PLoS ONE: Rekombinant human sur sphingomyelinase som adjuvans til Sorafenib Behandling af Experimental Liver Cancer

Abstrakt

Baggrund

hepatocellulært carcinom (HCC) er den mest almindelige form for leverkræft og den tredje hyppigste årsag til kræft dødsfald på verdensplan. Den eneste godkendte systemisk behandling for inoperabel HCC er den mundtlige kinase inhibitor, sorafenib. Rekombinant human sur sphingomyelinase (rhASM), der hydrolyserer sphingomyelin til ceramid, er en orphan drug under udvikling til behandling af type B Niemann-Picks sygdom (NPD). På grund af den hepatotropisk karakter rhASM og dets evne til at generere pro-apoptotisk ceramid, denne undersøgelse evaluerede brugen af ​​rhASM som adjuvans behandling med sorafenib i forsøgsmodeller af HCC.

Metodologi /vigtigste resultater

In vitro

, rhASM /sorafenib behandling reducerede levedygtighed Huh7 liver kræftceller mere end sorafenib.

In vivo

, ved anvendelse af en subkutan Huh7 tumormodel, blev mus overlevelse steg og proliferation i tumorerne faldt til en lignende grad i både sorafenib og rhASM /sorafenib behandlingsgrupper. Men kombineret rhASM /sorafenib behandling betydeligt nedsat tumor volumen, øget tumor nekrose og nedsat tumor blodkar tæthed i forhold til sorafenib. Disse resultater blev opnået til trods for dårlig levering af rhASM til tumorerne. En anden (ortotopisk) model af Huh7 tumorer også blev etableret, men beskeden ASM aktivitet blev ligeledes påvist i disse tumorer sammenlignet med raske muselevere. Vigtigt er det, blev der ikke kronisk levertoksicitet eller vægttab observeret fra rhASM terapi i begge model.

Konklusioner /Betydning

rhASM /sorafenib kombination udviste en synergistisk effekt på reduktion af tumor volumen og blodkar tæthed i Huh7 xenotransplantater trods beskeden aktivitet af rhASM i disse tumorer. Ingen betydelige stigninger i overlevelse blev observeret fra rhASM /sorafenib behandling. Den dårlige levering af rhASM til Huh7 tumorer kan skyldes, i det mindste delvis, til lav ekspression af mannosereceptorer. Sikkerheden og effekten af ​​denne tilgang, sammen med de nye resultater vedrørende enzym målretning, fortjener yderligere undersøgelse

Henvisning:. Savić R, han X, Fiel I, Schuchman EH (2013) rekombinant humant sur sphingomyelinase som en adjuvans til Sorafenib Behandling af Experimental leverkræft. PLoS ONE 8 (5): e65620. doi: 10,1371 /journal.pone.0065620

Redaktør: Alexander Arlt, Christian-Albrechts-Universitetet Kiel, Tyskland

Modtaget: Februar 3, 2012; Accepteret: Maj 2, 2013; Udgivet: 28 maj 2013

Copyright: © 2013 Savić et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. NIH HD28607 . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

det seneste skøn fra American cancer Society for 2013 er, at omkring 30.640 mennesker ville blive diagnosticeret med primær lever og galdegang kræft i USA, med omkring 21.670 (71%) kræftrelaterede dødsfald. HCC er den mest almindelige (-90%) form for leverkræft, ofte diagnosticeret på fremskredne stadier af sygdommen [1]. HCC er et genetisk heterogent malignitet, hvor talrige deregulerede signaleringsveje føre til forhøjet proliferation og angiogenese, herunder RAF /MEK /ERK, PI3K /AKT /mTOR, WNT /β-catenin, IGF, og HGF /c-MET [2]. Indtil for nylig har behandlingsmuligheder for avanceret /inoperabel HCC været relativt ineffektive og kompliceres af den underliggende hepatitis og skrumpelever. I 2007 godkendte FDA en mundtlig lægemiddel til inoperabel HCC – sorafenib, et lille molekyle multikinasehæmmer, med en

in vitro

aktivitet mod snesevis af serin /threonin (f.eks RAF) og tyrosinkinaser (f.eks VEGFR) i tumorceller og kar [3], [4]. I pivotale kliniske studier, sorafenib gav 2,8 måneder bedre overlevelse i behandlingsgruppen (10,7 måneder median) sammenlignet med placebo (7,9 måneder), der danner grundlag for godkendelse af FDA [3], [5]. Men trods den påviste kliniske effektivitet, nogle patienter med fremskreden sygdom mislykkes, til at reagere på sorafenib og dem, der har en begrænset fordel [5]. Derfor har undersøgelser alternative /støttende medicinske behandlingsmetoder været fart [6].

