PLoS ONE: Anvendelse af et glycolipid inhibitor at forbedre Renal Cancer i en mus Model

Abstrakt

I en xenograft model, hvori, live renale cancerceller blev implanteret under nyrekapslen i mus, viste en 30-fold stigning i tumorvolumen over en periode på 26 dage, og dette var ledsaget af en 32-gange stigning i niveauet af lactosylceramid (LacCer). Mus fodret D- threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (D-PDMP), en inhibitor af glucosylceramidsyntase og lactosylceramid syntase (LCS: P-1,4-GalT-V), viste markant reduktion i tumorvolumen. Dette var ledsaget af et fald i massen af ​​lactosylceramid og en stigning i glucosylceramid (GlcCer) niveau. Mekanistiske undersøgelser viste, at D-PDMP hæmmede celledeling og angiogenese ved at hæmme p44MAPK, p-AKT-1-vejen og pattedyr mål for rapamycin (mTOR). Ved at sammenkæde glycosphingolipide syntese med tumorvækst, kan nyrecancer progression og regression evalueres. Således hæmme glycosphingolipid syntese kan være en respektabelt mål at forhindre progression af andre former for kræft

Henvisning:. Chatterjee S, Alsaeedi N, Hou J, Bandaru VVR, Wu L, Halushka MK, et al. (2013) Anvendelse af et glycolipid inhibitor at forbedre Renal Cancer i en musemodel. PLoS ONE 8 (5): e63726. doi: 10,1371 /journal.pone.0063726

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: 26 september, 2012; Accepteret: April 5, 2013; Udgivet: 9. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Chatterjee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev finansieret gennem TEDCO, State of Maryland tilskud, Johns Hopkins University institutionel støtte og en National Institutes of Health give PO-1-HL-107.153-01. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. SC tjener i det videnskabelige rådgivende bestyrelse Amalyte Pharmaceuticals og ikke modtager honorar for hans tjenester og sådanne oplysninger lagres i de institutionelle eOPC optegnelser. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Alle andre forfattere har nogen konkurrerende finansielle interesser

Introduktion

Nylige undersøgelser tyder på, at sphingolipider kan fremkalde fænotyper såsom spredning, vedhæftning og angiogenese-kendetegnene i tumorvækst og metastase [1] -. [ ,,,0],6]. Anvendelse af lægemidler, der hæmmer glycosphingolipid syntese giver mulighed for at undersøge, hvilken rolle disse forbindelser i dyremodeller for humane sygdomme. Her demonstrerer vi, at ved at forbinde glycosphingolipide syntese og dets inhibering i en musemodel for renal cancer, er det muligt at observere fodaftryk interaktioner mellem lægemiddel og glycosphingolipid enzymer og forudsige sygdommens begyndelse /tumorudvikling og tumorregression. Blokering glycosyleringen af ​​ceramid til behandling af kræft er blevet dokumenteret i celle og i dyremodeller [2], [3].

Tumorer kræver dannelse af nye blodkar fra præ-eksisterende (angiogenese) og vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) spiller en kritisk rolle ved induktion af angiogenese i en række tumorer [4], [5]. Derfor vi rationaliseret at målrette endotelceller, linje tumor blodkar, som er beriget med en isoform af LCS kan have flere teoretiske fordele såsom målrette drug delivery i flere typer af kræft. Vores rationale stammer fra vores tidligere fund, hvor VEGF blev vist at stimulere LCS: β-1,4-GalT-V i humane arterielle endothelceller til at producere LacCer, og som resulterede i aktivering af “oxygen følsomme” signalvejen fører til angiogenese [4]. Desuden at brugen af ​​små interfererende RNA (siRNA) forårsage LCS: P-1,4-GalT-V-gen ablation eller farmakologisk manipulation ved anvendelse af D-PDMP, en inhibitor af uridindiphosphat glucose ceramid glucosyltransferase (UGCG), og LCS [7], markant mindsket VEGF-induceret angiogenese [5]. Observerede vi også, at D-PDMP kan væsentligt (

P

0,0005) afbøde VEGF /β-FGF induceret angiogenese

in vivo

i nøgne mus [4] og hæmme eksperimentelle metastaser af murine Lewis lungekræft [8].

