PLoS ONE: Blimp1 Aktivering af AP-1 i Human Lung Cancer Cells Fremmer en migrerende Fænotype og hæmmes af lysyloxidase Propeptide

Abstrakt

B-lymfocyt-induceret modning protein 1 (Blimp1) er en mester regulator af B-celle-differentiering og kontrol migration af primordiale kønsceller. For nylig observerede vi afvigende Blimp1 udtryk i brystkræftceller følge af en NF-KB RelB til Ras signalvej. For at behandle spørgsmålet om, hvorvidt den uventede ekspression af Blimp1 ses i andre epiteliale-afledte tumorer valgte vi lungecancere, da de ofte er drevet af Ras-signalering. Blimp1 blev påvist i alle fem lunge kræft cellelinier undersøgt og vist at fremme lungekræft celle migration og invasion. Afhøring af microarray datasæt viste forhøjede

BLIMP1

RNA udtryk i lunge adenocarcinom, pancreas duktale carcinomer, hoved- og halskræft samt i glioblastomer. Inddragelse af

Ras

og dens downstream kinase c-Raf blev bekræftet ved hjælp af mutant og siRNA strategier. Vi næste behandlet spørgsmålet om mekanismen for Blimp1 aktivering i lungekræft. Brug af knockdown og ektopisk ekspression, rolle Activator Protein (AP) -1 familie af transkriptionsfaktorer blev demonstreret. Endvidere kromatin immunopræcipitationsanalyser bekræftede binding til identificerede AP-1 elementer i

BLIMP1

promotor af ektopisk udtrykte c-Jun og af endogene AP-1 underenheder efter serum stimulation. Propeptidet domæne af lysyloxidase (LOX-PP) blev identificeret som en tumorsuppressor, med evne til at reducere Ras-signalering i lungecancerceller. LOX-PP reduceret ekspression af Blimp1 ved binding til c-Raf og inhibering aktivering af AP-1, hvorved dæmpe vandrende fænotype af lungecancerceller. , Blimp1 er således en mediator af Ras /Raf /AP-1-signalering, der fremmer celle migration, og er undertrykt af LOX-PP i lungekræft

Henvisning:. Yu Z, Sato S, Trackman PC, Kirsch KH , Sonenshein GE (2012) Blimp1 Aktivering af AP-1 i human Lung Cancer Cells Fremmer en migrerende Fænotype og hæmmes af den lysyloxidasen Propeptide. PLoS ONE 7 (3): e33287. doi: 10,1371 /journal.pone.0033287

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: 26 oktober, 2011; Accepteret: 10. februar, 2012; Udgivet: 15. marts 2012 |

Copyright: © 2012 Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse undersøgelser blev støttet af National Institutes of Health (NIH) giver R01 CA143108 og PA1 ES011624. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

B-lymfocyt-induceret modning protein 1 (Blimp1) eller Positiv-Regulatory Domain i Bindende faktor 1 (PRDI-BF1) er en zink finger kodet af

PRDI-BF1 og RIZ domæne 1

(

PRDM1

) eller

BLIMP1

gen [1], [2], som oprindeligt blev isoleret som en transskriptionsrepressor af

IFNp

promotor [3]. Adskillige mekanismer Blimp1-medieret repression af gen transskription er blevet belyst: rekruttering af histon methyltransferaser (HMTs) [4], histondeacetylaser (HDAC) [5] eller corepressorer [2] eller ved konkurrence med transkriptionelle aktivatorer [6]. Blimp1 blev identificeret som en master regulator af B-celle terminal differentiering [7], som fremmer differentiering af B-lymfocytter til plasmaceller [8]. Adskillige faktorer er blevet impliceret i aktiveringen af ​​transkription af

Blimp1

gen under differentiering af B-celler, herunder NF-KB, AP-1, IRF4, STAT3 og STAT5, selv om deres nøjagtige virkningsmekanismer er ikke helt forstået [9]. Blimp1 blev efterfølgende vist at regulere T-celleproliferation og homeostase [10]. Under udvikling, Blimp1 styrer oprindelige kønsceller (PGC) specifikation og migration som Blimp1-mangel museembryoer generere PGC-lignende celler, der ikke vise karakteristisk PGC migration [11], [12]. Noget uventet, blev Blimp1 detekteret i ikke-hæmatopoietiske cancerceller. Vores laboratorium observerede Blimp1 udtryk i brystkræftceller, og viste det undertrykte transskription af