I modsætning til HCC, NPD omfatter en familie af ultra sjældne monogene sygdomme med kendte genetiske og biokemiske abnormiteter. For eksempel mutationer i

SMPD1

gen resultat i mangel af ASM aktivitet, der fører til ophobning af sphingomyelin i lysosomer og andre cellulære rum. Type A NPD er den neurodegenerative, infantile form for ASM-mangel, sædvanligvis fatal inden for de første 2-3 år af livet. Derimod mangler Type B NPD neurologisk involvering og overlevelse kan være i slutningen af ​​barndommen eller voksenalderen, selvom de ramte personer ofte udviser progressiv hepatosplenomegali og respiratorisk sygdom [7]. Enzymsubstitutionsterapi med eksogen rhASM modtog orphan drug status for type B NPD i 2000 [8], og er med succes blevet testet i en fase I klinisk forsøg hos voksne type B NPD patienter (clinicaltrials.gov identifier NCT00410566). En fase Ib gentagen dosering undersøgelse er i gang. Hydrolysen af ​​sphingomyelin ved rhASM producerer en meget bioaktive og cytocidal lipid, ceramid, som er i stand til at inducere tumor suppression [9]. Det er kendt, at forøgelse af ceramid ved celleoverfladen reorganiserer cellemembranen signalering platforme, sandsynligvis inducere de nedstrøms cellulære ændringer, men de nøjagtige mekanismer bag disse virkninger er fortsat et aktivt område af undersøgelse [9].

Due til de pro-death virkninger af ceramid, har cancerceller udviklet flere forsvarsmekanismer for at overvinde denne lipid, herunder reduceret produktion og /eller forøget clearance, eller forhøjet produktion af det modvirke pro-overlevelse lipid, sphingosin-1-phosphat (S1 P). Disse forsvarsmekanismer kan også bidrage til sphingolipid-medieret resistens narkotika [10], [11]. Følgelig lægemiddelbehandlinger målrettet sphingolipid metabolisme, herunder overproduktion af ceramid til at dræbe tumorceller eller reducere angiogenese, repræsenterer attraktive tilgange til kræftbehandling. Mange af disse nye sphingolipid narkotika behandlingsformer er blevet evalueret i cellekultur og /eller dyremodeller, og er fokuseret på direkte distribution af ikke-fysiologiske ceramider [12] til tumorer, eller administration af hæmmere af ceramidases eller sphingosin kinaser er ansvarlige for syntesen af S1P [13]. Da rhASM er a) selektivt optages af leveren efter systemisk administration, b) meget effektiv i at generere ceramid, og c) til rådighed i en klinisk kvalitet formulering har vi fokuseret på at undersøge potentialet i rhASM som hjælpestof til sorafenib behandling i eksperimentel leveren kræft.

Tidligere viste vi, at rhASM i kombination med bestråling havde en dybtgående effekt på melanom

in vivo.

at rekapitulere denne effekt

in vitro

medierne er nødvendige for at være syrnet (pH 6,5), en tilstand der efterligner mikromiljøet af tumoren og begunstiger ASM aktivitet [14]. Vi viste ligeledes, at rhASM alene (1 uM) havde ingen reproducerbar virkning på levedygtigheden af ​​60 cancercellelinier der omfatter leukæmi, ikke-småcellet lunge-, colon-, CNS-, melanom, ovarie, nyre-, prostata- og brysttumorer, hvilket antyder, at

in vivo

mikromiljø tumoren var vigtigt for de observerede virkninger [15], [16].

