). Kort fortalt HUVEC-celler blev dyrket i nærvær eller fravær af 30 uM Nos, 0,4 ug /ml perle og NGC på polymeriseret Matrigel ved 37 ° C. Standard Matrigel lodes polymerisere i en 96-brønds plade og HUVEC-celler blev podet ved en densitet på 3 x 10

4 per brønd i ECM-medium. Efter 6 timer blev kanaldannelse af endotelceller evalueret og fotograferet. Kvantificering af progression af angiogenese blev opnået ved at tælle kapillarrør gren punkter dannet efter en vis tid (endepunkt assay). Branch punkter i flere tilfældige view-felter (3-10) per brønd skal tælles og gennemsnittet heraf beregnes.

In-vivo

antitumor effekt af Nos mod H460 lungetumorer

adhærente H460 celler blev høstet og centrifugeret ved 500 g i 4 minutter ved 4 ° C, og cellepelleten blev resuspenderet. Cellerne blev fortyndet til 3 x 10

6 celler /100 pi ved anvendelse vækstmedium. De 100 pi cellesuspension blev injiceret subkutant i højre flanke område på hver mus. Protokollen for

in vivo

eksperimenter med nøgne mus blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg, Florida A og M University, Tallahassee, FL. Musene blev randomiseret (n = 8) efter 50 mm

3 i tumorxenotransplantater (7 dage efter tumorimplantation) og behandlet med i) 160 pi køretøj (phosphatpuffer, pH 3,5); ii) Gem (30 mg /kg i.v. bolus, Q3D × 7 skema); iii) nr 300 mg /kg dagligt ved oral sondeernæring; og iv) NGC terapi for 38 dage efter tumorimplantation

. Noscapin blev opløst i phosphatbuffer, pH 3,5 og Gemcitabin opløst i saltvand phosphatbuffer før administration til mus. For at kontrollere for tegn på toksicitet, blev dyrene vejet to gange ugentligt. Tumordimensionerne blev målt ved anvendelse af en lineær caliper og tumorvolumen blev beregnet ved anvendelse af følgende ligning: (1) hvor,

v = tumorvolumen

a = største diameter af tumor

b = mindste diameter tumor

på dag 38 blev alle dyr aflivet efter fjernelse af tumorvæv; nogle af tumorerne blev fikseret i formalin, mens andre hurtigt blev nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret i -80 ° C.

Western blotting af tumorvæv

Proteinerne blev ekstraheret fra tumorvæv under anvendelse RIPA puffer med proteasehæmmer inkuberet i 30 minutter på is, og supernatanterne blev opbevaret ved -80 ° C efter centrifugering. For western blotting (WB), blev en tidligere etableret procedure i laboratoriet anvendes. [24], [28] Membranerne blev undersøgt med primære antistoffer (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) Sp1 (1:750), SP3 (1:750), VEGF (1:500), Pakt (1:500) , cyklin D1 (1:500), p53 (1:500), p21 (1:500),), PARP (1:1000), spaltet PARP (1:1000), spaltet caspase 3 (1:1000), caspase 8 (1:1000) og caspase 9 (1:1000), Bax (1:1000), Bcl

2 (1:1000), BID (1:500) og p-actin antistoffer (1:500). Bundne antistoffer blev afsløret med HRP-konjugerede sekundære antistoffer (1:2000) under anvendelse SuperSignal West Pico kemiluminescerende opløsning (Pierce, Rockford, IL). Beta actin protein blev anvendt som en loading kontrol. Den densitometrisk analyse af båndene blev udført ved hjælp af programmet ImageJ v1.33u.

