PLoS ONE: miRNA Expression Underskrifter for blærekræft Revealed af Deep sekventering

Abstrakt

Baggrund

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små ikke-kodende RNA, der regulerer genekspression. De er aberrerende udtrykt i mange cancertyper. I denne undersøgelse, vi bestemt de genom-dækkende miRNA profiler i blære urothelial karcinom af dyb sekventering.

Metode /vigtigste resultater

Vi har registreret 656 differentielt udtrykte kendt menneskelige miRNA og miRNA antisense sekvenser (miRNA * s) i ni blære urotelial carcinoma patienter med dyb sekventering. Mange miRNA og miRNA * s var signifikant opreguleret eller nedreguleret i blære urothelial karcinom i forhold til matchede histologisk normal urothelium.

HSA-miR-96

var den mest markant opreguleres miRNA og

HSA-miR-490-5p

var mest markant nedreguleret en. Opreguleres miRNA var mere udbredt end nedreguleret dem.

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200b~429

,

HSA-miR-200c~141

HSA-miR-17~ 92

klynger signifikant opreguleret.

HSA-miR-143~145

klynge var signifikant nedreguleret.

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200a

,

HSA-miR-143

og

HSA-miR-195

blev evalueret af Real-Time qPCR i alt enoghalvtreds blære urotelial carcinoma patienter. De blev afvigende udtrykt i blæren urothelial karcinom i forhold til matchede histologisk normal urothelium (p 0,001 for hver miRNA).

Konklusioner /Betydning

Til dato er dette den første undersøgelse for at bestemme genom- brede miRNA udtryk mønstre i human blære urothelial karcinom af dyb sekventering. Vi fandt, at en samling af miRNA aberrant blev udtrykt i blæren urothelial carcinoma forhold til matchede histologisk normal urothelium, hvilket antyder, at de kan spille roller som onkogener eller tumorsuppressorer i udviklingen og /eller progression af denne cancer. Vores data giver nye indsigter i kræft biologi

Henvisning:. Han Y, Chen J, Zhao X, Liang C, Wang Y, Sun L, et al. (2011) MicroRNA Expression underskrifter blærekræft afsløret af Deep sekventering. PLoS ONE 6 (3): e18286. doi: 10,1371 /journal.pone.0018286

Redaktør: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Tyskland

Modtaget: 16. juli 2010; Accepteret: 2. marts, 2011; Udgivet: 28 Mar 2011

Copyright: © 2011 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National High Technology Research and Development Program Kina (863 Program, 2006AA02A302 og 2009AA022707) og Promotion Program for Shenzhen Key Laboratory, Shenzhen, Kina (CXB200903090055A), Bank of Clinical data for alvorlige sygdomme og biologiske prøver af Shenzhen (CXC201005260001A). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er en af ​​de mest udbredte maligniteter i verden. Omkring 357 tusind blære kræfttilfælde var nyligt diagnosticeret og 145.000 kræftrelaterede dødsfald blev anslået i 2002 [1]. Urothelial carcinoma i blæren, den mest almindelige form for histopatologisk blærekræft, har en række genetiske og fænotypiske karakteristika. Mange faktorer, såsom kromosomale anomalier, genetiske polymorfier, genetiske og epigenetiske ændringer, bidrager til tumorigenese og progression af urothelial karcinom i blæren [2].

MikroRNA’er (miRNA) er endogene, ikke-kodende RNA-molekyler på omkring 22 nukleotider langt, som regulerer genekspression [3]. De slutte sig til RNA-inducerede tavshed kompleks til at regulere deres målrettede messenger RNA (mRNA) ved at undertrykke mRNA oversættelse og /eller lede mRNA spaltning [4]. miRNA spiller en vigtig rolle i normal udvikling, cellevækst, differentiering og apoptose i pattedyr [5].