ESR1

gen, der koder østrogen receptor alpha (ERa), og derved fremme en mere vandrende fænotype [13]. Transkriptionel induktion af Bcl-2-niveauer af NF-KB RelB underenhed rekrutteret Ras til mitokondrierne [14]. Den resulterende Ras-signalering førte til en afvigende induktion af Blimp1 i brystkræftceller [13]. Den nøjagtige transkriptionsfaktor (r) nedstrøms for Ras der medierede aktiveringen af ​​Blimp1 i disse cancerceller stadig at blive identificeret. Men inddragelse af Ras signalering i Blimp1 aktivering fører os til hypotesen, at ekspressionen af ​​Blimp1 kan være mere udbredt i kræft end tidligere realiseret. Kolorektale tumorceller blev også fundet at udtrykke Blimp1, som undertrykte den

TP53

gen og således fastholdt cellevækst [15].

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i de vestlige lande . Ca. to tredjedele af patienterne er diagnosticeret på et fremskredent stadium, og af de resterende patienter, der gennemgår kirurgi, 30-50% udvikler tilbagefald med metastatisk sygdom [16], [17].

RAS

onkogen er muteret i op til -30% af lungekræft, med hovedparten af ​​mutationer findes i

KRAS

gen [16], [17]. Onkogent K-Ras prædisponerer transgene mus til lunge tumorigenese [18]. Ras signaler via flere veje, herunder mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK). Som nukleare acceptorer for MAPK signaleringskaskader, aktivatorproteinet (AP) -1 familien af ​​transkriptionsfaktorer er impliceret i stærkt vandrende fænotype af lungecancerceller [19], [20], [21].

lysyloxidase

(

LOX

) genet blev isoleret som de

ras recision gen

(

RRG

) på grund af sin evne til at vende tilbage Ras-medieret transformation af NIH 3T3 fibroblaster [22]. Vores gruppe viste ektopisk Pro-LOX-ekspression reduceret ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK) og phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt signalering og aktivering af NF-KB i Ras-transformerede NIH 3T3-celler [23]. Tab af

LOX

genekspression blev set i mange ondartede væv og afledte cellelinier herunder fra lunge [24], [25], [26], kolon [27], prostata [28], gastrisk [29 ] og hoved og hals planocellulære kræft [30]. Ektopisk

LOX

genekspression reduceret kolonidannelse af dyrkede gastriske kræftceller og tumor dannelse i en xenograft model [29]. Lysyloxidase syntetiseres og udskilles som et proenzym (pro-LOX), og behandlet til en funktionelt enzym (LOX) og aminoterminale propeptid (LOX-PP) [31].

RRG

aktivitet af Pro-LOX blev uventet mappet til LOX-PP-domæne, som bedømt ved inhibering af den transformerede fænotype af NIH 3T3-Ras-celler [32]. Efterfølgende blev LOX-PP vist sig at reducere vandrende fænotype af muse brystcancerceller drevet af Her-2 /Neu, som signalerer via Ras og deres evne til at danne tumorer i en nøgen mus xenotransplantationsmodel [33], [34]. I H1299 lungecancerceller, som indeholder en mutant

NTM

gen, reduceret LOX-PP aktiveringen af ​​ERK og Akt, og evne til forankringsuafhængig vækst og invasiv kolonidannelse i Matrigel [25]. LOX-PP svækkede også fibronectin-medieret aktivering af fokal adhæsion kinase i brystcancerceller [34], [35], og fibroblastvækstfaktor (FGF) -2-induceret proliferation af prostatacancerceller [36]. Her spurgte vi, om Blimp1 udtrykkes i lungecancerceller betragtning af den vigtige rolle for Ras-signalering i disse cancerceller. Blimp1 blev påvist i alle lungekræft linjer undersøgt og fremmet deres migration og invasion. Desuden

BLIMP1

RNA blev påvist i andre primære tumorer drevet af Ras-signalering. I lungecancerceller blev Blimp 1 ekspression induceret af en Ras /c-Raf /AP-1-vejen, som kunne inhiberes af LOX-PP via interaktion med c-Raf. Således disse undersøgelser identificerer Blimp1 som en kritisk mediator for lungekræft celle vandrende fænotype af transformerende Ras /c-Raf /AP-1 kaskade.