i betragtning af hepatotropisk natur rhASM, vi hypotese, at leverkræft kan være en passende model, hvor til næste test effekten af ​​rhASM som et adjuvans til standard for pleje sorafenib behandling. Her viser vi, at kombinationsbehandling med højdosis rhASM (25 mg /kg hver tre dage (q.72 h), intraperitonealt (ip)) og sorafenib (30 mg /kg hver dag (qd), sondeernæring) reducerer tumor volumen Huh7 subkutane xenotransplantater

in vivo

reducerer blodkar tæthed, og resulterer i øget nekrose i tumorer. Disse virkninger blev opnået trods begrænset levering af enzymet til de subkutane tumorer. Kombinationsbehandlingen var veltolereret i BALB /C-mus uden behandling dødsfald, uden tab af vægt og med normal leverfunktion. Vi har også etableret en ortotopisk model af Huh7 tumorer i lever fra SCID /beige mus, og overraskende fundet tilsvarende dårlig levering af rhASM til disse tumorer i forhold til sund lever. Yderligere undersøgelse foreslog, at lave udtryk for mannosereceptorer i Huh7 tumorer delvist kan forklare denne effekt.

Resultater

Deregulering af sphingolipid signalering i human hepatocellulært carcinom

Sammenligning af normale lever til hepatocellulære carcinomer, der bruger fire uafhængige sæt prøver til rådighed i Oncomine database, afslørede signifikant nedsatte niveauer af ASM (

SMPD1

) og S1P fosfatase (

SGPP1

) mRNA-ekspression (tabel 1).

SMPD1

gen rangeret blandt de top 1, 9, 17 og 11% af undertrykte gener i Mas [17], Chen [18], Wurmbach [19], og Roessler lever 2 datasæt [20]. Tilsvarende

SGPP1

genet blev rangeret i top 4, 5 og 7% undertrykte gener i 3 ud af 4 datasæt [17], [18], [19]. S1P er en meget bioaktivt sphingolipid der fremmer celleproliferation [11], og S1P phosphatase er det enzym der kræves for at hydrolysere phosphatgruppen fra S1P (figur 1A). Undertrykkelse af disse to gener /enzymer vil derfor begunstiger lav ceramid og høje S1P niveauer, sandsynligvis fører til celleproliferation og /eller medikamentresistens.

(A) ASM driver produktionen af ​​pro-apoptotisk ceramid gennem hydrolyse af sphingomyelin, som omdannes til sphingosin ved ceramidases såsom syre ceramidase (AC). Sphingosinkinase 1 (SPHK1) phosphorylerer derpå sphingosin til sphingosin-1-phosphat (S1P), som omdannes tilbage til sphingosin af S1P-phosphatase (SGPP1) eller metaboliseres af S1P lyase 1 (SGPL1). (B) Virkning af ASM i Hep3B celler var signifikant højere (ANOVA, df (2,6), F = 48.49, s 0,001) end i Huh7 (Tukey post hoc test p 0,001, **) og HepG2-celler (Tukeys post hoc test p 0,001). AC var ens på tværs af alle cellelinjer, men HepG2-celler havde signifikant højere SPHK1 aktivitet (ANOVA, df (2,6), F = 8,68, p = 0,017, *) end Huh7 (Tukey post hoc test, p = 0,041) og Hep3B (Tukey indlæg hoc test, p = 0,019). (C) Huh7 celler blev udvalgt til yderligere undersøgelser, og deres levedygtighed testet ved pH 6,5 (se fremgangsmåder) i nærvær af 500 ug /ml rhASM, 3 pM sorafenib, eller kombinationen af ​​rhASM og sorafenib efter 48 timer. Sorafenib (Dunnetts post hoc test p 0,001, **) og kombineret rhASM /sorafenib (Dunnetts post hoc test p 0,001, **) behandlede celler havde signifikant lavere levedygtighed end kontrol celler (ANOVA, df (3,38), F = 26,47, p 0,001). rhASM var ikke signifikant forskellig fra kontrol (p = 0,118). Den rhASM og sorafenib kombination udstillet signifikant lavere levedygtighed sammenlignet med sorafenib alene (t-test, en-sidet, * p 0,05, ** p 0,001).

