PLoS ONE: individualiserede Mutation Detection i Cirkulerende Tumor DNA til overvågning Colorectal Tumor Burden Ved hjælp af en kræft-associerede Gene Sequencing Panel

Abstrakt

Baggrund

Cirkulerende tumor DNA (ctDNA) bærer information om tumor byrde. Imidlertid mutationen spektrum er forskellige blandt tumorer. Denne undersøgelse er designet til at undersøge nytten af ​​ctDNA til overvågning tumor byrde baseret på en individuel mutation profil.

Metode

DNA blev ekstraheret fra i alt 176 prøver, herunder før og efter operationel plasma, primære tumorer, og mononukleære celler fra perifert blod (PBMC), fra 44 individer med kolorektal tumor, som gennemgik helbredende resektion af colorektale tumorer, samt ni raske individer. Anvendelse af et panel af 50 cancerassocierede gener, blev tumor-unikke mutationer identificeret ved sammenligning den enkelt-nukleotid-varianter (SNVs) fra tumorer og PBMC’er med en ion PGM sequencer. En gruppe af de tumor-unikke mutationer fra individuelle tumorer blev betegnet som individuelle markør mutationer (MMS) at spore tumor byrde ved ctDNA hjælp dråbe digital PCR (ddPCR). Fra disse eksperimenter blev tre store mål vurderes: (a) Tumor-unikke mutationer; (B) mutation spektrum af en tumor; og (c) ændringer i allel frekvens af MMS i ctDNA efter kurativ resektion af tumoren.

Resultater

I alt 128 gen punktmutationer blev identificeret i 27 kolorektale tumorer. Seksogtyve gener blev muteret i mindst 1 prøve, mens blev fundet 14 gener, der skal muteres i kun 1 prøve, henholdsvis. I gennemsnit 2,7 gener blev muteret pr tumor. Efterfølgende blev 24 MM’er valgt blandt SNVs for tumorbyrde overvågning. Blandt de MMS fundet af ddPCR med 0,1% variant allel frekvens i plasma-DNA, 100% (8 af 8) udviste et fald i post-operation ctDNA, hvorimod ingen af ​​de 16 MM’er fundet af ddPCR med 0,1% variant allel frekvens i plasma DNA viste et fald.

Konklusioner

Dette panel af 50 cancer-associerede gener viste sig at være tilstrækkelige til at identificere individuelle, tumor-unikke, muterede ctDNA markører i kræft patienter. De MMS viste den kliniske anvendelighed i overvågningen kurativt behandlet kolorektal tumor byrde, hvis allel frekvens af MMS i plasma-DNA er over 0,1%

Henvisning:. Sato KA, Hachiya T, Iwaya T, Kume K, Matsuo T Kawasaki K, et al. (2016) Individualiseret Mutation Detection i Cirkulerende Tumor DNA til overvågning Colorectal Tumor Burden Ved hjælp af en kræft-associerede Gene Sequencing Panel. PLoS ONE 11 (1): e0146275. doi: 10,1371 /journal.pone.0146275

Redaktør: Alvaro Galli, CNR, ITALIEN

Modtaget: Juni 11, 2015; Accepteret: 15. december 2015; Udgivet: 4 januar 2016

Copyright: © 2016 Sato et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Keiryoukai Grundforskningsfond No.125 af Iwate Medical University [KAS]; og Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, Japan til MIAST (Medicinsk Innovation af Advanced Technology) projekt af tilskuddet-in-Aid Strategiske Forskningsråd Foundation på private universiteter [S1001001 til SSN]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kvantitativ vurdering af cirkulerende tumor-DNA (ctDNA) har vist sig at være nyttig til overvågning tumorbelastning i respons på behandling [1, 2]. Men muterede gener i mange cancertyper kun udgør nogle få procent af den samlede antal gener tilstedeværende, hvilket antyder, at kun et begrænset antal gener er associeret med cancer udvikling og progression [3, 4]. Derfor, for at et sæt af selektive gener vides at være forbundet med cancer er fundamentalt nødvendig for at overvåge tumorbelastning. Faktisk overvågning behandlingseffekt ved ctDNA er blevet udført ved hjælp af et sæt af velundersøgte målgener, herunder