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme, om at hæmme glycosphingolipid syntese ville også hæmme celledeling /reducere tumor volumen

in vitro

in vivo

. Denne undersøgelse opnået det mål, at hæmme glycosphingolipid syntese også ville hæmme celledeling /reducere tumor volumen

in vitro

in vivo

.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af The Johns Hopkins Medicine Institutional Animal Care og brug Udvalg, tilladelse # MO03M615. De relevante indsats taget at forbedre dyrenes lidelser, herunder anæstesi (Ketamin og Xylazin) og post-kirurgi opfølgning (periodisk kontrol af dyr, i op til 8 timer efter kirurgi). Antibiotisk salve blev indgivet i stedet for indsnit og en optisk salve blev påført for at forhindre deres øjne tørrer ud under operationen.

Forsøg med mus Salg

Musen nyrekræft (RENCA) cellesuspension var loaded i en 1 ml sprøjte. Recipientmus (BALB /c-mus) blev præ-bedøvet med i.p. injektion (100 ul) af en stamopløsning af ketamin /xylazin (8 mg /kg), fastgjort på en jordforbundet plade med bagsiden hud barberet og fremstillet på en steril måde. Et snit blev lavet i den venstre flanke og venstre nyre og blotlagt. 100 pi tumor cellesuspension (1 x 10

6 celler /inoculum) blev injiceret i subkapsulær rum af den venstre nyre. Nyren blev derpå anbragt i den oprindelige position, og incisionen blev lukket med sterile metal sikker klip. Eksperimentel behandling begyndte 2 dage efter subkapsulær tumor implantation. Mus blev fodret ved oral sondeernæring D-PDMP (3 og 10 mg /kg legemsvægt) dagligt. D-PDMP blev solubiliseret i 5% Tween-80 i saltvand. Ti mus (N = 10) blev anvendt i hver gruppe.

placebogruppen af ​​mus med tumor implantat modtages dagligt, et tilsvarende volumen af ​​100 ul køretøj. Efter denne procedure blev dyrene overvåget dagligt. Slutpunktet for dette sæt af eksperimenter var tumorvækst vurdering i nyrerne. Tumorvækst Overvågning af dyr implanteret orthotopisk i nyren blev udført ved manuel palpation to gange om ugen. Efter 4 uger, (dag 26-28 post tumor implantation), blev dyrene aflivet med CO

2 og obduceret. måling Tumorvækst blev udført ved direkte tumorvægt vurdering ved afslutningen af ​​forsøget.

Histologiske undersøgelser

Primære tumorer blev sendt til histologi (N = 4). Vævssnittene blev farvet med hematoxylin -eosin og med antistoffer mod CD31 (en vigtig markør for angiogenese) og caspase-3 (en vigtig markør for apoptose). Lactosylceramid antistof (CD17) blev købt fra Ancell Laboratories og blev anvendt til at identificere lokaliseringen af ​​LacCer i nyrevævet. Vævene blev høstet fra de andre 4 mus og anvendes i Biochemical /molekylære assays beskrevet i teksten.

Ekstraktion af D-PDMP og sphingolipider Salg

Sample ekstraktion blev udført ved anvendelse af en modificeret Bligh og Dyer procedure som tidligere beskrevet [9]. Hver prøve blev homogeniseret ved stuetemperatur i 10 volumener deioniseret vand. Tre volumener af 100% CH

3OH indeholdende 53 mM HCOONH

4, 17 ng /ml C

12:00 ceramid, og 17 ng /ml C

12:00 sphingomyelin (interne standarder, IS ) blev tilsat, og blandingen blev hvirvlet. Fire volumener CHC

3 blev tilsat, vortexblandet og derefter centrifugeret ved 1000 x

g

i 10 minutter. 100 pi af CHC

3 lag blev separeret, tørret under en strøm af nitrogen, og remanensen blev opløst i 100% methanol indeholdende 10 ng /ml C

02:00 ceramid som en intern standard til kvantificering af D -PDMP. Derefter blev prøverne overført til hætteglas glas indsætter for LC /MS /MS-analyse; 10 pi blev injiceret i LC /MS /MS. Alle opløsningsmidler og kemikalier var HPLC-kvalitet. Lipid ekstraktioner blev udført under anvendelse af borsilicat-coatede glasrør og pipetter, for at reducere adhæsion af lipider til overflader.