Mere end halvdelen miRNA gener er placeret i cancer-associerede genomiske regioner eller i skrøbelige steder [6]. Udtrykkes afvigende miRNA har vist sig at være forbundet med mange typer af kræft. Både tab og gevinster på miRNA-funktion bidrager til udvikling af kræft. miRNA virker som onkogener eller tumorsuppressorer [7]. Vigtigst, forskellige kræftformer, stadier eller differentiering stater har unikke miRNA udtryk profiler, hvilket tyder på, at miRNA kan fungere som nye biomarkører for kræft diagnose [8], [9].

Flere tidligere undersøgelser brugte miRNA microarrays med begrænset og varierede sonder at profilere miRNA udtryk i blærekræft, og deres resultater ikke altid indikerer konsistente resultater [10] – [13]. For bedre at forstå den rolle miRNA i blærekræft udvikling og progression, der kræves omfattende analyse af udtryk og overflod af miRNA i denne kræftform. Med den fordel af high-throughput dyb sekventering teknologi, kan genom-dækkende kræft miRNA kvantitativt og præcist bestemt. Her præsenteres de genom-dækkende miRNA profiler i ni par snap-frosne blære urothelial karcinom og matchet histologisk normal urothelium af dyb sekventering. Vi fandt, at en samling af miRNA afvigende blev udtrykt i blæren urothelial karcinom i forhold til matchede histologisk normal urothelium, hvoraf flere blev evalueret af Real-Time qPCR i alt enoghalvtreds blære urotelial carcinoma patienter.

Resultater

Oversigt over miRNA profiler

Kendte miRNA udtryk filer mellem blære urothelial karcinom og matches histologisk normal urothelium fra hver patient blev sammenlignet for at finde ud af de differentielt udtrykte miRNA. Udtrykket af miRNA i parrede prøver blev vist ved at beregne log

2Ratio. Procedurerne er vist nedenfor: (1) Normalisér ekspressionen af ​​miRNA i to prøver (tumor versus normal) for at få ekspressionen af ​​transkript pr million (TPM). Normaliseret udtryk = Faktisk miRNA tæller /Total optælling af ren læser * 1.000.000. (2) Beregn fold-change og p-værdi fra det normaliserede udtryk. Så Beregn log

2Ratio. Fold-change = log

2Ratio (tumor /normal). Vi bestemt 656 differentielt udtrykte kendt menneskelige miRNA og miRNA antisense sekvenser (miRNA * s) i miRBase14.0 i ni blære urothelial carcinom patienter (tabel S1).

Vi identificerede et stort antal miRNA og miRNA * s at blev signicantly opreguleres eller nedreguleres i disse patienter og kunne skelne blære urothelial karcinom fra matchet normal urothelium.

HSA-miR-96 Hotel (log

2Ratio = 4,664328) var den mest markant opreguleres miRNA og

HSA-miR-490-5p

(log

2Ratio = -5,79794) var den mest signifikant nedreguleret en (tabel 1). Udvalgte differentielt udtrykte miRNA blev valideret af Real-Time qPCR. Real-Time qPCR fund korrelerede godt med sekventering analyse. Sammenligningen mellem Real-Time qPCR resultater og dybe sekventeringsresultaterne er vist i figur 1. De tællinger af opreguleres og nedreguleret miRNA varieres på forskellige patienter. Opreguleres miRNA var mere udbredt end nedreguleret dem (Figur 2). Desuden har vi identificeret en bemærkelsesværdig forskel i ekspressionsniveauerne mellem miRNA og parret miRNA *. Ekspressionsniveauerne af miRNA var normalt højere end for parrede miRNA * s (figur 3).

Til sammenligning mellem dybe sekventering data og real-time qPCR resultater,

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200a

,

HSA-miR-143

og

HSA-miR-195

bestemt skal udtrykkes forskelligt i blæren urothelial karcinom i forhold til matchede histologisk normal urothelium i ni patienter med dyb sekventering valideret ved anvendelse Real-Time qPCR. Højden af ​​søjlerne i diagrammet repræsenterer log-transformerede mediane fold ændringer (tumor /normal) i udtryk på tværs af de ni patienter for hver af de fem miRNA valideret; søjlerne repræsenterer standardafvigelser. De valideringsresultater af de fem miRNA viste, at de dybe sekventering data korrelerede godt med de Real-Time qPCR resultater.