TUNEL Assay, kløvet Caspase 3 udtryk og VEGFexpression

TUNEL, kløvet caspase-3 og VEGF farvning i paraffin- indlejrede tumorvæv snit blev vurderet ved anvendelse DeadEndTM Kolorimetrisk Apoptosis Detection System (Promega, Madison, WI), spaltet caspase-3-farvning kit (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) og ImmunoCruz ™ ABC Staining System (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) henholdsvis som tidligere beskrevet [26]. Tumor vævssnit (4-5 um tyk) monteret på poly-L-lysin-coatede objektglas blev afparaffiniseret med xylen og dehydreret gennem graduerede koncentrationer af alkohol, derefter inkuberet med 3 procent hydrogenperoxidase i 20 minutter for at blokere endogen peroxidaseaktivitet. Antigen-genvinding til farvning og blokering af endogen peroxidase blev udført som tidligere [26] beskrevne. Prøverne blev inkuberet natten over ved 4 ° C med 1:50 fortynding af primært antistof inkuberet med biotinyleret sekundært antistof efterfulgt af streptavidin. Farven blev udviklet ved at udsætte peroxidase til et substrat-chromagen, som danner et brunt reaktionsprodukt. Snittene blev derefter modfarvet med hematoxylin. Tre slides per gruppe blev farves og TUNLE, kløvet caspase 3 farvede celler blev identificeret ved mørkebrun cytoplasmatisk farvning. VEGF farvede celler blev identificeret ved brun farvning. Billederne på objektglassene blev visualiseret med et Olympus BX40 lysmikroskop.

CD31 ekspression og vurdering af mikrokardannelse Density

For CD31-ekspression efter vask med PBS, sektionerne blev forbehandlet i citratbuffer i en mikrobølgeovn i 20 minutter ved 92-98 ° C. Efter to gange vask med PBS blev prøver inkuberet i 10 procent normalt gedeserum (Atlanta Biologicals, GA, USA) i 20 min for at reducere ikke-specifik antistofbinding. Efterfølgende blev snittene derefter inkuberet med en 1:500 fortyndet muse CD31 monoklonalt antistof (Cell Signaling Tech, MA), der er anerkendt som en endotelcelleoverfladen markering, ved stuetemperatur i 1 time, efterfulgt af en 30 minutters behandling med HRP Kanin /mus (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Afsnittet blev udviklet med diaminobenziden-hydrogen peroxidasesubstrat, og let modfarvet med hematoxylin. For at beregne mikrokar densitet (MVD), blev tre mest vaskulariseret områder af tumor ( ‘hot spots’) udvalgt og middelværdier opnået ved at tælle fartøjer. En enkelt mikrokar blev defineret som en diskret klynge af celler positive for CD31-farvning, uden krav om tilstedeværelse af et lumen. Mikrokar tællinger blev udført på X400 (X40 objektiv og X10 okular linse; 0,74 mm

2 per felt).

Statistik

En-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey Multiple Sammenligning Test blev udført at bestemme betydningen af ​​forskellene mellem grupper under anvendelse af GraphPad PRISM version 3.0 software (SanDiego, CA). Forskelle blev betragtet som signifikante i alle forsøg på

P

0,01 (*, markant forskellige fra ubehandlede kontroller;.

**, adskiller sig væsentligt fra Nos og Gem enkelt behandlinger

Resultater

Synergistisk

in vitro

cytotoksicitet NGC behandling

In vitro Cytotoksicitetsstudier med Nos mod H460 og A549 celler viste IC

50 værdier på 34,7 ± 2,5 uM og 61,25 ± 5.6 pM henholdsvis. perle viste IC

50 på 0,7 ± 0,1 ug /ml og 0,6 ± 0,2 ug /ml mod H460 og A459 NSCLC-celler. Den samlede virkning af Gem og Nos på celleproliferation blev bedømt ved isobolografiske analyse. CI værdierne varierede fra 0,34 ± 0,02 til 0,59 ± 0,04 for 50 procent celle dræbe tyder synergistisk stærk synergistisk adfærd mellem nr og perle mod både NSCLC cellelinier (figur 1A). isobologrammer for 50% effekt niveau viser, at IC

50 -ækvivalent koncentrationer for forskellige Nos /Gem kombinationer blev placeret under linjen af ​​additivitet, hvilket indikerer synergistisk activityof Nos og perle kombination (fig. 1B). Adskillelsen af ​​punkterne i isobologrammet var konsistent med de Cl-værdier.