Materialer og metoder

Celler og dyrkningsbetingelser

Den ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) A549 og H1299 cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af Zhi-Xiong Jim Xiao (Boston University School of Medicine, Boston MA). Den Calu-1, H23 og H441 cellelinjer blev generøst tilvejebragt af Hasmeena Kathuria og Maria Ramirez (Boston University School of Medicine). A549, Calu-1, H23 og H441 celler udtrykker mutant K-Ras [37], [38] og H1299 express mutant N-Ras [39]. BOSC23-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Alle cellelinier blev opretholdt i Dulbeccos minimalt essentielt medium bortset H441 som blev opretholdt i RPMI-1640. Dyrkningsmedierne blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), som anbefalet af ATCC. H1299 kloner, der udtrykker muse LOX-PP i en doxycyclin (DOX) inducerbar vektor blev etableret og totalt RNA isoleret som tidligere [25] beskrevne. Inducerbare stabile A549-celler, der udtrykker V5-tagget humant eller muse LOX-PP blev etableret som tidligere beskrevet [33], [34]. Kort fortalt, PCL-ampho retrovirus emballage vektor (IMGENEX, San Diego, CA) blev co-transficeret i BOSC 23 celler under anvendelse FuGENE 6 (Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN) med enten tomme effektor vektor pC4

bsrR (TO) (EV) eller vektor bærer DNA-fragmenter af human eller muse-LOX-PP med C-terminale V5-tag og regulator vektor PCX

neoTR2 (begge venligst stillet til rådighed af Tsuyoshi Akagi, KAN, Kobe, Japan). Efter 48 timer blev supernatanter indeholdende viruspartikler høstet og ført gennem et 0,45 um filter (Corning Inc., Corning, NY). A549 lungecancerceller var duelt inficeret i 48 timer med supernatant fra BOSC 23 celler indeholdende virus med regulator og effektor vektorer suppleret med 6 ug /ml polybren (Sigma, St. Louis, MO). Inficerede celler blev selekteret med 10 ug /ml blasticidin (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 1,4 mg /ml geneticin (Sigma) for at frembringe separate puljer af stabile A549-EV, A549-human LOX-PP og A549-muse LOX-PP-celler .

plasmider og transfektion analyse

pcDNA3 /Blimp [2] og 7-kB

Blimp1

-pGL3 luciferase reporter (

Blimp1

-Luc ) [40] vektorer blev venligst stillet til rådighed af Tom Maniatis (Columbia University, NY) og Kathryn Calame (Columbia University), hhv. C-Jun, c-Fos, Fra-1 og Fra-2 AP-1 konstruktioner i pCI ekspressionsvektor var som tidligere beskrevet [41]. For transient transfektion af ekspressionsvektorer blev kulturer i plader med 12 brønde inkuberet i 48 timer i nærværelse af 1 ug DNA og 3 pi Fugene 6 eller 2,5 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Co-transfektion af den MSV-β-gal vektor, der udtrykker β-galactosidase (β-gal) blev anvendt til at normalisere for transfektionseffektivitet. Alle transient transfektion reporter assays blev udført i tre eksemplarer, to gange som tidligere [42] beskrevet, og standardfejl på middelværdien (SEM) beregnet.

BLIMP1

siRNA, og

Juni

,

FRA-1

og

FRA-2

siRNA duplex sekvenser blev som tidligere beskrevet [15], [43 ]. Den målrettet menneske siRNA

KRAS

gen (sc-35.731) var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). RNA-duplexer, der anvendes til målretning

c-RAF

var som beskrevet af Chadee og Kyriakis [44] og indkøbt fra QIAGEN (Valencia, CA). For transient transfektion af enkelte siRNA’er blev kulturer i 6-brønds plader inkuberet i 24 timer i nærværelse af siRNA duplex (10 nM endelig) og Lipofectamin RNAiMax (Invitrogen) ifølge producentens protokol. I tilfælde af co-transfektion af to AP-1 siRNAs, slutkoncentrationen af ​​hver siRNA var 10 nM, hvilket gør den totale siRNA koncentration 20 nM. Hvor nævnte, blev kulturen tilsat en negativ kontrol siRNA (Qiagen) i en endelig koncentration på enten 10 eller 20 nM, alt efter omstændighederne. Den Ras S186 ekspressionsvektoren blev venligst stillet til rådighed af Mark Philips (NYU School of Medicine, New York, NY). For konstruktion af N-terminalt glutathion