KRAS

,

BRAF

,

HER2

og andre [5 -9]. På den anden side, er oplysninger om overvågning tumor byrde efter kirurgisk indgreb begrænset, fordi det er fortsat ukendt, som tumor-unikke muterede gener bør overvåges for hver patient [10]. Faktisk har data underforstået, at et begrænset antal tumor-unikke mutationer tilstrækkeligt kan repræsentere omfang og karakteristika (fx resistens) af individuelle tumorer [11]. Hvis et lille antal tumor-unikke mutationer identificeres fra primære tumorer, så de kunne anvendes til at påvise mutationerne i ctDNA. Dette repræsenterer en fordelagtig og omkostningseffektiv metode til overvågning af tumor byrde efter kirurgiske indgreb.

Idéen med at bruge ctDNA fra kræftpatienter til at overvåge tumor byrde førte os til at designe den aktuelle undersøgelse med fokus på patienter med tyktarmskræft, der havde fået helbredende fjernelse af tumoren. Vores strategi var at indsamle individuelle kolorektal tumor prøver gennem endoskopisk eller laparoskopisk kolorektal tumor helbredende resektion samt blodprøver. I modsætning til tidligere undersøgelser ved hjælp ekstremt avancerede tumorer, herunder tilfælde med ufuldstændig resektion [1, 2, 7], vores resultater viser, at de individuelle markør mutationer (MMS) i ctDNA kan være nyttige til overvågning af post-operativ, resektabel kolorektal tumor byrde for grundlag af nedsat allel frekvens på ctDNA i postoperativ plasma.

Patienter og metoder

Menneskelige prøver og studiedesign

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board of Iwate Medical University i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen (HG H24-22). En individuel skriftlig tilladelse blev opnået fra alle deltagere, og alle analyser blev udført anonymt. I princippet var patienterne egnede, hvis deres kirurgisk eller endoskopisk resektion blev angivet for godartede eller Stage 0 til III kolorektal tumorer, og havde ingen tidligere nogen behandling på tidspunktet for informeret samtykke. Alle analyserbare tilfælde var forpligtet til at levere følgende fire typer af materialer: præ- og post-operativ plasma (mindst 24 timer efter tumor resektion), primær tumor, og perifere mononukleære blodceller (PBMC’er). Blodprøver blev udtaget til rutinemæssig præ- og post-operative laboratorieundersøgelser. Enten otte eller 16 ml blod blev opsamlet i en BD Vacutainer CPT blodprøvetagning rør (Becton, Dickinson and Company, East Rutherford, NJ). Inden for to timer efter indsamling, blev rørene centrifugeret ved 1800

g

i 20 minutter ved stuetemperatur adskilles i plasma og PBMC lag. Den øvre fase af otte ml blod blev derefter overført til en fem ml rør mærket med patienten-eget identifikationsnummer. Rørene blev umiddelbart opbevaret ved -80 ° C indtil DNA-isolering. Totalt genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af QIAamp Cirkulerende Nucleic Acid Kit til plasma og QIAamp DNA Mini Kit til primære tumorer og PBMC’er (Qiagen, Venlo, Holland). Mængden af ​​ekstraheret DNA blev målt ved anvendelse af Qubit® 2.0 dsDNA høj følsomhed assay (Life Technologies, Carlsbad, CA). I den foreliggende undersøgelse, vores foreløbige forsøg bekræftede, at de forlader 5-7mm af “buffering” lag fra buffy coat efter centrifugen tilstrækkeligt forhindrer plasma lag fra forurening af blod og cellerester, og udbyttet acceptabel DNA kvalitet [12, 13]. Relative kopiantal af genomet i plasma-DNA blev også vurderet ved kvantitativ-PCR (qPCR) for LINE-1-genet under anvendelse af primersæt tidligere beskrevet [14].

DNA ekstraktion fra human coloncancer cellelinie

den menneskelige coloncancercellelinie, HCT116, blev opnået i 2008 fra afdelingen for kræftbehandling og Diagnose Tumor Repository, National cancer Institute (NCI MTA # 1-2093-08). Cellelinien blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% FBS og det genomiske DNA blev ekstraheret ved anvendelse af et QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Venlo, Holland) inden for tre passager efter optøning.