Forskellige koncentrationer af Nos blev anvendt til at undersøge virkningen på IC50 på Gem. Variable forhold af lægemiddelkoncentrationer og gensidigt ikke-eksklusive ligninger blev anvendt til bestemmelse CI. De Cl-værdier repræsenterer middelværdien af ​​fire eksperimenter. CI 1.3: antagonisme; CI 1,1-1,3: moderat antagonisme; CI 0,9-1,1: additive virkning; CI 0,8-0,9: svag synergi; CI 0,6-0,8: moderat synergi; CI 0,4-0,6: synergi; CI 0,2-0,4:. Stærk synergi

Antiangiogenisk virkning- rør dannelse assay

nr (30 uM), Gem (0,3 mg /ml) og 30 uM Nos + 0,3 ug /ml perle behandling i 6 timer viste dårlige organizationof HUVEC rørlignende strukturer og et fald i kapillarrør forgreningspunkt formationer (fig. 2A) sammenlignet med kontrolgruppen, som viste en rig meshwork af forgrening anastomoserende kapilllærlignende tubuli med multicentrisk junctions (fig. 2). NGC behandling faldt formulering af gennemsnitlig forgreningspunkt med 68 ± 5 procent i forhold til 26 ± 3 procent af Nos alene og med 29 ± 4 procent perle alene (Fig. 2B).

For dannelse rør assay, HUVEC celler inkuberet med nr (30 uM), Gem (0,4 ug /ml) og NGC på polymeriseret Matrigel ved 37 ° C. Efter 6 timer blev kanaldannelse af endotelceller fotograferet og kapillarrøret forgreningspunktet dannelse blev kvantificeret (n = 3). For TUNEL assay blev H460 celler behandlet med Gem 0,4 mg /ml, nr 30 uM, og NGC og A549 celler blev behandlet med Gem 0,3 mg /ml, nr 50 uM, og NGC. Kontrolceller var ubehandlet. Micron bar = 10 um. Celler blev kvantificeret ved at tælle 100 celler fra 6 tilfældige mikroskopiske felter. Data er udtrykt som gennemsnit + SD (n = 6).

Induktion af apoptose i H460 og A549 celler

Fig. 2C viser, at apoptose induceres i H460 og A549 celler efter behandling med perle, eller Nos, eller NGC. NGC behandling førte til apoptose i 59 ± 4 procent af behandlede H460 celler i forhold til 27 ± 3 procent og 20 ± 2 procent i perle og Nos henholdsvis efter 72 timer (figur 2D og 2E). Tilsvarende NGC behandling af A549 celler førte til 67 ± 5,0 procent apoptotiske celler i forhold til 32 ± 2,0 procent og 20 ± 3,0 procent i perle og nr (fig 2D og 2E). Alle behandlinger var signifikant forskellige fra kontrol (* P 0,01). Gem eller Nos behandling var signifikant forskellig fra NGC behandling (**, P 0,001).

Anti-tumor aktiviteten af ​​NGC i H460 xenotransplantater

Resultaterne (figur 3.) Viser, at tumor volumen faldt betydeligt efter behandling med perle, Nos, eller NGC forhold til kontrol. Tumor volumen til NGC behandling gennemsnit 418.74 ± 55,53 mm

3 i forhold til 1605.08 ± 253,29 mm

3 til Nos behandling eller 1498.33 ± 149,38 mm

3 for Gem behandling (tumor volumen ± SE) på dag 38 indlæg tumorimplantation. Desuden har vi ikke observere nogen vægttab eller andre tegn på toksicitet i mus behandlet med NGC eller Nos eller perle.

Musene blev behandlet med perle 30 mg /kg intravenøst bolus, Q3D × 7 tidsplan, nr 300 mg /kg /dag, og NGC. Kontrolgruppen modtog kun vehikel. Viste data er midler og SE (n = 8). Dette eksperiment blev gentaget to gange.