LC /MS /MS-analyse for sphingolipider og D-PDMP

Identifikation af sphingolipid arter og D-PDMP blev udført under anvendelse af en 3000 PE Sciex væskekromatografi elektrospray ionisering tandem massespektrometer, anvendes i positiv modus (LC-ESI /MS /MS; Applied Biosystems, Thornhill, Ontario, Canada), og ifølge fremgangsmåder rapporteret i tidligere undersøgelser [ ,,,0],10]. Systemet består af to Perkin Elmer LC pumper forbundet til en HTC PAL auto-injektor (CTC Analysis, Zwingen, Schweiz) udstyret med en 50 pi prøve loop. Flow rate var 400 ul /min for ceramider og 1 ml /min for sphingomyeliner. Flow fra prøven injektor førte til en 2,6 um C kolonne for ceramider og D-PDMP, og en 5 um C

18 søjle for sphingomyeliner (Phenomenex, Torrance, CA). Søjlen blev præækvilibreret i 0,1 minutter med opløsningsmiddel A, der bestod af CH

3OH: dH

2O (85:15, v /v) med 5 mM HCO

2NH

4, og prøve elueres med opløsningsmiddel B, der bestod af CH

3OH: HCOOH (99:1, v /v) med 5 mM HCO

2NH

4. Den eluerede prøve blev automatisk indført i ionkilden. Instrument parametre for LC-ESI /MS /MS blev optimeret individuelt for hver art af ceramid, ceramid-1-phosphat, sphingosin, sphinganine, sphigosine-1-phosphat, sphingomyelin, og D-PDMP ved overvågning multipel reaktion. Ceramider og sphingomyeliner blev kvantificeret ved arealet under kurven (AUC) af tællinger per sekund (CPS) normaliseret til interne standarder (ceramid C

12:00 og sphingomyelin C

00:00). D-PDMP koncentrationer blev bestemt ved at skabe en standardkurve, der blev konstrueret ved anvendelse af forholdene mellem referencestandarder (D-PDMP; 0,1-100 ug /ml) til IS (ceramid C

2:00; 10 ng /ml) plottes mod forholdene mellem reference og er fra eksperimentelle prøver. Alle stamopløsninger blev opbevaret ved -20 ° C og stabilt over 6 måneder.

glycosyltransferase og glycosylhydrolase aktivitetsassays

LCS aktivitet i nyre præparater blev målt ved anvendelse af en protokol beskrevet tidligere [11] med følgende modifikationer. Kort fortalt blev lynfrosset nyrevæv homogeniseret i Tris-HCI-buffer (pH 7,4) indeholdende Triton-X-100 og centrifugeret ved 10.000 rpm i 15 min. Proteinet masse i supernatanten blev målt og 100 ug prøveprotein blev anvendt i enzymatiske assays, i tre eksemplarer. 14C-UDP-galaktose (American radioaktiv mærkning Company, St. Louis, MO) fungerede som donor af galactose. Og glucosylceramid (Matreya Chemicals, PA) tjente som acceptoren i dette assay. 14C-LacCer dannet fra dette assay blev kvantificeret ved scintillation spektrofotometri. Glucosylceramidsyntase aktivitet blev målt ved anvendelse ceramid som acceptoren og [3H] UDP- glucose som glucose donor. Glucosylceramid hydrolase-aktivitet blev målt ved hjælp af [3H] glucosylceramid (American radiomærke Company), som substratet ifølge tidligere offentliggjorte protokoller.

Western immunoblot undersøgelser

Nyrer blev høstet fra kontrol, placebo, 3 MPK og 10 MPK af D-PDMP fodret oralt og daglig til mus. De nyrevæv blev homogeniseret i RIPA-puffer (Sigma-Aldrich), anbragt på is i 15 minutter, centrifugeret ved 13.000 RPM, og supernatanterne blev opsamlet. For at bestemme proteinkoncentrationen blev Bradford assay anvendes. Til en 4-15% gel (Bio-Rad Ready Gel) blev 45-90 ug proteinprøver og 10 pi lavmolekylær protein standard (Bio-Rad Dual Color Precision Plus) indlæses. Efter gelelektroforese i 1,5 timer, blev Immuno-Blot PVDF-membraner (Bio-Rad) gennemvædet med kold methanol, dH