Multiplex PCR og bibliotek konstruktion ved hjælp CHPv2

CHPv2 er en pulje af PCR primere, der er målrettet 207 amplikoner for 2885 mutationer i 50 cancer-associerede gener [15] (Life Technologies, Carlsbad, CA). Hele listen af ​​gener er tilgængelig via leverandørens hjemmeside (https://tools.invitrogen.com/downloads/cms_106003.csv). Ca. 10 ng DNA pr prøve blev anvendt til amplicon-produktion ved multiplex-PCR under anvendelse af Ion AmpliSeq CHPv2 og Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Den resulterende multiplex PCR-reaktion pool blev anvendt til målsekvens bibliotek forberedelse. Primersekvenser for multiplex-PCR blev delvist fordøjet til at ligere stregkode adaptere (Ion P1 Adaptor og Ion XpressTM Bacode X, Life Technologies, Carlsbad, CA) efterfulgt af en perle-baserede nukleinsyreoprensning systemet (AMPure® XP Reagent, Life Technologies, Carlsbad , CA). Efter bekræftelse af, at den endelige bibliotek fragmentstørrelse toppede ved 130 bp, blev biblioteket fragmenterne klonalt amplificeret ved emulsion PCR (Ion PGM Template OT2, Life Technologies, Carlsbad, CA). Emulsionspartiklerne indeholdende klonalt opformerede PCR-fragmenter blev derefter påført på en halvleder sekventering chip (Ion 316 Chip, Life Technologies, Carlsbad, CA) for massiv parallel sekventering på en ion PGM sequencer (Life Technologies, Carlsbad, CA).

Target dyb sekventering

De sekventering data blev gemt i BAM format til nedstrøms analyse. Den sekventering tilpasningen blev vurderet med Torrent Suite V.3.6.2 Software (Life Technologies, Carlsbad, CA) at parse barkode læser og tilpasse læser til referencen genom (menneskelige genom build19, hg19). Til påvisning af variationer i målsekvensen, blev omfanget af dækningen af ​​hvert amplikon indstillet til at opnå mindst den gennemsnitlige dybde af 1400 x for primære tumorer og 700 x for plasma-DNA, hvor Ion Torrent Variant Caller v3.6 blev sat ved en allel frekvens over 0,1% for en variant. En Integrativ Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/) blev også brugt til at visualisere tilpasning, hvilket er tilladt for os at inspicere falsk definerede variationer med streng bias og sekventering fejl.

Identifikation og sporing af gener for potentielle MMS

MMS fra de primære tumorer blev udpeget til at prioritere enkelte nukleotid varianter (SNVs), der var sandsynlighed for at påvise i ctDNA. Den målrettede sekventering fra Cancer panelet foreslog tumor-unik SNVs (dvs. somatiske mutationer) ved sammenligning sekventeringsresultaterne af den primære tumor og tilsvarende PBMC’er (dvs. kimlinie polymorfismer). Kort beskrevet algoritmen til identifikation af tumor-unikke mutationer er som følger: (a) Filtrer kort læser ( 50 nt) under anvendelse fastaq fil til DNA fra tumoren, PBMC’er, og plasma; (B) Kort filtreret fragmenter på hg19 vha Burrows-Wheeler aligner for DNA fra tumoren, PBMC’er, og plasma; (C) Detect SNVs hjælp GATK Unified Genotyper for DNA fra tumoren eller PBMC’er; (D) List tumor-unik SNVs ved at sammenligne SNVs fra tumoren og PBMC’er; og (e) Identificer tumor-unikke mutationer fra tumor-unik SNVs der blev kortlagt på målsekvensen fra CHPv2. Hele processen med algoritme udførelse tager seks timer ved hjælp af en almindelig stationær computer (Intel Core 2 Duo-processorer med 3 GB random Adgang hukommelse) til 1,5 GB sekventering data. De resulterende tumor-unikke mutationer kan anvendes som ctDNA markører. Vores in-house algoritme identificerer primær tumor SNV fragmenter, der er forskelligt detekteres fra PBMC DNA. Det giver mulighed for udvælgelse af fragmenterne med høj allel frekvens, der besidder en høj sandsynlighed for påvisning i ctDNA [11]. Af de resulterende tumor-unikke mutationer ved eventuelle variant frekvenser af SNVs blev MMS for hver tumor prioriteres baseret på følgende kriterier: (a) mere end 10 variant dækning; (B) mere end 5 variant dækning, hvis ingen mutationer havde mere end 10 variant dækning; og (c) tilgængeligheden af ​​validerede QX200