S

transferase (GST) tagged LOX-PP og dets deletionsmutanter, cDNA koder fuld længde LOX-PP (WT, aminosyre 1-162) og sletning af aa rester 26-100 (ΔM3) blev amplificeret fra fuld-længde Pro-LOX-cDNA [33] og indsat i BamHI /ClaI-stedet i pEBG-GST pattedyrekspressionsvektor, en generøs gave fra Dr. Bruce Mayer (University of Connecticut Health center, Farmington, CT). Til konstruktion af C-terminalt GST-mærket LOX-PP blev cDNA’er, der koder GST og LOX-PP amplificeret og indsat i pcDNA3.1 (+). pBabe-puro-MEK1 S217E /S221E konstitutivt aktiv (CA-MEK) mutanten blev venligt leveret af Dr. Geoffrey M. Cooper (Boston University, Boston, MA). CDNA’et, der koder MEK1 S217E /S221E blev indsat i pcDNA3.1 (+).

Immunblotanalyse

Nukleare ekstrakter (NE) og hele celleekstrakter (WCE) blev fremstillet og udsat for immunblotting, som tidligere beskrevet [33]. Til påvisning af udskilt rekombinant LOX-PP-V5, dyrkningsmedium (40 pi fra 2 ml dyrkningsmedium) blev immunblottet anvendelse af et anti-V5-antistof (R960-25, Invitrogen). Antistofferne mod Blimp1 (nr 9115s.), C-Jun (nr 9165.), Phospho-c-Jun (nr 9261s.), MEK1 /2 (L38C12;. Nr 4694) phospho-ERK1 /2 (phospho-Thr202 /Tyr204, ingen 9101s) og ERK1 /2 (9102) blev opnået fra Cell Signaling (Danvers, MA).. Antistoffer mod GST (B-14), K-Ras (F234), B-Raf (F-7), Fra-1 (N-17), Fra-2 (Q-20) og c-Fos (H-125 ) var fra Santa Cruz Biotechnology. Antistoffer mod β-actin (AC-15) og α-tubulin (DM1A) var fra Sigma. Hsp70 /Hsc70 (SPA-820) og Hsp90 (SPA-830) antistoffer blev indkøbt fra StressGen (Victoria, BC, Canada). Antistof mod c-Raf (klon 53) og Ras (klon 18 /Ras) var fra BD Transduktion (Franklin Lakes, NJ). Kanin polyklonale antistoffer mod LOX-PP blev fremstillet som tidligere [45] beskrevne. Resultaterne fra mindst to uafhængige forsøg blev underkastet densitometri og normaliseret til en β-actin-loading kontrol og middelværdierne i forhold til kontrol tom vektor (EV) celler (sæt til 1,0) givet.

Migration og invasion analyser

Suspension af 1 × 10

5 celler blev lagdelt, i tre eksemplarer, i de øverste rum i Costar Transwells (Corning, Lowell, MA) på en 8 mm polycarbonat diameter filter (8 um pore størrelse), og inkuberet ved 37 ° C i 16 timer. Migration af cellerne til undersiden af ​​filteret blev vurderet med phosphatase enzymatisk assay ved anvendelse af p-nitrophenylphosphat og OD

410 nm bestemmelse, som tidligere beskrevet [13], eller ved farvning med krystalviolet og OD

570 nm bestemmelse (63). Den gennemsnitlige migration fra tre uafhængige forsøg ± SD præsenteres i forhold til kontrollen EV, som blev sat til 1,0.

P

værdier blev beregnet ved hjælp af en Students

t

-test. For invasion assays, blev filtre forud belagt med 10 ug Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Migration af cellerne til undersiden af ​​filteret blev evalueret ved farvning med krystalviolet og OD

570 nm bestemmelse. Middelværdien ± SD er vist. Invasion assays blev udført tre gange i tre eksemplarer.

reverse transkriptase (RT) -PCR analyse

RNA blev isoleret under anvendelse RNeasy Mini Kit (Invitrogen), og prøver med A

260 /A

280 forhold mellem 1,8 og 2,0 blev behandlet med RQ1 RNase-fri DNase (Promega). Hævet III RT blev anvendt til revers transkription med 1 ug RNA i nærværelse af 100 ng af tilfældige primere (Invitrogen). For Realtime kvantitativ PCR (Q-PCR),

BLIMP1

primere blev som tidligere [46] beskrevet.