2O, og overførsel buffer (Bio-Rad). Dernæst blev gelen overført til en PVDF-membran (Bio-Rad) ved 30 V natten over. Membraner blev blokeret i 3% mælk, 1 × TBST (0,05% Tween-20), inkuberet i primære antistoffer imod: P-1,4-GalT-V, beta actin, UGCG (Santa Cruz Biotechnology), GAPDH (glyceraldehyd-3- phosphatdehydrogenase, US biologiske), p44MAPK (Thr202 og Tyr204), p-AKT-1 (Thr308) (cellesignalering Technologies) og mTOR (Sigma-Aldrich) i 1 × TBS med 1:200 fortynding og 0,5% BSA, og inkuberet i sekundært antistof, ged anti-kanin IgG HRP-konjugat (Sigma Aldrich) i 5% mælk, 1 × TBST med 1:1000 fortynding. Alle primære antistoffer krævede inkubation natten over ved 4 ° C, medens sekundære antistoffer krævede 1 times inkubering ved stuetemperatur. Dernæst blev membranerne vasket i 1 × TBST i 5-10 minutter og gentages 2 gange og udviklet ved hjælp af ECL (Amersham ECL Plus ™ Western Blotting Detection reagenser).

Computer assisteret kvantificering af caspase-3 og CD31 positive celler

Alle immunhistokemisk farvede objektglas blev digitalt scannet ved hjælp af en Aperio CS ScanScope (Vista, CA). For Caspase-3 analyse blev den sjældne begivenhed og nukleare algoritmer af Aperio Tool Box Kit udnyttet. Den sjældne begivenhed detektor identificeret caspase positive celler, som blev bekræftet ved hånd-datasikring. Denne værdi blev divideret med den totale celletal, for at bestemmes af den nukleare algoritme området. CD31 område blev identificeret ved at dividere et CD31 positiv maske område ved levedygtig tumor maske område for hvert dias, som tilsvarende beskrevet [12].

Statistiske undersøgelser

Dataene udtrykt som en gennemsnitlig ± standardafvigelse og som et gennemsnit ± standardfejl måling. Den store forskel mellem kontrolgruppen, placebo, og forsøgsgruppe blev evalueret ved brug af studerendes

t

test og en måde ANOVA. Parvis sammenligning blev foretaget for at bestemme signifikans mellem forskellige behandlinger. Forskelle blev betragtet som signifikante ved

P

. 0,05

Resultater

Vi observerede, at D-PDMP men ikke L-PDMP hæmmede væksten af ​​RENCA-celler (se figur S1 ). Derfor hypotese vi, at hæmme LCS aktivitet og reducere LacCer belastning kan meget vel reducere nyrekræft hos mus. I denne undersøgelse anvendte vi D-PDMP eftersom det er ugiftigt og optages af nyrerne, hjernen og leveren, når det gives oralt til mus [13]. Det er også hurtigt ryddet af cytochrom P450-systemet som sin t

1/2 er -50 minutter [13]. Selvom D-PDMP blev syntetiseret for at afbøde Gauchers sygdom ved at hæmme UGCG aktivitet, viste vi, at det også hæmmet LCS aktivitetsbaseret LacCer produktion og dermed angiogenese

in vitro

in vivo

, i nøgne mus [5]. Heri vi vise, at hæmme LCS aktivitet og LacCer produktion specifikt er centrale for signalering begivenheder såsom angiogenese og spredning, der fører til en markant reduktion i tumor volumen i en musemodel for nyrekræft.

En uge efter ansøgning, den primære tumor var makroskopisk synlig; efter 10 dage spontan metastase udviklet i regionale lymfeknuder, lunge, bughinden, og lever, hvilket tillader RENCA model, der skal afholdes i lighed med human renal cell carcinoma. Den gennemsnitlige overlevelsestid for RENCA-bærende mus er 32 dage, hvor 10