TM Droplet Digital

TM PCR System (ddPCR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) primer og probe sekvenser (S1 tabel). Den allel hyppighed af MMS i plasma blev overvåget af ddPCR hjælp af de specifikke primer og probe sæt.

ddPCR

Hver blanding var forberedt med 20 uL reaktion buffer, 2 x ddPCP SuperMix for Probes (Bio -Rad Laboratories, Hercules, CA), og 10 ng template-DNA. PCR reaktionsblandinger blev opdelt i ensartet størrelse emulsionssmådråber. Dråberne blev fordelt i en 96-brønds mikroplade til brug med en konventionel termisk cykliseringsapparat. En standard PCR-reaktion blev anvendt som følger: 40 cykler af 94 ° C i 30 s og 55 ° C i 60 s; og en endelig forlængelse ved 98 ° C i 10 minutter, hvoraf annealingstemperatur var ændres afhængigt af primerne. Produktet blev opbevaret ved 4 ° C. PCR-produktet blev derefter anbragt i QX200 dråbe læseren (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), og resultaterne blev analyseret ved anvendelse QuantaSoft v1.6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Statistisk analyse

Enten JMP 10,0 (SAS Institute, Cary, NC) eller Prism 6 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA) blev anvendt til statistisk analyse. Klinisk-patologisk og sekventering værdier og frekvenser blev analyseret ved hjælp af χ

2 test, Fishers eksakte test, og studerende

t

-test, afhængigt af de faggrupper.

Resultater

patienter

Mellem maj 2013 og august 2014 37 patienter med fremskreden kolorektal cancer og 22 endoskopisk-resektable kolorektale tumorer blev givet samtykke til undersøgelsen, inden en endelig histopatologisk diagnose. Indskrivning af patienter /raske individer og overblik af undersøgelsen præsenteres (figur 1). I kirurgi gruppen, seks patienter var støtteberettigede: fem patienter viste sig at have Stage IV sygdom under operationen, og en patient havde flere primære kræft læsioner. Blandt egnede patienter, købet modellen mislykkedes i tre tilfælde. Derfor blev 28 fuld-prøvesæt opnået fra 31 egnede patienter. I endoskopi gruppe, en patient nægtede at deltage i undersøgelsen, og en patient havde nyresvigt efter indlæggelse. Blandt egnede patienter, fire patienter havde tumorer, der var for lille til prøveudtagning. Derfor blev 16 fuld-prøvesæt fra 20 egnede patienter. Blod fra 10 raske individer (dvs. patienter i alderen 22 og 68 år, tre kvinder og syv mænd) blev også indsamlet ved hjælp af den samme skriftligt informeret samtykke. En frivillig blev fundet at være gravid efter at have taget en blodprøve, og dermed udelukket. Samlet blev mindst én type prøve opnået fra 60 individer, og i alt 176 prøver af sættet af fire materialer fra 44 patienter blev opnået (figur 1). Klinisk-patologiske karakteristika patienter (tabel 1) og tumor markør niveauer (carcinoembryonisk antigen; CEA) samlet (S1 Fig). I kirurgi gruppen, 30 ud af 31 (96,8%) egnede patienter blev observeret i mindst et år. Fire ud af de 30 (13,3%) patienter tilbagefald og ingen patienter døde under observationsperioden (median: 14,3 måneder). Ingen patienter i endoskopi gruppe havde endnu ikke besøgt vores hospitalet efter tumor resektion i februar 2015.

Alle prøver blev indsamlet prospektivt. Prøver blev indsamlet fra de følgende tre grupper; Kirurgi, Endoskopi, og raske forsøgspersoner. Kirurgi og Endoskopi grupper indeholder Pre (præoperative plasma), PBMC’er, Tumor, og Post (postoperativ plasma) prøver. Prøver fra patienter, der viser trin IV sygdom, utilstrækkelig prøve størrelse, eller utilstrækkelig ekstraherede DNA beløb blev udelukket fra undersøgelsen (detaljerede oplysninger i tekst). Farven på hver kasse angiver, hvilke procedurer blev anvendt til analyse hver type prøve.