Virkninger på specificitet proteiner, angiogene og apoptotiske proteiner i H460 xenograft lungetumorer

NGC og perle faldt udtryk for Sp1 og Sp3 i høstede tumorer i forhold til kontrolmus (Fig 4). NGC behandling nedsat ekspression af VEGF-protein-ekspression til 0,26 gange sammenlignet med 0,12 gange med Nr og 0,13 gange med perle behandling, henholdsvis af kontrollen i regression tumorer (Fig 4). Ekspressionen af ​​survivin protein, blev signifikant reduceret med 0,67 gange, 0,29 gange og 0,37 gange med NGC, Gem og Nos behandling sammenlignet med kontrolgruppen (fig 4). NGC viste signifikant fald i ekspression af Pakt sammenlignet med kontrolgruppen. I regression tumorer, NGC og perle faldt betydeligt cyclin D1 udtryk for en 0,39, 0,20, og 0,15 gange, henholdsvis kontroller (Fig 4). Nos, perle og NGC behandling signifikant forøget p53 udtryk til 1,2, 1,3 og 1,6 gange i regression tumorprøver forhold til at styre henholdsvis. (Figur 4) Ekspression af p21 blev signifikant forøget til 1,31 gange med NGC behandling sammenlignet med 1,15 og 1,13 gange med Nr og perle behandling (fig 4). Resultater vist i fig 5 viser, at Nos, Gem og NGC behandling viste signifikant forøget ekspression af spaltet PARP, Bax, BID, caspase 3, spaltet caspase 3, caspase 8 og caspase 9, og nedsat ekspression af PARP og Bcl

2 sammenlignet med kontrolgruppen. Ekspressionen af ​​apoptotiske og antiapoptotiske proteiner i NGC behandling var signifikant forskellig fra et enkelt middel behandlingsgrupper

Bane 1, ubehandlede kontroldyr tumorer.; bane 2, oral nr 300 mg /kg; bane 3, Gem 30 mg /kg i.v. bolus, Q3D × 7 tidsplan; bane 4; NGC. p-actin protein virker som en loading kontrol. Lignende resultater blev observeret i tredobbelte eksperimenter. Protein-ekspressionsniveauer (i forhold til p-actin) blev bestemt. Middelværdi ± SE for tredobbelte bestemmelser

Lane 1, ubehandlede kontrol tumorer.; bane 2, oral nr 300 mg /kg; bane 3, Gem 30 mg /kg i.v. bolus, Q3D × 7 tidsplan; bane 4; NGC. p-actin protein virker som en loading kontrol. Lignende resultater blev observeret i replikate eksperimenter. Protein-ekspressionsniveauer (i forhold til p-actin) blev bestemt. Middelværdi ± SE for tre kopierer bestemmelser.

DNA-fragmentering og kløvet caspase-3-ekspression i tumorvæv

Single-agent behandling med enten Nos eller perle-induceret DNA-fragmentering, der blev yderligere markant (** P 0,001) med NGC behandling. NGC behandling førte til apoptose i 80 ± 5,0 (** P 0,01) procent af tumorcellerne, hvorimod Nos og perle induceret apoptose i 34 ± 3,0 procent og 42 ± 4,0 procent af tumorcellerne (fig. 6). Gem, nr, og NGC induceret kløvet caspase-3 ekspression i tumorer, som var signifikant forskellig i forhold til at styre tumorer. NGC, Gem og Nos behandling viste 62 ± 4,0, 34 ± 2,0 og 26 ± 2,0 procent forøget ekspression af spaltet caspase 3 i tumorer væv sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 6).

Data er udtrykt som betyde + SD (N = 6).

Hæmning af angiogenese og MVD i tumorvæv

Den højeste udtryk for VEGF blev set i tumorvæv høstet fra ubehandlede mus (fig. 6 ). Nedsat VEGF farvning blev observeret i tumorer behandlet med NGC (0,28-fold) sammenlignet med tumorer behandlet med GEM (0,15 gange) eller NOS (0,1 gange) alene. Denne respons var godt korreleret til nedregulering af VEGF-proteinet observeret i tumorlysater fra mus behandlet med de samme forbindelser (fig. 4). CD31 (+) endotelceller blev identificeret under anvendelse IHC teknik i høstede tumorvæv og resultaterne er vist i fig. 6. farvning af mikrokar i NGC, Gem og Nos behandlede grupper var signifikant reduceret til 0,21, 0,08, og 0,06 gange sammenlignet med kontrolgruppen. Den gennemsnitlige mikrokar pr felt i grupper behandlet med Nos, perle og NGC viste sig at være 148,7 ± 18,6, 135,3 ± 17,5 og 91,8 6,1 sammenlignet med 197,7 ± 22,4 i kontrolgruppen.