6 RENCA celler injiceres. For at bestemme, om ændring i glycosphingolipid profil er et vigtigt element i nyrekræft, vi sammenlignet niveauet af disse lipider i kontrol nyre (ikke bærende RENCA) versus placebo mus nyre (bærende RENCA). Samtidig undersøgte vi effekten af ​​fodring D-PDMP på tumor volumen og lipid niveauer i nyrevæv. Vi observerede, at implantation af RENCA-celler i subkapsulær plads i venstre nyre (placebo mus, og ingen behandling) bidrog til -30 gange stigning i tumorvolumen, over en periode på ~26 dage (figur 1A). Legemsvægten ændrede ikke (figur 1 B) og 20% ​​af musene i placebogruppen døde. Oral fodring af 3 MPK D-PDMP og 10 MPK D-PDMP for forsøgsperioden reduceret tumor volumen til -50% med placebo mus nyre tumorer. Denne D-PDMP dosis-uafhængig reduktion i tumorvolumen kunne til dels forklares ved vores observation, at indholdet af D-PDMP (målt ved LC-MS /MS) i nyrevævet var ens (figur 1C), da det kan er hurtigt udskilles. Detaljeret tandem LC-MS /MS viste, at C24, C16 og C22 var de store fedtsyre-molekylspecies i ceramid, mono- og di hexosylceramide og sphingomyelin i kontrol, placebo, og D-PDMP-fodrede mus nyrevæv. Og C20, C18 og C26 var de mindre fedtsyre indeholdende sphingolipider (figur S2). Den samlede ceramid niveau steg ~2.5 gange i placebo mus nyre vs. kontrol. Interessant, fodring 3 MPK D-PDMP ændrede ikke niveauet af ceramid i nyre sammenlignet med placebo (figur 2A). i 10 MPK D-PDMP fodret mus, niveauet af ceramid faldt Til styring niveau. Selv hævdes D-PDMP at være en specifik inhibitor af UGCG og dermed bidrage til en stigning i ceramidniveauer, i denne undersøgelse kunne ikke hæve vævsniveauer af ceramid i muse nyre. Og denne observation er i overensstemmelse med en tidligere rapport, der viste, at D-PDMP (100 MPK) faldt nyre ceramid level~9% 5 timer senere [13]. Injektion 40 MPK D-PDMP to gange dagligt i 4 dage resulterede også i en nedgang på 23% i ceramid i nyre [13]. I en anden undersøgelse ved anvendelse iminosukkeret N- (5-adamantinane-1′-yl-methoxy) pentyl-1-deoxynoijirimycin (AMP-DNM), en inhibitor af UGCG heller ikke hæve ceramidniveauer i lever og opretholdt plasmaniveauet af ceramid til basisniveauet i kost-induceret hyperlipidæmi i apoE – /- mus [14]. Årsagerne til en D-PDMP medieret fald i ceramid niveau i mus nyre fremgår ikke klart af denne undersøgelse. Da ceramid er et direkte forstadium for sphingomyelin syntese, vi forventede et højere sphingomyelin i D-PDMP behandlede mus. Men niveauet af sphingomyelin i vores undersøgelse og i en tidligere undersøgelse [13] ikke væsentligt (figur 2H). Dette kan skyldes, mens en højere pulje af ceramid kan inducere en stigning i sphingomyelin syntese; men da D-PDMP også øger aktiviteten af ​​sphingomyelinase, kan det bidrage til at bevare sphingomyelin homeostase [13]. Ceramid kunne også hydrolyseres til dannelse sphingosin og dets derivater (Figur 2C-E). For eksempel vores yderligere undersøgelser viser, at niveauet af ceramid-1-phosphat (figur 2B), sphingosin (figur 2C), sphingosin-1-phosphat (figur 2D) og sphinganine (figur 2E) varierede i placebo mus nyre sammenlignet med kontrol og efter behandling med D-PDMP. Især 20-fold stigning i niveauet af sphingosin-1-phosphat i placebo mus versus kontrol blev noteret. Behandling med 3 MPK D-PDMP ikke formindske niveauet af sphingosin-1-phosphat sammenlignet med placebo mus nyre. Dog efter fodring 10 MPK D-PDMP observerede vi et fald i niveauet af dette lipid 50%. Niveauet af monohexosylceramides var forhøjet 5-fold i placebo mus sammenlignet med den af ​​kontrol muse nyre men ændrede ikke ved fodring 3 MPK D-PDMP (figur 2F). Overraskende niveauet for denne lipid steg noget ved fodring 10 MPK af D-PDMP. Denne observation kan fortolkes for at indikere en kompenserende reduktion i niveauet af LacCer i mus behandlet med 10 MPK af D-PDMP som faldt aktiviteten af ​​LacCer syntase. Således et uventet resultat ved denne undersøgelse er, at langvarig (26 dage) fodring af D-PDMP ikke faldt niveauet af monoglycosylceramides i muse nyre selvom D-PDMP tidligere er blevet vist at tjene som en inhibitor af glucosylceramid syntese. Den største stigning i niveauet af dihexosylceramide, ~32-fold, forekom i placebogruppen nyre sammenlignet med kontrol. Men niveauet af lactosylceramid faldt dosisafhængigt i mus fodret 3 MPK og 10 MPK af D-PDMP (figur 2G). Dette var ledsaget af en D-PDMP dosisafhængigt fald i aktiviteten af ​​LacCer syntase (figur 3C), men ikke GlcCer syntase (figur 3A). I modsætning hertil observerede vi, at aktiviteten af ​​glucosylceramid hydrolase faldt, med en stigning i dosen af ​​D-PDMP fra 3 MPK til 10 MPK (figur 3B). Reduceret aktivitet af glucosylceramid glucosidase i mus behandlet med 10 MPK D-PDMP (figur 3B) kan have bidraget til en øget grad af GlcCer (figur 2F). Interessant har niveauet af sphingomyelin ikke ændre i kontrol, placebo, og D-PDMP-fodret muse nyre (figur 2H). Sammenfattende stigningen i nyrerne tumorvolumen i RENCA bærende mus og dens fald efter behandling med D-PDMP korrelerede bedst med niveauerne af LacCer masse, sammenlignet med andre sphingolipid undersøgt i dette studie.