vurdering af ekstraheret DNA

Den mediane (område) samlede DNA fra Kvalitet primære tumorer, plasma-DNA, og PBMC’er var 9,4 mg (1,4 til 12,0), 58,1 ng (15,4-915), og 4,7 ug (3,2-10,3), hhv. Plasma DNA udbytte var tilstrækkeligt til at udføre nedstrøms assays, herunder sekvens bibliotekskonstruktion og ddPCR. Mængden af ​​plasma-DNA (område; 83-5,435 ng /ml pr plasma) udstillet meget høj positiv korrelation (r = 0,9651, s 0,0001) med kopien antal

LINE-1 Hotel (interval; 3.050.985 -232,689,225 kopier /ml pr plasma) (S2 Fig). Samlet set viser vores resultater, at der kan opnås 22,9 ng DNA i gennemsnit fra 1 ml plasma.

vurdering af Ion PGM sequencer

Quality

Før sekventering patient materiale, sekventering kvalitet Ion PGM var sikret ved hjælp seriefortyndet genomisk DNA fra HCT116 human coloncancer cellelinie tilsat til opløsningen af ​​genomisk DNA fra PBMCer fra en rask frivillig (figur 2). Vi først bekræftet, at HCT116 celler bærer 10 genmutationer fra de 50 gener af CHPv2 (S2 Table), mens det sunde humane frivillige DNA ikke havde signifikante mutationer. Baseret på offentligt tilgængelige oplysninger, har 1177 mutationer i HCT116 blevet rapporteret (https://cansar.icr.ac.uk/cansar/cell-lines/HCT-116/mutations/#). Blandt de 10 muterede gener fundet i den foreliggende undersøgelse, er 4 er registreret i COSMIC database af HCT116, mens de resterende 6 var roman. Især blev der ikke kendte mutationer savnet i de 50 gener er omfattet af primer sæt i CHPv2. For at løse følsomheden blev genomisk DNA opnået fra en rask frivillig tilsat genomisk DNA fra HCT116 coloncancercellelinie ved fire forskellige koncentrationer (100, 1, 0,1, 0,01 og 0,001% i volumen /volumen) (figur 2). Den gennemsnitlige sekvens dækning af alle amplikoner for de anførte koncentrationer var 1287,7 (100%), 1456,7 (1%), 1412,5 (0,1%), 1708,2 (0,01%), og 1464,3 (0,001%), henholdsvis. Endvidere variationskoefficienter (CV) af variante frekvenser af de muterede fragmenter var 33,4% (100%), 49,9% (1,0%), 125,6% (0,1%), 84,7% (0,01%), og 115,6% (0,001 %), henholdsvis. Samlet set rimeligt lineære område mellem de fastsatte koncentrationer og detekteret allel frekvens med Ion PGM sequencer syntes at være mellem 0,1 og 100%. Derfor følsomheden af ​​sekventering fremgangsmåde til variation frekvenser ved hjælp af Ion PGM er større end 0,1% med tilstrækkelig sekvens læser.

Den vandrette akse angiver koncentrationen af ​​spidse DNA fra HCT116 coloncancercellelinie i opløsning af DNA fra en sund ikke-cancer donor. HCT116 er kendt for at besidde flere genmutationer og dermed koncentrationen af ​​mutationen fragment blev serielt fortyndet. Den lodrette akse er den allel frekvens, der faktisk detekteres med Ion PGM. Hver farve punkt angiver den detekterede allel frekvens af cancer-associerede mutationer ved den tilsvarende DNA-koncentration afledt fra HCT116 i området fra 0,001 til 100%. Navnene på de muterede gener er angivet i forklaringen til højre.