GAPDH

primere var: Fremad 5′-TTGCCATCAATGACCCCTTCA-3 ‘; Bagudrettet 5’-CGCCCCACTTGATTTTGGA-3 ‘. Q-PCR blev udført tredobbelt i et Roche LightCycler 480 system.

chromatin Immunpræcipitation (chip) assay

chip assays blev udført ved anvendelse af en EZ-chip kit (Millipore Corporation, Billerica, MA) ifølge producentens instruktioner. Til analyse af ektopisk udtrykte AP-1, blev 24 timer efter H441-celler transficeret med en c-Jun-ekspressionsvektor, blev formaldehyd (1% endelig) tilsat til celledyrkningsmediet. Helcellelysater blev fremstillet og underkastet sonikering i en Misonix 3000 Sonicator (Misnonix, Farmingdale, NY) i 15 cycler på 10 sekunder hver til opnåelse af genomiske DNA-fragmenter på -200 til 1000 bp. Efter preclearing med chip kvalitet protein G agarose blev 100 pi klippede DNA-protein-komplekser immunfældet med antistoffer mod c-Jun (sc-1694) eller normal kanin IgG (sc-2027) (Santa Cruz Biotechnology). Tværbinding blev vendt og oprensede genomiske DNA-fragmenter blev underkastet PCR. Tværbindingen blev vendt ved inkubation natten over ved 65 ° C og genomiske DNA-fragmenter oprenses med en Qiaquick PCR oprensningskit (QIAGEN, nr. 28104). To bindende elementer for AP-1, som også er kendt som TPA responsive elementer eller Tres, blev tidligere identificeret ved -1813 og -1647 bp i forhold til

BLIMP1

transkriptionsstartsitet [47] og kontrolleres ved hjælp TransFac ( genomatix.de) analyse. Regionen tværs af de to tres blev amplificeret ved PCR. Primerne til den -1813 bp TRE: fremadrettet 5′-GCCTTCTTCCCACCTCAAATATCA-3 ‘, omvendt 5′-TGGCCTGCTGTTCAAACAGTCT-CA-3′; og for -1647 bp TRE: fremadrettet 5’-GTTGCATGATGGTGTATGTGGCCT-3 ‘, omvendt 5′-ATCCAGCCTGCTCAAGAGGGTTTA 3’. Som en positiv kontrol for AP-1-binding, et fragment af den humane

juni

promotor indeholdende to nært beliggende TRE sites (-120 og -1 bp) blev tilsvarende underkastet chipanalyse, under anvendelse af de tidligere beskrevne primere [ ,,,0],48]. Som en negativ kontrol blev primere designet til en opstrøms region af

BLIMP1

promotoren (-5508 til -5366 bp) indeholdende ingen TRE sites: Forward 5′- TCCTTCCCTGTGTTTGGTCCCATT-3 ‘, omvendt 5’-ATTGTTTCCTTCAAGCAGGCACCC- 3 ‘. For binding af endogene AP-1 underenheder, blev A549-celler inkuberet i serumfrit medium i 48 timer og FBS (10% slutkoncentration) tilsat tilbage. Efter 30 minutter blev WCE fremstillet og underkastet chip assay, som ovenfor, ved anvendelse af antistoffer mod normalt kanin IgG, c-Jun, Fra-1 (sc-183), eller Fra-2 (sc-604) (fra Santa Cruz Biotechnology ).

Immunopræcipitation og GST pull down assay

H1299 eller A549-celler blev lyseret med puffer A [25 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 150 mM KCI, 2 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM dithiothreitol, 0,5 ug /ml leupeptin, 2 uM pepstatin A, 1 ug /ml aprotinin og 1% Triton X-100]. Lysaterne blev centrifugeret i en mikrocentrifuge i 10 minutter ved 13.000 rpm ved 4 ° C for at fjerne uopløseligt materiale. For immunopræcipitation, 2 ug enten kanin-anti-LOX-PP [45] eller kanin kontrol IgG blev tilsat til 500 ug cellelysat, efterfulgt af inkubation natten over ved 4 ° C. Protein G-Sepharose-perler (Invitrogen) blev derefter tilsat til blandingen, efterfulgt af inkubation ved 4 ° C i 2 timer med forsigtig omrystning. Perlerne blev vasket fire gange med puffer A. For GST-pull down assay blev lysaterne inkuberet med 20 pi Glutathione-Sepharose 4B (GE Healthcare) i 2 timer ved 4 ° C. Harpiksen blev vasket fire gange med puffer A. De immunkomplekser eller GST pull down-komplekserne blev elueret fra sepharose-perlerne med SDS-PAGE-prøvebuffer, og de udfældede proteiner analyseres ved immunoblotanalyse.