Mange miRNA blev bestemt at være signifikant opreguleret eller nedreguleret i blære urothelial karcinom i forhold til matchede histologisk normal urothelium i ni patienter med dyb sekventering. Tællingerne af opreguleres og nedreguleres miRNA varierede på tværs af de ni patienter. I otte ud af ni blære urothelial carcinompatienter opregulerede miRNA var mere udbredt end nedreguleret dem. Kun i én patient (Patient nr B13), opreguleres miRNA var mindre udbredt end nedreguleret dem.

En samling af miRNA og parrede miRNA antisense sekvenser (miRNA * s) var fast besluttet på at blive udtrykt i ni blære urotelial carcinoma patienter med dyb sekventering. Vi identificerede en bemærkelsesværdig forskel i udtryk mellem miRNA og parret miRNA *. Udtrykket af miRNA /miRNA * par er vist i scatter plot med logaritme koordinatsystem; hvert punkt repræsenterer ekspression af et miRNA /miRNA * par. I de fleste miRNA /miRNA * parvis ekspressionsniveauet af miRNA var højere end for parrede miRNA *. I et lille antal miRNA /miRNA * par, miRNA var mindre rigelige end parret miRNA *.

Udover de kendte miRNA og miRNA * s, blev påvist 92 nye miRNA sekvens kandidater i vores undersøgelse (tabel S2). De fleste af dem blev udtrykt i meget lave niveauer og kun i visse prøver. Deres ekspressionsmønstre og mulige roller brug for yderligere undersøgelse.

Angivelse af klynger miRNA

Vi fandt, at en samling af deregulerede miRNA klynger blev udtrykt.

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200b~429

,

HSA-miR-200c~141

HSA-miR-17~ 92

klynger signifikant opreguleret.

HSA-miR-143~145

klynge var signifikant nedreguleret.

Real-Time qPCR validering

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200a

,

HSA-miR-143

og

HSA-miR-195

blev evalueret af Real- Time qPCR i alt enoghalvtreds blære urotelial carcinoma patienter.

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

og

HSA-miR-200a

blev overudtrykt

HSA-MIR-143

og

HSA-miR-195

blev underexpressed i blæren urothelial karcinom i forhold til matchede histologisk normal urothelium (p 0,001 for hver miRNA). (tabel S3)

diskussion

udviklingen af high throughput dyb sekventering teknologi giver mulighed for en nær komplet overblik over miRNA profiler. Deep sekventering teknologi har potentiale til at identificere hidtil ukendte vævsspecifikke miRNA [14]. Den bestemmer den absolutte overflod af miRNA og kan opdage nye miRNA, der er blevet savnet af fælles kloning og sekventering metoder [15]. Deep sekventering teknologi er overlegen i forhold til microarrays der bestemmer begrænsede kendte miRNA og normalt ikke indeholde den fulde liste over kendte miRNA antisense sekvenser. Indtil nu dybe sekventering teknologi har været den gyldne standard for den omfattende analyse af miRNA.

Undersøgelser har vist, at miRNA kan bruges som biomarkører for forskellige typer af kræft [8], [9]. Nogle miRNA som biomarkører er i stand til at spore væv oprindelsesland kræft af ukendt primær oprindelse [16]. Specifikke miRNA signaturer er bedre end mRNA signaturer forudsige prognosen for lungecancer [17].