Mutationsanalyse spektrum af kolorektale tumorer identificeret af CHPv2

I alt 15.354.178 læser og 1,636,525,575 basesekvensregioner data blev opnået fra 27 primære tumorer og tilsvarende PBMC’er under anvendelse af en ion PGM sequencer. De tumor-unikke muterede gener blev derefter identificeret ved hjælp af vores egenudviklede algoritme (se patienter og metoder). Først skal vi sætte variant allel frekvens 0,1% og fandt, at 440 af 885 genændringer var tumor-unikke mutationer baseret på sammenligningen mellem PBMC’er og primære tumorer. Sekventeringsresultaterne af primære tumorer opnået fra IonPGM blev bekræftet af ddPCR for prøver, der kunne vurderes (S3 Fig). For en stringent analyse, variant dækning er en af ​​de vigtige faktorer for data pålidelighed (S4 Fig). Derfor analyse blev udført med gener, hvis variant dækning var 10, hvilket resulterer i alt 128 gen punktmutationer (figur 3A). Da nogle tilfælde besad flere ændringer i et enkelt gen, det samlede antal ændrede gener i denne undersøgelse til analyse var 73. Derfor er den gennemsnitlige mutation per tumor var 2,7 ud af de 50 gener (middelværdi ± 2 standardafvigelser: 2,7 ± 2,9) . Seksogtyve gener blev muteret i mindst 1 prøve (26/50, 52%), mens 14 gener (14/50, 28%) var muteret i kun 1 prøve, henholdsvis. Ofte muterede gener inkluderet

TP53

(19/27, 70%),

KRAS

(10/27, 37%), og

APC

(6/27, 22 %). Tre cancer prøver indeholdt alle disse mutationer, hvilket antyder, at der kan være forekommet ændringer af genetisk akkumulering er typiske for en adenom-carcinom-sekvensen i disse prøver [16, 17] (Fig 3B). Disse observationer synes at støtte tidligere rapporter fra exome sekventering af kolorektale tumorer med hensyn til at fange mutationsmønstre karakteristika kolorektale tumorer [18], hvilket tyder på, at den 50 cancer-associerede gen sat rimeligt rekapitulerer den mutations spektrum af tumorer. Mutationen på grundlag multiplex PCR længde opnået fra CHPv2 og antallet af mutationer med dækning 10 (73 muterede gener) var ca. 2.246 per 10

6 nukleotider (dvs. 207 primerpar af gennemsnitlig PCR-produkt længde 157bp) , hvilket tyder på, at CHPv2 blev beriget i forhold til mutationen opdagelse sats fra en exome-sekvens, hvor et flertal af kolorektale tumorer viste 1-100 mutationer per 10

6 nukleotider [18].

a, mutationstyperne. Seks typer mutationer blev påvist med CHPv2. B, Tumor-unik mutation profil ifølge allel frekvens. Hver kolonne angiver et tumor-unik mutation af en individuel tumor. Hver række betegner cancer-associerede gener i CHPv2. Farven angiver variant allel frekvens angivet i farven bar.

Påvisning af MMS i plasma DNA

median (område) plasma-DNA-niveauer hos raske individer, endoskopisk-resektable tumorer , og avancerede kræftformer var 4,2 (2,6-10,4), 6,8 (2,1 til 100,6), og 9,2 (3,8 til 228,8) ng /ml i plasma, henholdsvis (S5 fig). For mutation påvisning i plasma DNA blev 66 MM’er valgt blandt de 320 tumor-unik SNVs ifølge kriterierne beskrevet i Patienter og metoder. Følgende mutationer, der er blevet rapporteret i mange forskellige typer kræft, dukkede mere end én gang i flere tumorer:

KRAS

(G12C) x2;

KRAS

(G12D) x4;

KRAS

(G12V) x3;

TP53

(R273C) x2; og

BRAF

(V600E) x3, hvilket resulterer i alt 57 unikke MMS (S3 tabel). MMS blev først undersøgt ved anvendelse af Ion PGM tilfælde 1, 2, og 3, men ingen af ​​de otte MM’er i plasma DNA viste en høj nok variant dækning (Fig 4A og S4 tabel). Selv om nogle gener påvist nedsat allel frekvens i en tumor byrde-afhængig måde, omfanget af dækningen var ikke pålideligt højt nok i de foreliggende sager (S6A Fig).

a, MMS overvåges med mutationen allel frekvens ved hjælp af en Ion PGM. Tre, et og tre MMS blev anvendt til overvågning af sager 1, 2, og 3, henholdsvis. De tilsvarende serumniveauer af CEA er vist. b, MMS overvåges med mutationen allel frekvens af ddPCR. En eller to MMS blev brugt til at overvåge de repræsenterede tilfælde. Den vandrette stiplede linje viser den øvre grænse for det normale interval for CEA-serumniveauer (3,4 ng /ml). Hvert tal ved siden af ​​hvert datapunkt er allel frekvens for gener; og serumværdier for CEA.

aStop codon,

bSplice site.