Resultater

lung cancerceller udtrykker Blimp1

Fem lunge cancer cellelinjer, drevet af mutant K-Ras eller N-Ras, blev udvalgt til at teste for Blimp1 udtryk: A549, H1299, Calu-1, H23 og H441. Nukleare ekstrakter blev underkastet immunoblotanalyse (fig. 1A). Som reference, vi indgår nukleare ekstrakter fra ERa- positive MCF-7 og ERa- negative MDA-MB-231 brystkræftceller, der vises relativt lavere og højere Blimp1 niveauer, henholdsvis [13]. Alle fem lungekræft cellelinier udtrykte 100 kDa Blimp1 protein genkendes af et antistof mod N-terminalen af ​​det humane Blimp1 protein. Som tidligere set, de ERa- negative MDA-MB-231 brystcancerceller udtrykte højere niveauer af Blimp1 end ERa- positive MCF-7-celler [13]. Alle de lungecancerceller udtrykt væsentligt højere mængder af Blimp1 end MDA-MB-231 linje. Således er Blimp1 udtrykt i lungecancerceller.

(A) Prøver af kerneekstrakter (20 ug) af A549, H1299, Calu-1, H23 og H441 humane lungecancerceller og MCF-7 og MDA- MB-231 (MB-231) brystcancerceller blev underkastet immunoblotting for Blimp1 og β-actin, som en kontrol for lige belastning. Positioner af molekylvægtsmarkører er angivet i den venstre bane. En repræsentant af to uafhængige forsøg med lignende resultater er vist. (B) A549 og (C) H1299-celler blev transient transficeret med 10 nM hver af

siBLIMP1-1

,

siBLIMP1-2

eller en kodet negativ kontrol siRNA. Øvre paneler: Otteogfyrre timer efter transfektion blev WCE (30 ug) udsat for immunblotting for Blimp1 og β-actin. Båndene blev kvantificeret ved anvendelse af NIH Image J software og Blimp1 ekspression normaliseret til p-actin-ekspression. Normaliseret Blimp1 ekspression blev bestemt i to uafhængige forsøg og middelværdierne er angivet nedenfor blottene. Lavere paneler: Alternativt efter 24 timer blev kulturerne trypsiniseret og 1 x 10

5-celler udsættes for en migration assay i 16 timer, i tre eksemplarer. Den gennemsnitlige migration fra tre uafhængige forsøg ± SD præsenteres i forhold til den negative kontrol siRNA (sat til 1,0).

P

værdier blev beregnet ved hjælp af Students

t

-test. *,

P

0,005; **,

P

0,0005. (D) A549-celler blev inkuberet i nærvær af 0,5 nM

siBlimp1-2

eller krypteret negativ kontrol siRNA i 16 timer. Celler blev derefter transficeret med Blimp1 ekspressionsvektor (2 ug per brønd i 6-brønds plade) og inkuberes i 32 timer. (Indsat) Helcellelysater (20 ug) blev underkastet western blot-analyse under anvendelse af antistoffer mod Blimp1 eller β-actin. Kulturer blev trypsiniseret og 1 × 10

5-celler udsættes for en migration assay i 16 timer, i tre eksemplarer. Den gennemsnitlige migration fra to uafhængige forsøg ± SE præsenteres i forhold til den negative kontrol siRNA og EV (sat til 1,0). Viste data er en repræsentant for to uafhængige forsøg med lignende resultater. (E) A549-celler blev transient transficeret med 10 nM hver af

siBLIMP1-1

,

siBLIMP1-2

eller en kodet negativ kontrol siRNA. Efter 48 timer blev kulturerne trypsiniseret og 1 x 10

5-celler udsat for en invasion assay i 16 timer, i tre eksemplarer. De gennemsnitlige data fra tre uafhængige forsøg ± SD præsenteres i forhold til den negative kontrol siRNA (sat til 1,0).

P

værdier blev beregnet ved hjælp af Students

t

-test. *, P. 0,01

Blimp1 fremmer migration af lunge kræftceller

Fraværet af Blimp1 i musefostre førte til udvikling af primordiale kønsceller-lignende celler, der var ude af stand til at migrere [ ,,,0],11], [12]. For at teste, om Blimp1 udtryk er involveret i kontrollen af ​​lungekræft cellemigration blev en knockdown strategi, der anvendes. A549 og H1299-celler, som udviste relativt høje niveauer af Blimp1 (fig. 1A), blev inkuberet med enten

siBLIMP1-1

eller

siBLIMP1-2

, to uafhængige siRNA arter, eller med en scrambled negativ kontrol siRNA. Efter 48 timer blev prøver af WCE underkastet immunoblotanalyse. Begge