I dette arbejde, vi brugte dyb sekventering teknologi til at bestemme de omfattende miRNA udtryk profiler i ni par snap-frosne blære urotelial carcinom og matches histologisk normal urothelium. Mange miRNA var signifikant opreguleret eller nedreguleret i blære urothelial karcinom i forhold til matchede histologisk normal urothelium hos disse patienter, hvilket tyder på, at disse afvigende udtrykte miRNA kan spille roller i disse kræftformer. Den mest markant opreguleret miRNA

HSA-MIR-96

er blevet rapporteret at være onkogene [18], men den rolle, mest markant nedreguleret miRNA

HSA-MIR-490-5p

er ikke klar. En masse af miRNA * s blev væsentligt dereguleret i blæren urothelial carcinoma forhold til matchede histologisk normal urothelium i denne undersøgelse. Nogle miRNA * s kan slutte sig til RNA-inducerede lyddæmpning kompleks og har hæmmende funktion [19].

Mange deregulerede miRNA klynger blev udtrykt i henhold til vores dybe sekventering analyse. Vi fandt, at

HSA-miR-183

klynge blev overudtrykt i blærekræft. Denne klynge består af

HSA-miR-96

,

HSA-miR-182

og

HSA-miR-183

og er placeret på kromosom 7. Disse tre miRNA er opreguleret i prostatacarcinom [18]. Den co-ekspression mønster af miRNA i denne klynge i kræft antyder, at de kan spille roller sammen.

HSA-miR-200

familie af miRNA (

HSA-miR-200a /b /c

,

HSA-miR-141

og

HSA-mir -429

) blev overudtrykt i blærekræft.

HSA-miR-200b~429

klynge er placeret på kromosom 1 og

HSA-miR-200c~141

klynge er placeret på kromosom 12. coekspression af disse klynger tyder på, at de kan blive kontrolleret af fælles faktorer og spille roller sammen.

HSA-miR-200b

,

HSA-miR-200a

HSA-miR-429

miRNA er kodet af en enkelt polycistronisk udskrift og negativt reguleret af ZEB1 og SIP1 [20]. TGFß 1 kan nedregulere

HSA-miR-200

familie fører til opregulering af ZEB1 og ZEB2 [21].

HSA-miR-200

familie er også overudtrykt i æggestokkene og livmoderhalskræft [22] – [24], hvilket tyder på denne miRNA familie er onkogene i seveval kræftformer.

HSA-miR-17-92

klynge er placeret på kromosom 13 og fungerer som onkogener. E2F1 og E2F3 direkte kan aktivere transkription af disse miRNA [25].

HSA-miR-143~145

klynge er placeret på kromosom 5 og nedreguleret i mange kræftformer, herunder blære kræft og deres cellelinjer [13], [26]. Vores resultater leveres mere dokumentation til støtte, at

HSA-miR-143~145

klynge er tumor-undertrykkende i blærekræft.

I denne undersøgelse, Real-Time qPCR blev udført for at vurdere ekspressionsmønstre af

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200a

,

HSA-miR-143

og

HSA-miR-195

i alt enoghalvtreds blære urotelial carcinoma patienter.

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

og

HSA-miR-200a

blev overudtrykt

HSA-MIR-143

og

HSA-miR-195

blev underexpressed i blæren urothelial karcinom i forhold til matchede histologisk normal urothelium. Disse resultater understøttes vores dybe sekventering analyse.

Vi sammenlignede vores resultater til offentliggjorte data til seacrch om uafhængige eksterne valideringer.

HSA-miR-182

,

HSA-MIR-183

og

HSA-miR-224

opreguleres og

HSA-miR-1

,

HSA-miR-101

,

HSA-miR-143

,

HSA-miR-145

,

HSA-miR-127

og

HSA-mIR-29c

nedjusteres i blæren urothelial carcinoma forhold til matchede histologisk normal urothelium [27]. Vores dybe sekventering resultater var stort set i overensstemmelse med disse resultater. Den opregulering af

HSA-MIR-182

HSA-miR-183

og nedregulering af

HSA-miR-143

blev fundet i blæren urothelial karcinom i forhold til matchede histologisk normal urothelium i vores Real-Time qPCR evaluering. Profilering af miRNA i 106 blære kræft og 11 normale prøver ved anvendelse mikroarrays har afsløret, at et sæt af miRNA opreguleres eller nedreguleres i blære kræft [13]. Af disse deregulerede miRNA,

HSA-miR-21

,

HSA-miR-20a

,

HSA-miR-184

,

HSA-miR-26a

,

HSA-miR-125b

,

HSA-miR-29a

,

HSA-miR-29c

og så på aksjer lignende ekspressionsmønstre med vores resultater.