Da Ion PGM ikke synes at være følsomme nok til at detektere sjældne alleler, besluttede vi at bruge ddPCR at opdage MMS i præ- og post -operative plasma DNA. Selvom digital PCR kræver en specifik primer /probe sæt for hver mutation efterfulgt af kvalitet validering af qPCR [10], den digitale PCR er mindst 3 gange mere følsom end dybe sequencere [19]. I den foreliggende undersøgelse, var vi i stand til at validere 19 unikke primer /probe sæt ved qPCR til brug i kvantificering mutationer i plasma ved ddPCR (S1 tabel). Da nogle tilfælde havde flere MMS, den 19 valideret ddPCR primer /probe sæt repræsenterede i alt 24 MMS i 19 tilfælde (S5 tabel). Elleve mutationer (i 9 patienter), der matchede primære tumorer var tilsyneladende til stede (minimum allel frekvens 0,032%) i præ-operationelle plasma (Fig 4B, S5 Table, og S6B Fig). I postoperativ plasma-DNA, 8 af 24 (33,3%) MMS viste en faldende tendens, der svarede til 6 ud af 19 patienter (31,6%), herunder to patienter med flere MMS (Fig 4B og S6B Fig). Vigtigere, 100% (8 af 8) af MMS med 0,1% allel frekvens i præ-operationelle plasma DNA udviste et fald i efter operationen prøver (Fig 4B), hvorimod ingen af ​​de 16 MMS med mindre end 0,1% allel frekvens i præ-operationelle plasma DNA udviste et fald i postoperativ plasma DNA (fig 4B og S6B fig). Den faldt trend opnået ved MMS med 0,1% allel frekvens korrelerede godt med serum CEA niveauer. Der var 2 patienter, som havde fået tilbagefald inden den etårige observationsperioden (Case 5 og 6). Begge sager udstillet et klart fald af MMS i postoperativ ctDNA (Fig 4B), men ingen bemærkelsesværdige mutations profil blev identificeret i begge tilfælde.

Diskussion

Sættet af genmutationer i en tumor er stærkt uensartet. Derfor bør en individualiseret sæt tumorafledte muterede gener være passende biomarkører for enkelte fag. Hele genom analyse og exome sekvens kan ikke være omkostningseffektive til dette formål, da mere end 99,99% af genomet eller exome sekvens i primære tumorer ikke udviser mutationer [4, 18]. Her har vi identificeret tumor-unikke mutationer med en CHPv2 på Ion PGM og efterfølgende overvåget tumor byrde ved hjælp af MMS med ddPCR startende fra en meget lille mængde plasma-DNA. Da vores tilgang synes at være tilstrækkelig til at opnå god kvalitet mutations oplysninger i forhold til hele genomet eller exome sekvens teknologier, kan det være umiddelbart anvendelige i klinisk praksis.