BLIMP1

siRNA’er resulterede i effektiv knockdown af Blimp1 protein-ekspression sammenlignet med kontrollen siRNA. En mere robust knockdown blev set med

siBLIMP1-2

i begge cellelinier, dvs 93% fald i A549 og 88% i H1299 sammenlignet med 30% i A549 og 48% i H1299 med

siBLIMP1- 1 Hotel (øvre paneler, fig. 1B og 1C). Virkningerne af en 24 h inkubation med disse siRNAs om migration af A549 og H1299 celler blev testet i Boyden kamre (1 × 10

5 per brønd) ved hjælp af FBS som kemo-lokkemiddel. Celle migration blev målt 16 timer senere. Knockdown af

BLIMP1

udtryk førte til nedsat migration af A549 (fig. 1 B) og H1299 (Fig. 1C) lunge kræftceller. I tre uafhængige forsøg, udført i tre eksemplarer,

siBLIMP1-2

ført til en mere dybtgående reduktion i migrering af A549 (fald på 42% i gennemsnit med

siBLIMP1-1

vs 71% med

siBLIMP1-2

) og H1299 celler (fald i gennemsnit 35% med

siBLIMP1-1

vs 54% med

siBLIMP1-2

). Ingen signifikant virkning af behandlingerne på celleproliferation blev observeret (data ikke vist). Disse resultater stemmer overens med reduktionen af ​​Blimp-1-niveauer. For at bekræfte, at reduktionen af ​​celle migration var specielt på grund af knockdown af Blimp1 udtryk, vi udførte en rednings eksperiment ved hjælp af

siBLIMP1-2

og Blimp1 ektopisk udtryk i A549 lunge kræftceller. Kort fortalt blev A549-celler inkuberet med enten

siBLIMP1-2

eller negativ kontrol siRNA i 16 timer efterfulgt af transient transfektion af en vektor der udtrykker Blimp1 eller EV DNA. Efter 32 timer blev cellerne udsat for en migration assay eller prøver af WCE blev underkastet immunoblotanalyse.

BLIMP1

siRNA-2 resulterede i effektiv knockdown af Blimp1 proteinekspression sammenlignet med kontrollen siRNA og denne virkning blev overvundet ved Blimp1 ekspressionsvektor (fig. 1D, indsat). Som det ses ovenfor, knockdown af

BLIMP1

udtryk ført til et fald på 42% i celle migration i forhold til celler transficeret med negativ kontrol siRNA og EV, og dette blev tilsidesat af ektopisk Blimp1 udtryk (fig. 1D). En stigning på 33% i migration af A549-celler transficeret med Blimp1 cDNA og

siBlimp1-2

blev observeret i sammenligning med kontrollen siRNA og EV transficerede celler. Derudover blev ingen signifikante effekter på celleproliferation noteret over tidsforløbet (data ikke vist). Dernæst testede vi virkningerne af Blimp1 knockdown på invasion. Et fald i invasion af A549 lunge kræftceller blev bemærket med

BLIMP1

siRNA-1, som var endnu mere dybtgående med

BLIMP1

siRNA-2 i forhold til den negative kontrol siRNA, i overensstemmelse med migration data (fig. 1E). Således reducerede niveauer af Blimp1 bly nedsat evne af A549 og H1299 lungekræft celler til at migrere og invadere.

Vi næste udførte det omvendte eksperiment og ektopisk udtrykt Blimp1 i A549 og H441 celler, som udtrykker højere og moderate niveauer af Blimp1 henholdsvis. Kulturer blev transient transficeret med en Blimp1 ekspression cDNA eller parental tom vektor (EV) i 24 timer og underkastet migration assays, som ovenfor. I tre uafhængige forsøg, udført tredobbelt, Blimp1 overekspression øget vandring af A549 og H441 celler med gennemsnitligt 64% (fig. 2A) og 58% (fig. 2B) hhv. Western blotting af ekstrakter fremstillet fra tilsvarende transficerede kulturer bekræftede ektopisk ekspression af Blimp1 (øvre paneler, fig. 2A og 2B). Således Blimp1 fremmer en mere vandrende fænotype af lungecancerceller

(A) A549-celler eller (B) H441-celler blev transient transficeret med 1 ug af Blimp1 cDNA eller EV-DNA under anvendelse af lipofectamin 2000. Øvre paneler:. WCE blev isoleret efter 48 timer og underkastet immunoblotanalyse for Blimp1 og β-actin. Lavere paneler: Alternativt 24 timer efter transfektion, cellerne blev underkastet en migration assay som i fig. 1. Den gennemsnitlige migration fra tre uafhængige forsøg ± SD præsenteres i forhold til EV (sat til 1,0).