HSA-miR-133a

,

HSA-miR-133b

HSA-miR-195

er nedreguleres i blære kræft [28]. Disse miRNA viste nedregulering i vores sekventering analyse og

HSA-miR-195

nedregulering blev comfirmed af Real-Time qPCR i denne undersøgelse.

Vi brugte matchet tilstødende histologisk normal urothelium som kontrol i vores undersøgelse . Det er blevet rapporteret, at udvalgte prøver af histologisk normale urothelium fra blærecancerpatienter har genetiske ændringer [29]. Nogle kromosomafvigelser deles af både en tumor og en histologisk normalt udseende væv støder op til tumoren kan forårsage lignende ændringer af miRNA ekspression. For at kompensere for denne svaghed, vi sammenlignet vores resultater til flere offentliggjorte rapporter ved hjælp urothelium fra raske som kontrol [10], [13], [28]. En stor samling af fund var sammenlignelige mellem deres og vores. Vores resultater var også i overensstemmelse med de papirer hjælp matchet tilstødende histologisk normal urothelium som kontrol vedrørende en masse miRNA [26], [27]. Overlappende fund mellem offentliggjorte data og vores resultater er vist i tabel 2.

Så vidt vi ved, er dette den første genom-dækkende profilering af miRNA i human blærekræft ved dyb sekventering. Vi fandt, at en samling af liberaliserede miRNA afvigende blev udtrykt i blæren urothelial karcinom i forhold til matchede histologisk normal urothelium, hvilket tyder på, at de kunne spille roller som onkogener eller tumor undertrykkere i udvikling og /eller progression af denne kræftform. Vores data giver nye indsigter i kræft biologi. vil være behov for mere arbejde at bestemme de potentielle roller miRNA som diagnostiske biomarkører og kandidat terapeutiske mål for blærekræft.

Materialer og metoder

Patientprøver

Skriftligt informeret samtykke var opnået fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board of Peking University Shenzhen Hospital. Enoghalvtreds patienter med blære urothelial carcinoma som modtog delvis eller radikal cystektomi blev inkluderet i undersøgelsen. Af disse patienter blev ni brugt til indledende dyb sekventering analyse af miRNA og toogfyrre blev brugt til en ekstra vurdering. Blære urothelial karcinom blev diagnosticeret histopatologisk. Blære urothelial carcinoma og matches histologisk normale urothelium fra hvert individ blev lynfrosset i flydende nitrogen immmediately efter resektion. Detaljeret information af ni blære urothelial carcinoma patienter i dyb sekventering sæt er sammenfattet i tabel S4.

RNA Extraction

Når andelen af ​​cancerceller i et vævssnit var større end 80%, den frosne blok blev underkastet RNA-ekstraktion. Totalt RNA blev ekstraheret fra enoghalvtreds par snap-frosset blære urothelial carcinoma og matches histologisk normal urothelium hjælp TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens protokol. RNA integritet blev evalueret ved Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA).

miRNA sekventering og analyse

Atten små RNA biblioteker fremstillet fra ni par snap-frosset blære urotelial karcinom og matches histologisk normal urothelium blev bygget, forstærket og sekventeret. Totalt RNA blev anvendt til miRNA sekventering. Efter 5’adapter og 3’adapter blev ligeret til små RNA’er, omvendt transkription blev udført. Derefter PCR blev udført og PCR-produkter blev oprenset. Endelig blev miRNA biblioteker konstrueret og sekventeret ved Illumina Cluster Station og Genome Analyser (Illumina Inc, CA, USA) ved Beijing Genomics Institute i Shenzhen i overensstemmelse med producentens protokol.