Mus (BALB /C) blev præ-bedøvet og RENCA tumor cellesuspension (10

6 celler) blev injiceret i subkapsulær rum af den venstre nyre. Eksperimentel behandling begyndte to dage efter subkapsulær tumorimplantation. Mus fodret oralt i foderet D-PDMP (3 og 10 mg /kg legemsvægt, MPK) dagligt. D-PDMP blev solubiliseret i 5% Tween-80 i saltvand. Placebo mus modtog køretøjet (5% Tween-80 i saltvand 100 pi kun). Efter 26 dage blev musene aflivet. Den højre nyre tjente som kontrol, og venstre nyre tjente som placebo eller stof behandlet med 3 og 10 MPK af D-PDMP. A: En markant stigning i mus nyre tumor volumen faldt drastisk ved at fodre D-PDMP. B. D-PDMP (3 og 10 MPK) ikke reducere det samlede kropsvægt hos mus. C: Niveauet af D-PDMP i nyrer fra mus behandlet med 3 og 10 MPK af D-PDMP var ens

Niveauet af forskellige sphingolipider blev målt ved tandem LC-MS /MS.. A: D-PDMP faldt niveauet af ceramid, B: ceramid-1-phosphat, og D: sphingosin-1-phosphat. D-PDMP let øget niveauet af sphingosin; C, E: sphinganine og F: monohexosylceramide. G: D-PDMP dosisafhængigt reduceret niveauet af dihexosylceramide i mus nyrekræft. H: D-PDMP ændrede ikke niveauet af sphingomyelin i mus nyrekræft. (* P 0,05, ** p .01 N = 4).

Måling af lactosylceramid syntase-aktivitet i muse nyre blev udført ved anvendelse UDP [14C] galactose som galactose donor og GlcCer som acceptor, som beskrevet [11]. Vi observerede, at fodring D-PDMP dosisafhængigt reduceret aktiviteten af ​​dette enzym A: glucosylceramidsyntase aktivitet blev reduceret i samme grad, uanset om 3 MPK eller 10 MPK af D-PDMP blev tilført til mus med nyrecancer, B: glucosylceramidehydrolase aktivitet blev reduceret med D-PDMP behandling og C:. lactosylceramid syntase-aktivitet blev dosisafhængigt faldet i D-PDMP fodret mus med nyrekræft (N = 4 * p 0,05)

Næste ved hjælp af en kommercielt tilgængelig monoklonalt antistof mod LacCer, vi afgjort, om LacCer var en stor lipid akkumulere i nyrekræft. Vores immunhistokemiske undersøgelser viste ophobning af store mængder lactosylceramid inden cytoplasmatiske vesikler (hvide pile) udelukkende i kræftceller (sammenligne figur S3A; DAPI pletten vs figur S3B, CD17-antistof farvede celler). Vi har tidligere vist, at i human tumor nyre proximale tubulære celler, er aktiviteten af ​​LCS forøget, og dette er ledsaget med en stigning i niveauet af LacCer sammenlignet med normal human nyre [15]. Øget niveau af LacCer er også blevet rapporteret i human nyrekræft [16]. Disse resultater antyder, at i musemodel for renal cancer, er stigningen i lactosylceramid masse bedst korreleret med stigningen i tumorvolumen og progression af sygdommen. Således kan målrette glycolipid syntese, især LCS og LacCer være et respektabelt terapeutisk tilgang til at afbøde nyrecancer.