Udvælgelse af et menneske hepatomacellelinie og

in vitro

effekt af rhASM på spredning

Vi undersøgte næste baseline aktiviteter tre centrale enzymer involveret i sphingolipid stofskifte – ASM, syre ceramidase (AC), og sphingosinkinase 1 (SPHK1) – i tre almindeligt anvendte humane hepatomaceller cellelinier: HepG2, Huh7 og Hep3B. Hep3B celler havde den højeste baseline ASM aktivitet, mens SPHK1 aktivitet var højest i HepG2-celler (figur 1b). Alle tre celler havde sammenlignelig AC-aktivitet. Baseret på disse resultater, vi valgte Huh7 celler til yderligere eksperimenter, eftersom de grundlæggende aktiviteter var moderat og mellem dem af HepG2 og Hep3B. Desuden Huh7 subkutan muse-xenotransplantater er en veletableret model, der anvendes til at vurdere forskellige eksperimentelle lægemiddelbehandlinger for HCC [21], [22], [23]. Virkningen af ​​rhASM blev undersøgt i Huh7-celler ved forbehandling (2 timer) med rhASM i et syrnet medium (6,5) – efterligne tumormikromiljøet pH – efterfulgt af inkubation i 46 timer ved pH 7,4. blev ikke observeret nogen signifikant effekt af rhASM behandling alene på levedygtigheden af ​​Huh7 celler i løbet af de 48 timer, som blev observeret tidligere i melanom celler [14]. I modsætning hertil sorafenib førte til en betydelig reduktion i spredning, som i væsentlig grad blev forbedret i celler udsat for rhASM /sorafenib kombination (figur 1C). Disse data understøttede endvidere opfattelsen af, at rhASM alene har ringe effekt på tumorceller, og kan være nyttig som en adjuvant behandling af sorafenib [14].

Reduceret tumorvolumen og øget overlevelse i mus behandlet med rhASM og sorafenib

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​rhASM /sorafenib kombinationsbehandling

in vivo

hjælp Huh7 subkutane xenotransplantattumorer i mus. Dyr blev randomiseret i 4 grupper behandlet med sorafenib (n = 10), rhASM (n = 13), rhASM /sorafenib (n = 14) eller vehikel (n = 9). Som i de

in vitro

eksperimenter, rhASM behandling alene ikke havde nogen gavnlig effekt

in vivo

(median overlevelse 10 dage, tumor volumen 925 ± 80 mm

3 på dag 11) (data ikke vist). Men sammenlignet med bærer, var væsentligt lavere tumorvolumener målt i rhASM /sorafenib gruppe på dag 8 og 11. Også på dag 11 reduktionen af ​​tumorvolumen observeret i kombination var væsentligt lavere end i mus behandlet med sorafenib alene ( Figur 2A). Overlevelsen af ​​mus var signifikant større i både sorafenib (13 dage) og kombinationen behandlede mus (19 dage) sammenlignet med vehikel (11 dage) (figur 2B). Selv om der var en tendens til forbedring, blev der ikke observeret signifikante overlevelse forskelle mellem de to behandlingsgrupper. Af note imidlertid to dyr i rhASM /sorafenib kombination gruppe havde tumorer 1.000 mm

3 og overlevede ud over de 5 uger. Disse mus blev aflivet på dag 43 som deres tumorvolumener forblev forholdsvis stabilt (132 mm

3 (mus ID # 452) og 267 mm

3 (mus ID # 443) på tidspunktet for aflivning.

(A) middelværdien tumorvolumen hos mus behandlet med rhASM og sorafenib var signifikant mindre end for kontrolmus på dag 8 (Dunnetts post-hoc test p = 0,035; ANOVA df (2,30), F = 3,24, p = 0,053) På dag 11 både sorafenib (Dunnetts post hoc test p = 0,034) og kombineret rhASM og sorafenib (Dunnetts post hoc test p 0,001) behandlede mus havde mindre tumorer end kontrol mus (ANOVA, df (2,27)., F = 12,22, p. . 0,001) den rhASM /sorafenib kombination gruppe havde også signifikant mindre tumorer end sorafenib gruppen på dag 11 (t = 2,32, df (20), p = 0,031) (B) signifikant længere median overlevelse ( 13 dage) af sorafenib behandlede mus (chi-square 5,02, df (1), p = 0,025) og kombinerede rhASM /sorafenib behandlede mus (19 dage) (chi-square 14,57, df (1), s 0,001) blev observeret sammenlignet med kontrol (11 dage). To mus i rhASM /sorafenib gruppe levet over undersøgelsen 5-ugers periode, og blev til sidst aflivet på dag 43 (tumorvolumen 132 mm

3, 267 mm

3). *, # P 0,05, ** p. 0,001

Reduceret proliferation og blodkar tæthed og øget celledød i tumorer fra kombinerede rhASM /sorafenib behandlede mus