Lav kvalitet læser blev fjernet og adapter sekvenser blev præcist klippet ved hjælp af en dynamisk programmering algoritme før yderligere analyse. Efter fjernelse af to eksemplarer læser, de resterende læser på mindst 18 nt blev kortlagt til et menneske henvisning genom (hg19) ved hjælp af SOAP V2.0 [30]. For at identificere sekvens tags stammer fra kodende exoner, gentagelser, rRNA, tRNA, snRNA, og snoRNA, UCSC RefGene, RepeatMasker, NCBI Refseq data og ncRNA annotationer kompileret fra NCBI Genbank data (https://www.ncbi.nih.gov ) blev anvendt. At identificere nye miRNA gener blev alle hårnål-lignende RNA-strukturer, der omfatter små RNA-tags identificeres ved hjælp MIREAP (https://sourceforge.net/projects/mireap).

Real-Time qPCR bekræftelse og statistiske metoder

Tre overudtrykt (

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

og

HSA-miR-200a

) og to underexpressed miRNA (

HSA-miR-143

og

HSA-miR-195

) blev evalueret i alle de patienter, der indgik i denne undersøgelse. Disse miRNA blev udvalgt, fordi de var betydeligt dereguleret i den indledende dybe sequecing analyse. snRNA U6 blev anvendt som den endogene kontrol. Real-Time qPCR blev udført ved hjælp af All-in-One ™ miRNA QRT-PCR Detection Kit (GeneCopoiea Inc, Rockville, MD, USA). 10 ug totalt RNA blev omdannet til cDNA ifølge fabrikantens protokol. PCR blev udført i et totalt reaktionsvolumen på 20 pi, herunder 10 pi 2xAll-in-One ™ qPCR Mix, 2 pi Universal Adapter PCR Primer (2 uM), 2 pi af All-in-One ™ qPCR Primer (2 uM), 2 pi af First-Strand cDNA (fortyndet i 1:05), 50xROX reference Dye 0,4 pi og 3,6 pi dobbelt-destilleret vand. Reaktionerne blev udført og analyseret under anvendelse af ABI PRISM 7000 Fluorescent Kvantitativ PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR reaktioner blev udført for cancer og normale cDNA i tre eksemplarer for hvert sæt. De cykliseringsparametre for PCR var som følger: (1) et første denatureringstrin på 15 minutter ved 95 ° C; (2) 40 cykler, med 1 cyklus bestående af 15 sekunder ved 95 ° C, 20 s ved 55 ° C og 30 sekunder ved 70 ° C. De katalognumre af All-in-One ™ miRNA qPCR Primere er anført i tabel S5. Medianen i hvert tre eksemplarer blev anvendt til at beregne relative miRNA koncentrationer (ACt = Ct

medianmiRNA-Ct

mediansnRNAU6). Expression fold ændringer blev beregnet ved anvendelse 2

-ΔΔCt metoder [31]. De miRNA udtryk forskelle mellem kræft og kontrol blev analyseret ved hjælp af Students

t

test inden SPSS (version 16.0 SPSS Inc.). En værdi på p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Støtte oplysninger

tabel S1..

miRNA blev differentielt udtrykt mellem blære urothelial karcinom og matches histologisk normal urothelium.

doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s001

(XLS)

tabel S2.

blev opdaget Sekvenserne af nye miRNA kandidater i blæren urothelial karcinom og matches histologisk normal urothelium.

doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s002

(XLS)

tabel S3.

Delt-Ct-værdier for Real-Time qPCR i enoghalvtreds blære urotelial karcinom patienter.

doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s003

(DOC)

Tabel S4.

Patientinformation i dyb sekventering sæt.

doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s004

(DOC)

tabel S5.

Primer katalog.

doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s005

(DOC)

Tak

Vi takker alle de donorer, der deltog i dette program, alle vores kolleger, der har bidraget til opførelsen af ​​Urologic Tissue Bank på Peking University Shenzhen Hospital og alle dem, der er afsat til den dybe sekventering service på Beijing Genomics Institute i Shenzhen.