For at forstå de molekylære veje, der bidrager til en reduktion i tumor volumen på grund af D-PDMP fodring i mus, vi udført western immunoblot assays af flere biomarkører, vist af andre og os [5], [17], [18], [19] for at bidrage til celleproliferation, angiogenese, og apoptose. Vores mekanistiske undersøgelser viste, at D-PDMP påvirket en markant reduktion i tumorvolumen ved at nedsætte ekspression af forskellige signalmolekyler involveret i veje, der bidrager til celleproliferation og angiogenese. For eksempel var der en markant stigning i massen af ​​LCS i placebo mus nyre sammenlignet med kontrol og denne observation kan forklare en markant stigning i LacCer niveau i placebo nyre vs kontrol. D-PDMP dosisafhængigt reduceret massen af ​​LCS (figur 4A). I modsætning hertil blev niveauet af UGCG steget i D-PDMP fodret mus (figur 4A). Biomarkører for celleproliferation og angiogenese f.eks p44MAPK og p-AKT-1 blev alle faldt i nyrer fra mus fodret D-PDMP sammenlignet med placebo nyre (figur 4B). Disse iagttagelser antyder, at D-PDMP påvirker celleproliferation og angiogenese ved inhibering af aktiviteten af ​​LCS og LacCer produktion. Parallelt

in vitro

undersøgelser, vi har observeret, at D-PDMP men ikke L-PDMP dosisafhængigt reduceret spredning af RENCA celler, muligvis på grund af anholdelsen af ​​celler i G2-M-fasen af ​​cellens cyklus, efter behandling med D-PDMP [20] (figur S1).

Repræsentative immunoblotter af vævsekstrakter fra BALB /c-mus fodret køretøj (placebo plus RENCA-celler /tumor) og 3 og 10 MPK af D- PDMP i 26 dage og kontrol nyre og tilsvarende densitometriske scanninger er vist. A: D-PDMP dosisafhængigt reducerede protein ekspression af LacCer syntase (β-1,4-GalT-V) (N = 3-6), i muse renal cancer, men noget forøget protein ekspression af UGCG (N = 2) i mus nyrekræft. B: Western immunoblots af markører for celleproliferation (p44MAPK, N = 3), angiogenese (Pakt-1, N = 3; mTOR, N = 3 for placebo og 10 MPK) og hus holder protein GAPDH. D-PDMP behandling reducerede markører for celleproliferation og angiogenese. Data blev vurderet ved envejs ANOVA.

Histologisk evaluering af nyrerne afslørede omfattende vækst af aggressiv RENCA, med markante nekrose. Nekrose, som procent af tumorvolumen blev kvantificeret ved hjælp af digitale analyseværktøjer [21] og viste sig at være 38,8%, 28,4% og 33,2% for placebo, 10 MPK, og 25 MPK behandlede mus (Figur S4A-H). Vi har tidligere vist, at D-PDMP effektivt kan inhibere VEGF-induceret angiogenese

in vitro

i humane navlevene-endotelceller og humane arterielle endothelceller [4], [5]. Også i en tidligere undersøgelse blev VEGF + β-FGF induceret angiogenese afbødes ved D-PDMP i mus [4]. Dette blev målt ved et markant fald i ekspressionen af ​​CD31 og angiogenese. For at afgøre om et fald i nyre tumor volumen var også på grund af et fald i udbuddet af blod i form af nedsat angiogenese, vi udførte immunfarvning for CD31 (figur S4i, J). Der var et markant fald i CD31 positive vaskulære område i levedygtige områder af tumoren (0,3% versus 0,05% for placebo vs. 25 MPK behandlede mus) som bestemt ved hjælp af digitale analyseværktøjer [21]. Tidligere mTOR er blevet etableret som en markør for angiogenese og har været en valideret target at afbøde flere typer af kræft. Vi observerede, at D-PDMP markant nedsat mTOR proteinekspression (figur 4B), hvilket antyder, at ved at inhibere angiogenese, D-PDMP frataget tumoren blodtilførsel og dermed bidraget til en reduktion i tumorvolumen. Et uventet resultat var, at D-PDMP faldt betydeligt antallet af apoptotiske celler målt ved caspase-3 immunfarvning. Procenten af ​​caspase-positive celler var 0,09%, 0,04% og 0,03% for placebo, 10 MPK, og 25 MPK behandlede mus som bestemt ved digital analyse (Figur S4K-N) [21]. Således vores