P

værdier blev beregnet ved hjælp af en Students

t

-test. *,

P

0,005. C) Box plot fra Hou lungekræft microarray datasæt blev åbnet ved hjælp Oncomine Database. Studerendes

t

-test for de to grupper viser en

P

værdi på 0,024. D) Kassegrafer fra Badea kræft i bugspytkirtlen, Estilo hoved-halscancer og Sun hjernen tumor microarray datasæt blev adgang til ved hjælp Oncomine Database. Studerendes

t

-tests sammenligne grupper i disse undersøgelser viser

P

værdier 8.67e

-7, 0,001 og 3.28e

-15 hhv.

Flere primære tumorer vise overekspression af

BLIMP1

RNA

Vi næste spurgt, om

BLIMP1

RNA detekteres i primære lungetumorer. Forhøjet

BLIMP1

mRNA-ekspression blev detekteret i lunge adenocarcinom prøver sammenlignet med normale lungevæv [49] (fig. 2C). Konstitutiv Ras-signalering induceret af enten en mutant

RAS Salg gen eller opstrøms aktivator, såsom vækstfaktorreceptor har været impliceret i mange andre tumorer.

KRAS

mutationer er blevet fundet i 95% af pancreas-adenocarcinomer ductusceller [50], mens overekspression af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), der inducerer Ras-signalering, blev fundet i 80-90% menneskehoved og hals pladecellecarcinomer [51] og 40% af glioblastomer [52]. Især vores analyser ved hjælp microarray datasæt i Oncomine afslørede forhøjede

BLIMP1

RNA-ekspression i prøver af pancreas adenocarcinom [53], tunge pladecellecarcinom [54] og glioblastoma [55] sammenlignet med de tilsvarende normale væv (fig. 2D). Således

BLIMP1

RNA er overudtrykt i en forskelligartet gruppe af menneskelige kræftformer.

Ras til c-Raf signalering inducerer Blimp1 udtryk i lunge kræftceller

For at direkte fat på rollen af Ras signalering på Blimp1 niveauer i lungekræft celler, blev en dominerende negativ mutant først brugt. Ras S186 mutanten bibeholder evnen til at associere med effektor proteinkinase C-Raf, men ikke translokerer til membranen og inhiberede aktivering af Blimp1 af Bcl-2 [13], [56]. A549-celler, som udtrykker en aktiveret mutant K-Ras C12, blev transficeret med EV eller et plasmid, der udtrykker Ras S186 og efter 48 timer, WCE og RNA blev isoleret. Ektopisk ekspression af Ras S186, hvilket blev bekræftet ved immunoblotting, nedsat Blimp1 protein ekspression ved ~54% (fig. 3A). I to separate forsøg,

BLIMP1

mRNA-ekspression faldt gennemsnitligt 48% ved ektopisk ekspression af Ras S186 (fig. 3B). Virkningerne af den dominerende negative Ras på

Blimp1

promotor-aktivitet blev også testet. A549-celler blev co-transficeret med enten EV eller Ras S186 vektor-DNA, sammen med en 7-KB

Blimp1

promotor reporterkonstruktion

Blimp1

-Luc og en β-gal-ekspressionsvektor, til normalisering af transfektionseffektiviteten. Overekspression af Ras S186 førte til en gennemsnitlig nedgang på 69% i normaliseret

Blimp1

promotoraktivitet (fig. 3C). Endelig er en si-

KRAS

strategi blev anvendt (fig. 3D). Knockdown af K-Ras førte til et fald på 93% af K-Ras protein-ekspression og til et betydeligt fald i ERK aktivitet som vurderet ved en reduktion i phospho-ERK niveauer. Desuden blev et gennemsnitligt fald på 44% i Blimp1 niveauer set i to uafhængige forsøg (fig. 3D). Tilsammen indikerer disse resultater, at oncogene Ras-signalvejen i A549 lungecancerceller drev

BLIMP1

genekspression.

(A) A549-celler blev transficeret med 5 ug af et plasmid, der udtrykker dominant negativ Ras S186 eller EV-DNA. Efter 48 timer blev WCE og RNA fremstillet. *, P 0,01.