På molekylært niveau, antallet af celler positive for Ki67 proliferationsmarkør blev signifikant reduceret i både sorafenib og rhASM /sorafenib behandlingsgrupperne i et tilsvarende omfang (figur 3A). Men nekrose blev øget betydeligt i den kombinerede rhASM /sorafenib behandlede mus (figur 3B). For at undersøge dette fund yderligere, vi undersøgte dernæst vaskularisering af tumorer. Antallet af blodkar farvet med anti-αSMA var signifikant lavere i tumorer fra både sorafenib (6,9 ± 0,5) og rhASM /sorafenib (5,5 ± 0,4) behandlede mus sammenlignet med kontrol (9 ± 0,6). Vigtigt er det, at antallet af anti-αSMA positive blodkar var signifikant lavere i rhASM /sorafenib end i sorafenib behandlede mus (p 0,001). Lignende resultater blev opnået ved anti-CD34-farvning, hvor rhASM /sorafenib (5,3 ± 0,4) var signifikant lavere end sorafenib alene (7,5 ± 0,4), og begge var lavere end kontrollen (11,6 ± 0,9). Både anti-αSMA og anti-CD34 tillod selektiv farvning af blodkar i paraffin indlejret tumorsnit, som afbildet i fig 3 E, F. De rhASM /sorafenib lang overlevende mus (ID # 452 og ID # 443) var inden for området af målinger til kombinationen gruppen enten ved hjælp af analyserne ovenfor.

(A) Gennemsnitlig antal Ki67 positive celler i tumorer fra mus behandlet med sorafenib (Dunnetts post-hoc p 0,005) og med rhASM /sorafenib kombination (Dunnetts post-hoc p 0,001) var signifikant lavere end køretøj (ANOVA df (2,30), F = 14,63, p 0,001). blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem Ki67 farvning i tumorer fra sorafenib og rhASM /sorafenib behandlede mus (t = 1,19, df 22, p = 0,249). (B) Nekrose blev signifikant forøget (ANOVA, df (2,30), F = 3,66, p = 0,038) i rhASM /sorafenib behandlede mus (Dunnetts post hoc kontrol, p = 0,043) sammenlignet med vehikelbehandlede mus, mens sorafenib behandlede mus var ikke forskellig fra kontrol (Dunnetts post hoc kontrol, p = 0,760). Nekrose i rhASM /sorafenib behandlede mus var signifikant større end i mus behandlet med sorafenib alene (t = -2,39, df (22), p = 0,26). (C) Anti-αSMA blodkar farvning afslørede en signifikant lavere antal fartøjer (ANOVA df (2,30), F = 12,57, p 0,005) i sorafenib (Dunnetts post hoc test p = 0,020) og rhASM /sorafenib behandlede mus (Dunnetts post hoc test p 0,001). Den rhASM /sorafenib gruppe havde også signifikant mindre αSMA blodkar end sorafenib gruppen (t = 2,25, df (22), p = 0,031). (D) Anti-CD34 blodkar farvning bekræftede αSMA resultater, som viser en signifikant lavere antal fartøjer (ANOVA df (2,30), F = 32,07, p 0,001) i sorafenib (Dunnetts post hoc test p 0,001) og rhASM /sorafenib behandlede mus (Dunnetts post hoc test p 0,001). Den kombinerede rhASM /sorafenib gruppe havde signifikant færre CD-34 positive blodkar end sorafenib gruppen (t = 3,56, df (22), p = 0,002). Selektiv farvning af blodkar i paraffin indlejret tumor snit farvet er vist med anti- αSMA (E) og anti-CD34-markører (F). * P 0,05, ** p. 0,001

Analysen af ​​ceramidniveauer i tumorer, som viste ingen forskel mellem grupperne (data ikke vist), blev udført som et endepunkt måling ved afslutningen af undersøgelsen (op til 48 timer efter den sidste injektion). Da højden af ​​ceramid i celler som respons på ASM er hurtig og kan returnere til basislinien inden for minutter, vi kiggede på tumornekrose og blodkar densitet (ovenfor) som surrogatmarkører for de biologiske virkninger af behandlingen. Da vi observeret et fald i tumor volumen, stige i nekrose, og fald i blodkar tæthed i rhASM /sorafenib gruppe, vi ikke måle indholdet af andre sphingolipid metabolitter såsom S1P. Generelt er det dog klart af vores data, at den fremherskende effekt af rhASM kombinationsbehandlingen var celledød, og dermed enhver nedstrøms S1P der kan have været genereret ikke forhindre disse rhASM /sorafenib-inducerede ændringer.