in vivo

undersøgelser tyder på, at D-PDMP ikke reducerer tumor volumen ved at inducere apoptose i mus nyre.

Diskussion

De følgende bemærkninger kan drages fra vores nuværende undersøgelse implicerer rolle glycosphingolipider i renal tumor biologi. Først er der en stærk og statistisk signifikant korrelation mellem en forøgelse af muse renal tumorvolumen og en parallel stigning i massen af ​​LacCer. Sekund, inhibering af glycosphingolipid glycosyltransferase aktivitet, og især nedgangen i aktiviteten og massen af ​​LacCer syntase var korreleret med et fald i tumorvolumen. For det tredje, selv om D-PDMP vides at være en inhibitor af UGCG, kunne ikke hæve nyre niveauer af ceramid. Da ceramid er impliceret i apoptose, vore studier tyder på, at D-PDMP ikke reducerer tumorvolumen ved at inducere apoptose via ceramid vej hos mus nyre. Snarere, D-PDMP inhiberede en signaleringsvej-induceret af LacCer dermed bidrage til en inhibering af celleproliferation og tumorangiogenese. Kollektivt antyder disse undersøgelser, at hæmningen af ​​glycolipid glycosyltransferase kan inhibere proliferation /angiogenese i væv via mekanismer uafhængige af apoptose.

I den foreliggende undersøgelse, en -30-gange stigning i tumorvolumen i placebo muse nyre (sammenlignet med den for kontrol) blev modsvaret af et lige gange stigning i LacCer masse. Fodring D-PDMP markant reduceret tumorvolumen i form af faldende den enzymatiske aktivitet af LCS, LCS masse og følgelig LacCer masse og de angiogene proteiner, såsom p-AKT-1 og mTOR. I vores tidligere undersøgelser observerede vi, at anvendelsen af ​​siRNA for LCS

in vitro i humane endotelceller

[5] og

in vivo i muse glioblastoma

[22] og anvendelse af D- PDMP i denne undersøgelse kan reducere tumor volumen ved at afbøde angiogenese. Således målretning glycolipid syntese i almindelighed og LacCer syntase især [5], [22] er en hidtil ukendt fremgangsmåde til at afbøde nyrecancer i mus. Vi har også tidligere rapporteret, at L-PDMP, som aktiverer LacCer syntase i endotelceller også kan inducere angiogenensis på en dosis-afhængig måde [7] og også RENCA celleproliferation i den foreliggende undersøgelse (se bilag). Således aktivering /inaktivering af LacCer syntase af agonister /antagonister kan vel regulere angiogenese

in vitro

in vivo

.

Vores undersøgelser og andres [13] har vist, at D-PDMP er ikke-toksisk, når det gives i doser ti gange højere end den koncentration, der anvendes i den foreliggende undersøgelse. Kroppen vægt i denne undersøgelse var ikke forskellig i placebo vs. D-PDMP-behandlede mus. Tumoren vægttab ca. 50% i 3 MPK og 10 MPK fodret mus sammenlignet med placebo. Men når musene blev fodret højere mængder af D-PDMP; 25 og 50 MPK, var det ikke yderligere at reducere tumor volumen (data ikke vist). I en tidligere undersøgelse blev det vist, at T

1/2 af D-PDMP i mus blod er -50 min [13]. Det er derfor muligt, at ud over en tærskel på 10 MPK, er det meste af denne forbindelse fjernes hurtigt ved udskillelse og derfor ikke blev observeret yderligere reduktion i tumorvolumen. Tidligere har D-PDMP vid udstrækning blevet anvendt til at undersøge, hvilken rolle glycosphingolipid og relaterede glycosytransferases i arteriel glatmuskel-celleproliferation [1], [23], [24], sårheling [1], [23], [24],