Diskussion

dårligt klinisk resultat af den igangværende kemoterapi nødvendiggør søgning efter nyere terapeutiske strategier til behandling af NSCLC [1], [3], [4]. Udviklingen af ​​potente nonplatinum baseret kombinationskemoterapi med færre bivirkninger, vil bidrage til at forbedre det kliniske resultat blandt lungekræftpatienter [3], [4], [5]. Brugen af ​​lovende anti-mikrotubulære midler er blevet begrænset på grund af narkotika-modstand, langvarig i.v infusion og tilhørende bivirkninger [15], [16]. Nos er en mere sikker oralt aktivt mikrotubuli middel [19], [20], [23] og har udstillet i-vitro og in-vivo antitumoraktivitet mod forskellige kræftformer [19], [20], [21], [22] , [23]. Vores tidligere undersøgelser viste, at Nos udviste anticanceraktivitet i murine H460 xenograft model uden negative bivirkninger [24]. Perle er en af ​​de mest effektive midler mod lungekræft som hæmmer DNA-syntese og ribonukleotidreduktase [6], [7]. Således forventes det, at NGC kemoterapi kan udøve additiv eller synergistisk anticanceraktivitet og vil have lavere negative bivirkninger som følge af kravet reduceret dosis for perle.

hurtigt voksende H460 og langsomtvoksende A549-celler [28] blev udvalgt at fastslå aktiviteten af ​​Nos og perle kombination på sub IC

50 koncentrationer ved hjælp almindeligt anvendt isobolografiske metode [28], [29], [30]. I denne undersøgelse, isobolografiske analyse af data viste, at Nos forbedret cytotoksicitet af perle (Cl-værdier 0,59) i A549 og H460 humane NSCLC celler på en synergistisk måde (Fig 1A). Den synergistiske aktivitet blev også observeret i isobologrammet, hvor IC

50-ækvivalente koncentrationer for forskellige NGC var placeret under linjen af ​​additivitet (Fig 1B). Vi har for nylig rapporteret, at CI værdier 1,0 indikerer synergistisk aktivitet mellem DIM-C-pPhC

6H

5 ° Docetaxel i NSCLC celler [28]

For at undersøge mulig mekanisme er involveret i. den forøgede cytotoksiciteten af ​​Gem af Nos, evaluerede vi HUVEC rør dannelse og apoptose af tumorceller [31]. Newcomb et al. rapporterede, at Nos (0-150 uM) inhiberede

in vitro

rør-dannelse i 2H11 endotelceller [32]. Tilsvarende Laquente et al viste også inhibering af proliferation af HUVEC-celler af Gem [33] og derfor har vi vurderet den antiangiogene potentiale NGC. Der har ikke været nogen undersøgelse hidtil for at vurdere virkningen af ​​GNC på HUVEC kanaldannelse. NGC viste lineære strukturer af netværket blev forstyrret betydeligt i forhold til enkeltstofbehandling behandling eller kontrol. NGC udviste synergistisk antiangiogen aktivitet ved inhibering af dannelse rør sammenlignet med Nos eller perle alene (figur 2).

Induktion af apoptose er vigtige mekanismer anticancermidler og signifikant induktion af apoptose, som var tydeligt fra positiv TUNEL farvning og kromatin kondensering i NGC behandling i forhold til monoterapi. Svarende til vores resultater, kombinationsbehandling af Nos (150 mg /kg /dag ved sonde) og

60Co stråling (enkelt fraktion – 25 Gy) viste signifikant (

P

0,01) øgede TUNEL positiv GL261 celler sammenlignet med enkeltstof behandling [33].