Modest fordeling af rhASM i subkutane tumorer i forhold til sund lever

ovenstående data viste en positiv, om end beskedne, effekt af kombineret rhASM /sorafenib behandling i denne subkutane Huh7 HCC model. For at undersøge biofordelingen af ​​enzymet til tumorerne målte vi ASM aktivitet ved afslutningen af ​​undersøgelsen. Hvert dyr modtog den sidste rhASM injektion 1, 24 eller 48 timer før aflivning efter den enkelte dyrs dosisregime. Ingen tilsyneladende forskelle i ASM aktivitet blev observeret i forhold til tiden ventede efter den sidste rhASM injektion. Som forventet, ASM aktiviteten var signifikant højere i tumorekstrakter fra rhASM /sorafenib behandlede mus sammenlignet med sorafenib alene (figur 4A). Imidlertid ASM aktivitet i de sunde lever fra disse mus var 12 gange større end i det subkutane tumorer (figur 4B). Således kan beskeden biofordeling af rhASM til de subkutane tumorer forklare den beskedne effekt af kombinationsbehandlingen i denne model.

(A) ASM-aktivitet i tumor ekstrakter af rhASM /sorafenib behandlede mus var signifikant højere (ANOVA, df (2,30), F = 22,58, p 0,001; Dunnetts post hoc test p 0,001) end kontrol, mens sorafenib havde ingen effekt på baseline ASM aktivitet. (B) ASM aktivitet i lever ekstrakter af rhASM /sorafenib behandlede mus også var højere end vehikelbehandlede mus (ANOVA, df (2,30), F = 11,17, p 0,001; Dunnetts post hoc test p 0,001), og sorafenib havde ingen effekt på baseline ASM aktivitet. Notatet dyr i kombinationsbehandlingen gruppe havde 12 gange højere ASM aktivitet i lever end i tumorer, hvilket viser hepatotropisk natur rhASM under kronisk administration og relativt beskedne distribution til de subkutane tumorer. ** P 0,001. Bemærk: Y-akserne aktivitet (10

-6 mol /l /time) blev målt i lige dele 20% vægt /volumen vævsekstrakter som beskrevet i Materialer og metoder

Sikkerhed for. rhASM /sorafenib kombinationsbehandling

i fase i sikkerhed forsøg med rhASM i type B NPD patienter blev den højeste sikker initialdosis bestemt til at være 0,6 mg /kg [24]. På grund af de meget høje doser af rhASM anvendes i den aktuelle undersøgelse (25 mg /kg q.72 h), undersøgte vi den potentielle toksicitet af kombinationen behandling ved at overvåge kropsvægte hele undersøgelsen og ved at undersøge leverfunktionen af ​​musene ved afslutningen af ​​behandlingen. Vægtene i starten og slutningen af ​​behandlingen var ikke signifikant forskellige (figur S1A). Desuden blev ingen signifikant forskel i alanin transaminase (ALT) observeret i enten sorafenib eller rhASM /sorafenib behandlede mus sammenlignet med kontrol (figur S1B). To dyr med høj outlier værdier af ALAT havde lommer af inflammatoriske celler (fig S1B) i en ellers sund lever, uden tegn på kronisk skade (Figur S1c). Notatet det langlivede rhASM /sorafenib mus ID # 452 (ALT 52 U /L) og ID # 443 (ALT 53 U /L) var ikke de outliers. Aspartattransaminase (AST, figur S1D) og total bilirubin (figur S1E) også blev ikke signifikant ændret af kombinationsbehandlingen. Sammen antyder disse data, at kombinationen af ​​rhASM (25 mg /kg q.72 h) og sorafenib (30 mg /kg qd) er veltolereret.