Nytten af ​​mutation afsløring i ctDNA er rapporteret i meget avancerede kolorektal cancer patienter, hvoraf de fleste oplevede tilbagefald, progression eller død inden for et år efter første behandling [1, 2, 5, 9, 20, 21]. Disse meget avancerede tumorer (dvs. trin IV), anses for at have en høj risiko for tilbagefald eller fremadskriden [22], så den rolle, yderligere markører kan være begrænset i den nuværende praksis. Faktisk kan de fleste af patienter med tyktarmskræft behandles med kurativ intention (dvs. trin II-III), hvis 5-års sygdomsfri satser er blevet rapporteret at være ca. 70% [23, 24], hvilket antyder, at omkring 30 % af patienterne stadig kræver omhyggelig overvågning for tilbagefald. I øjeblikket CEA er en af ​​de eneste molekylære markører til rutinemæssig anvendelse i overvågningen postoperativ opfølgning [25]. Det er imidlertid blevet rapporteret, at den overlevelsesfordel af CEA overvågning og efterfølgende kirurgisk behandling vil sandsynligvis være lille [26]. Denne iagttagelse skyldes sandsynligvis det faktum, at øget CEA niveauer er: (i) en dårlig indikator for lokalt recidiv; og (ii) et forholdsvis sent begivenhed [27]. I modsætning til CEA, ctDNA umiddelbart reagerer, er specifik for tumorbyrde, og er detekterbar uanset histologisk type, [2]. Imidlertid bør det bemærkes, at en af ​​de vigtige spørgsmål om anvendelse af ctDNA i fase II-III patienter er detekteringsfølsomheden. Forekomsten af ​​primære tumor-drevne mutationer i ctDNA har kun en 0,1-10,0% variant allel frekvens, selv i meget avancerede tumorer [10, 11, 28]. Derfor til ctDNA skal anvendes som en biomarkør for trin II-III eller endda trin I kolorektal cancer patienter, ideelt følsomheden er lavere end 0,1% [19]. Nylige fremskridt inden for digital genomiske sekventering teknologier, herunder perler, emulsion, forstærkning og magnetisme (strålende) [29], mærkede amplikon dyb sekventering (Tam-Seq) [10], safe-sekventering-system (Safe-SeqS) [30] , fejl undertrykt multiplex dyb sekventering [31], og Duplex sekventering [32] har henvendt denne følsomhed efterspørgsel. Disse metoder er i virkeligheden meget nøjagtige, men har ikke været fuldt ud for at søge mutationer med flere amplikoner fra et begrænset antal kopier af skabeloner som ctDNA [30]. I den foreliggende undersøgelse, vi først identificeret tumor-unikke mutationer af Ion PGM, derefter disse mutationer blev analyseret ved anvendelse ddPCR. Den ddPCR kræver primer /probe design og validering til tidligere identifikation af hver mutation i den primære tumor, men det kræver ikke pool eller dyb sekventering. Vi bekræftede, at ddPCR var egnet til kvantitativ måling af sjældne varianter på en mutant allel fraktion på 0,1% eller derover (en mutant molekyle i en baggrund af 1000 vildtype-molekyler) [1, 33, 34]. Til den praktiske brug af ctDNA som en tumor byrde overvågning markør, kunne kun et lille antal helt sikkert identificerede mutationer fra primære tumorer være pålidelige markører. Vores nuværende strategi er derfor rimeligt til klinisk tumor byrde overvågning især for postoperative patienter med helbredende hensigt.

Gene ændringer der er involveret i de tidlige stadier af tumorigenese tilsyneladende fordelagtige som MMS, fordi de bør inddrages i etableringen af tumorigene kloner [4]. I princippet har genetisk heterogenitet af en tumor blevet anset for at være resultatet af heterogen akkumulering af genetiske forandringer på toppen af ​​præcancerøse eller tidlige cancer læsioner [35, 36]. Faktisk mutationer af

TP53

,

KRAS

,

KIT

, og

CDKN2A

blev påvist i endoskop gruppe tumorer samt fremskredne kræftformer, hvilket tyder at disse mutationer er fremført i kræftudviklingsproces og spredt ud i hele tumormasse. Hvis en given mutation er forbundet med tidlig udvikling af kræft af tumoren, så mutationsdetektion skævhed i ctDNA grundet tumor heterogenitet bør minimeres. identifikation af gener, som er specifikt involveret i den tidlige udvikling af individuelle tumorer kan dog være udfordrende. I den foreliggende undersøgelse, kan det være vanskeligt at behandle klonal heterogenitet af en tumor i mutationen profilering med lille cancerassocieret gensekvensering panel fra en enkelt biopsi per primær tumor. Ideelt set alle mutationer, herunder dem med lave allel frekvenser i den primære tumor fra en enkelt biopsi, skal undersøges i ctDNA. Imidlertid kan detektion af ekstremt lav allelfrekvens ikke være mulig endnu på grund af manglen på ddPCR primer /probe-sæt for hver enkelt nukleotidændring af alle kodende regioner. Mutations profilering med flere biopsier fra en tumor kan være en mulighed for at kompensere for klonal heterogenitet, men denne fremgangsmåde er endnu ikke muligt for små tumorer, såsom polypper og resekterbare tumorer. Derfor kan vurderingen af ​​klonal heterogenitet af en tumor ikke være helt gennemførligt i tidlige cancere. I mellemtiden mutationer med høj forekomst i primære tumorer-MMS fra en cancer-associeret gen sekventering panel i den foreliggende undersøgelse, kan være en af ​​de bedste surrogater for denne tilgang [11].

Sammenfattende