Efter at have etableret effektiviteten af ​​NGC behandling

in vitro

, vi næste evalueret

in vivo

antitumor effekt af NGC i H460 xenograft lungetumorer i nu /nu-mus. Vi valgte sub-terapeutiske doser af Nos (300 mg /kg /dayand Gem (30 mg /kg iv bolus, iv bolus, Q3D × 7 tidsplan) baseret på vores tidligere undersøgelser, der har vist dosisafhængig anticancer aktivitet (300 450 550 mg /kg /dag) af Nos mod H460 xenotransplantat murin model [24]. Vores

in vivo

resultater viser additiv adfærd NGC i murine H460 xenograft tumor model (figur 3A). Forrige rapporterede studier viste, at anticancer aktivitet af Nos varierer med typen og følsomheden af ​​cancerceller [19], [20], [21]. det er interessant, NGC behandling viste ikke-signifikant ændring i vægttab tyder favorabel toksicitetsprofil nr og perle. NGC behandling vil være en fordel i forhold til konventionelle perle + taxan behandling af lungekræft som følge af forbedret patientefterlevelse ved oral administration af Nos med minimale bivirkninger. Flere undersøgelser har dokumenteret, at forbedret tumorvækst hæmning kan opnås ved at kombinere perle med andre midler såsom bortezomib [34] , Telomelysin [35], dihydroartemisinin [36], Paclitaxel [37], og topotecan [38] i forhold til enkeltstofbehandling behandling.

in vivo

additiv aktivitet NGC behandling kan tilskrives dårlig biotilgængelighed ( 30%), kortere plasmahalveringstid ( 4,5 h) og omfattende first-pass metabolisme af Nos reducerer tilgængeligheden Nos på tumorstedet [39], [40], [41]. Vores fremtidige studier vil fokusere på at forbedre biotilgængeligheden af ​​Nos at udforske sin anticancer potentiale i kombination med perle.

Baseret på

in vitro

antiangiogenisk og apoptotisk aktivitet vi har evalueret ekspression af Sp proteiner, celleoverlevelse, VEGF og apoptotiske proteiner. Sp proteiner er transkriptionsfaktorer, som er overudtrykt i mange humane tumorer [42], [43]. Lou et al. viste, at omdannelsen af ​​fibroblaster resulterede i forøgelse af Sp1 ekspression ved 8 til 18 gange og viste dannelsen af ​​stærkt maligne tumorer i athymiske xenograftmodeller [44]. For tiden tid, viste vi, at NGC behandling viste signifikant (p 0,01) fald i ekspressionen af ​​SP1 og SP3 proteiner sammenlignet med enkelt middel behandling og kontrolgruppen. Tidligere undersøgelser viste, at VEGF udtryk er delvist afhængig af Sp proteiner [45], og der er også tegn på, at survivin udtryk er Sp afhængig [46]. Gem, Nos og NGC behandling faldt udtryk for survivin i lunge tumorer (Fig 4A og 4B). Survivin er medlem af inhibitoren af ​​apoptose familie, som inhiberer caspaseaktivering og fungerer som en negativ regulator [46]. Derfor nedreguleringen af ​​survivin ekspression resulterer i aktivering af caspaser og derved inducerer apoptose i tumorceller. Vi bemærkede også, at NGC behandling faldt betydeligt udtryk for VEGF (Fig 4D) i regression tumorer i forhold til enkeltstofbehandling behandling. Tilsvarende Papineni et al viste, at tolfenamsyre inhiberer esophageal cancer gennem undertrykkelse af Sp proteiner og flere Sp-afhængige gener og proteiner, såsom VEGF, survivin, cyclin D1 og Bcl-2 [47]. Nos alene og NGC behandling viste reduceret ekspression af VEGF og survivin, som kan korreleres til nedbrydning af SP1 og SP3. Desuden er vores IHC resultater viser, at NGC behandling faldt VEGF og CD 31 farvning i tumorvæv høstet fra mus sammenlignet med enkeltstof behandling og kontrol (Fig 6A). [48].