Evaluering af rhASM /sorafenib behandling i en ortotopisk model af Huh7 tumorer

de ovennævnte positive resultater af rhASM /sorafenib behandling blev opnået på trods af dårlig biofordeling af rhASM til de subkutane tumorer. Vi begrundede derfor, at resultaterne kan forbedres i en ortotopisk model af HCC. At etablere en sådan model blev Huh7 celler, der stabilt udtrykker luciferasereportergenet injiceret i leverparenkym af SCID /beige-mus. Dyr blev afbildet 24 timer og 1 uge efter operationen, og overvåges hver 4-5 dage, indtil en fortsat stigning i luminescens blev observeret (figur 5A). Dette blev gjort for at sikre, at celler overlevede implantationsproceduren og begyndte at ekspandere og skabe tumorer. Alle mus havde påviselige luminescerende områder i leveren region ved begyndelsen af ​​behandlingen, og stærkt forstørret luminescens områder på slutningen af ​​studiet -. Svarende til tumorerne vokser i leveren (figur 5B)

(A ) Efter kirurgisk injektion af luciferase-mærkede Huh7 celler blev luminescensen overvåget over tid. Stigning i luminescens ≥6 fold baseline (dag 1) blev anvendt som bevis for en vellykket implantation af celler, indledning af tumorvækst og et punkt for randomisering af mus i behandlingsgrupper. (B) Repræsentative billeder af mus i begyndelsen af ​​lægemiddelbehandling viser godt detekterbar luminescens fra leveren (indsæt et), stort luminescerende areal svarende til leveren Huh7 tumoren på tidspunktet for aflivning (indsætter b, c). Lever og tumor blev udskåret og adskilt (d) til yderligere behandling. Scale bar i insert d er 1 cm. (C) signifikant længere median overlevelse af sorafenib behandlede mus (n = 5, 42 dage, chi-square 4,88, df (1), p = 0,027) og kombinerede rhASM /sorafenib behandlede mus (n = 5, 44 dage, chi- square 4,43, df (1), blev der observeret p = 0,035) sammenlignet med kontrol (n = 4, 14 dage). Ingen signifikant forskel blev observeret mellem rhASM alene (n = 4, 19 dage) og kontrol eller mellem sorafenib og rhASM /sorafenib. (D) rhASM aktivitet i ortotopisk HCC fra køretøj og sorafenib behandlede mus (naive til rhASM behandling baseline rhASM) var signifikant, 6,4 ± 1,4 gange lavere end rhASM aktivitet i tumorer fra rhASM og rhASM /sorafenib behandlede mus (t = -3,99 , df (15), p = 0,001). Ligeledes baseline rhASM i leveren var signifikant lavere, 13,6 ± 1,6 fold, end aktiviteten af ​​rhASM i lever fra mus, der fik rhASM eller rhASM /sorafenib (t = -9,07, df (14), s = 3,1 · 10

– 7). Vigtigt er det, at forskellen mellem aktiviteten af ​​rhASM i behandlede mus (rhASM og rhASM /sorafenib) mellem ortotopisk HCC og lever var meget højere i leveren, 20,8 ± 2,4 gange (t = -8,7, df (13), s = 8,8 · 10

-7, **). Bemærk:. Y-akserne aktivitet (10

-6 mol /l /time) blev målt i lige dele 20% vægt /volumen vævsekstrakter som beskrevet i Materialer og metoder

Randomisering og påbegyndelse af behandling blev udført som beskrevet i Materialer og Metoder. Mus der fik /sorafenib kombinationen rhASM blev startet på den samme dosis og behandlingsplan som i det subkutane model – 30 mg /kg sorafenib q.d. ved tvangsfodring og 25 mg /kg rhASM q.72 timer i.p. Selvom vi ikke var i stand til nøjagtigt at kvantificere tumorstørrelse ved luminescens over tid (sandsynligvis på grund af det lille antal dyr og kinetik luciferin aktivering inden tumorer), var der ingen tydelig plateau af luminescens i de behandlede mus. Derfor hyppigheden af ​​rhASM administration blev forøget, (2-dage-on, 1-dages-off) 2 uger i studiet i et forsøg på at afbøde mulige sub-dosering af rhASM.

overlevelse profiler af behandlede mus svarede til dem observeret i det subkutane model, nemlig ingen signifikant forskel mellem alene sorafenib og rhASM /sorafenib kombination grupper (Figur 5C). Imidlertid overraskende ASM aktivitet i de sunde lever fra den behandlede mus var adskillige gange større end i de ortotopisk Huh7 tumorer fra de samme dyr. Dette svarer til resultaterne fra de subkutane tumorer (figur 4B), hvilket indikerer, at den dårlige biofordeling af rhASM til Huh7 tumorer var uafhængig af xenotransplantat placering.

I betragtning af den tilsvarende ASM aktivitetsprofil i de to forskellige modeller vi næste udforsket ekspressionen af ​​to receptorer er vigtige i den cellulære internalisering af rhASM – insulinlignende vækstfaktor receptor 2 (IGF2R) og mannose-receptor 1 (MRC1) – i HCC. Analyse af Oncomine database viste, at ekspressionen af ​​

IGF2R

er ikke konsekvent dereguleret mellem de 4 forskellige menneskelige HCC datasæt, mens ekspressionen af ​​

MRC1

blev nedreguleret i 3/4 datasæt (gen rækker: top 11, 2, og 5%). (tabel 2)

Vi undersøgte derfor udtryk for

MRC1 /Mrc1

i lever og ortotopisk Huh7 tumorer. To forskellige sæt PCR primere blev designet til at estimere udtryk for menneskelig og mus

MRC1

Mrc1

hhv. Resultaterne (tabel 3) viste ingen påviselig ekspression af

MRC1

i humane Huh7 celler eller de ortotopisk Huh7 tumorer. Ekspression blev detekteret i sund human lever som en positiv kontrol. Ekspressionen af ​​mus

Mrc1

var påviselig i non-tumor leveren og i Huh7 tumorer. Sidstnævnte er i tråd med vært-transplantat “forurening”, som er dokumenteret før [25]. I betragtning af, at C

T værdier på ~21 blev observeret for både

Mrc1

og

Srsf4

husholdning gen i mus lever, og ca. 25 til

Mrc1

Srsf4

i Huh7 levertumorer, vises udtryk for

Mrc1

i tumorerne til at være -10 gange lavere.

Srsf4

blev anvendt som en husholdning gen baseret på den stabile ekspression under forskellige stadier af HCC udvikling [26]. Samlet set har disse resultater afslører meget lav

MRC1

ekspression i Huh7 celler /tumorer var i overensstemmelse med den lave ASM aktivitet observeret i de xenotransplantattumorer efter behandling.

Diskussion

Ændringer i membran lipider af tumorceller, herunder glycosphingolipider, er blevet anerkendt i over 40 år [27]. Siden da har de strukturelle roller sphingolipider blevet udvidet til også at omfatte et indviklet netværk af bioaktive lipider med forskellige roller i mange celle processer, herunder celledød og overlevelse. I dag er de vigtige roller af to af disse lipider, ceramid og S1P, er blevet godt etableret i kræft. Fokus på ceramider og S1P for kræftbehandling er godt placeret, da opretholde en passende ceramid /S1P balance er afgørende for at bestemme celle skæbne, og ændret sphingolipid stofskifte er et fælles træk ved mange kræftformer, hvilket fører til reduktion i ceramid og /eller elevation af S1P [10]. Således er sphingolipid lægemidler under udvikling til formål at genoprette denne metaboliske balance og /eller forbedre ceramid-medieret død af tumorceller eller tumor mikrovaskulaturen [10], [11]. Flere behandlinger baseret på enten opløftende pro-død ceramid eller reducere pro-overlevelse S1P er aktivt under efterforskning, herunder brug af ceramid analoger og hæmmere af ceramidases eller sphingosin kinaser [28]. Gennem det seneste årti mange papirer har belyst roller ceramid og ASM især i cellesignalering og potentialet modulere denne vej i kræftbehandlingen [14], [29], [30]. Kolesnick og kolleger var den første til at foreslå, at det lysosomale enzym, ASM, kan spille en rolle i disse processer, og vist betydningen af ​​ASM-genereret ceramid i radiosensitivitet af tumorceller og tumor- mikrovaskulaturen [31].

Her bringer vi opmærksomme på en potentiel anvendelse af sphingolipid graduering i eksperimentel HCC ved hjælp rhASM, som er fremstillet til mennesker og evalueret for enzymsubstitutionsterapi i type B NPD patienter. HCC er en særlig dødbringende solid malignitet med en voksende global forekomst og dødelighed [32]. Delvis lovende resultater i HCC patienter skyldes til patogenesen af ​​sygdommen, som omfatter aberrerende aktivering af større signalveje såsom RAF /MEK /ERK, PI3K /AKT /mTOR, WNT /β-catenin, IGF, HGF /c-MET og angiogenese [2].