PLoS ONE: Annexin A10 i Human Oral Cancer: biomarkør for tumorvækst via G1 /S Transition ved Målretning MAPK Signaling Pathways

Abstrakt

Baggrund

annexiner er calcium og phospholipid bindende proteiner, der danner en evolutionær konserveret multigenfamilie. Betydelig tyder på, at annexin A10 (ANXA10) er involveret i tumoral progression, selvom lidt om sin rolle i human oral carcinogenese. I denne undersøgelse undersøgte vi inddragelse af ANXA10 i mundtlig planocellulært karcinom (OSCC).

Metode /vigtigste resultater

ANXA10 mRNA og protein udtryk blev vurderet ved kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion og immunoblotting, og vi gennemførte en spredning assay og celle-cyklus analyse ANXA10 knockdown celler

in vitro

. Vi evaluerede sammenhængen mellem ANXA10 udtryk status i 100 primære OSCCs og klinisk-patologiske træk ved immunhistokemi. ANXA10 mRNA og protein udtryk niveauer var opreguleret i alle cellulære linjer undersøgt (n = 7,

s

0,05). ANXA10 Knockdown celler viste, at cellulær proliferation faldt med inaktivering af ekstracellulært reguleret kinase (ERK) (

s Restaurant 0,05), og celle-cellecyklusstandsnings ved G1 fasen skyldtes opregulering af cyclinafhængige kinaseinhibitorer . ANXA10 proteinekspression i primære OSCCs var også signifikant større end i normale modstykker (

s

0,05)., Og højere udtryk var korreleret med tumor størrelse (

s

= 0,027)

konklusioner /betydning

Vores resultater foreslået for første gang, at ANXA10 er en indikator for celleproliferation i OSCCs. Vores resultater antydede, at ANXA10 udtryk kunne tyde celleproliferation og ANXA10 kunne være et potentielt terapeutisk mål for udviklingen af ​​nye behandlinger for OSCCs

Henvisning:. Shimizu T, Kasamatsu A, Yamamoto A, Koike K, Ishige S, Takatori H, et al. (2012) Annexin A10 i Human Oral Cancer: biomarkør for tumorvækst via G1 /S Transition ved Målretning MAPK signalveje. PLoS ONE 7 (9): e45510. doi: 10,1371 /journal.pone.0045510

Redaktør: Qiming Jane Wang, University of Pittsburgh School of Medicine, USA

Modtaget: 23. marts 2012; Accepteret: August 21, 2012; Udgivet: September 17, 2012 |

Copyright: © Shimizu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

annexiner er calcium og phospholipid bindende proteiner, der udgør en evolutionært konserveret multigenfamilie. Dysregulering af annexin familiemedlemmer er blevet rapporteret i mange cancertyper og påvirker mønstre af cellulære adfærd, såsom proliferation, invasionsevne, og kræftrelaterede signalveje, hvilket antyder, at annexiner kan spille vigtige roller i tumoral udvikling og progression [1] – [10] . Annexin A10 (ANXA10), et overudtrykt gen i de orale planocellulært karcinom (OSCC) afledte cellulære linjer i vores tidligere microarray data [11], har været impliceret i cellulær funktion i endocytose og exocytose; antikoagulerende aktivitet; interaktion med cytoskelettet; differentiering; og cellulær proliferation [12], [13]; og relevansen af ​​malignitet i Barretts øsofagus, mavekræft, og blærekræft [14] – [16].

Proliferation af humane cancerceller er i vid udstrækning kontrolleret i G1 fasen af ​​den cellulære cyklus. Den mitogen-aktiveret protein kinase (MAPK) signalering kaskader er dukket op som vigtige aktører i proliferation i forskellige cancerceller [17]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at adskillige annexiner specifikt modulerer ekstracellulære regulerede kinase (ERK) /MAPK signaleringskaskade opstrøms [18], [19]. ERK-aktivering spiller en fundamental rolle i G1 /S overgang [20], [21]. Medlemmer af cyklin

–

afhængig kinase (CDK) interagerende protein /kinase hæmmende protein (Cip /Kip) familie binder til cyklin-CDK-komplekser og hæmme deres aktiviteter, hvilket fører til G1 celle-cyklus anholdelse. Cyclin D1, cyclin E, p21

Kip1, og p27

Kip1 niveauer påvirkes af flere signalveje herunder ERK /MAPK signalvej [22] – [25]. Men de molekylære mekanismer, som ANXA10 modulerer disse cellulære reaktioner er ikke blevet fuldstændigt belyst i OSCCs.

Vi rapporterer resultaterne af en omfattende analyse af afvigende ekspression af ANXA10 i OSCCs der er funktionelt og klinisk knyttet til tumoral progression .

Resultater

Evaluering af ANXA10 mRNA og protein-ekspression i OSCC-afledte cellulære linjer

for at undersøge udtrykket status ANXA10 identificeret som en kræft-relateret gen af ​​vores tidligere microarray data [11], udførte vi kvantitativ real-time revers transkription-PCR (QRT-PCR) og immunblotting analyser efter syv OSCC-afledte cellulære linjer og humane normale orale keratinocytter (HNOKs). ANXA10 mRNA og protein udtryk status var signifikant opreguleret i alle OSCC cellulære linjer sammenlignet med i HNOKs (figur 1A, B; *

s

0,05). Expression analyse viste, at både transskription og oversættelse produkter af dette molekyle var stærkt udtrykt i OSCC-afledte cellulære linjer.

(A) Kvantificering af

ANXA10

mRNA-niveauer i OSCC-afledte cellulære linjer ved QRT -PCR-analyse. Væsentlige opregulering af

ANXA10

mRNA ses i de syv OSCC-afledte cellulære linjer sammenlignet med i HNOKs. Data er udtrykt som middel ± SEM af værdier fra tre assays (*

s

0,05; Mann-Whitney U-test). (B) Immunblotting analyse af ANXA10 protein i OSCC-afledte cellulære linjer og HNOKs. ANXA10 proteinekspression (molekylvægt, 37 kDa) er opreguleret i OSCC-afledte cellulære linjer sammenlignet med i HNOKs. Densitometrisk ANXA10 protein data er normaliseret til a-tubulin proteinniveauer. Værdierne er udtrykt som en procentdel af de HNOKs.

Etablering af ANXA10 Knockdown celler

Da ANXA10 udtryk var opreguleret i OSCC cellulære linjer, vi antaget, at ANXA10 kunne spille en vigtig rolle i OSCCs. For at vurdere ANXA10 funktioner

in vitro

, en shRNA forsøg blev udført under anvendelse af SA3 og Ho-1-u-1-celler. Expressions of ANXA10 mRNA og protein i de shANXA10-transficerede celler var signifikant lavere end i de shMock-transficerede celler (Sa3 og Ho-1-u-1-afledte transfektantcellerne, figur 2A, B; *

s

. 0,05)

(A) QRT-PCR viser, at ANXA10 mRNA ekspression i shANXA10-transfekterede celler (Sa3- og Ho-1-u-1-afledte transfektanter, 2 kloner hver) er væsentligt lavere end i shMock-transfekterede celler (*

s

0,05; Mann-Whitney U-test). (B) Immunoblotting analyse viser, at ANXA10 proteinniveauer i shANXA10-transficerede celler (Sa3- og Ho-1-u-1-afledte transfektanter, 2 kloner hver) også er faldet markant sammenlignet med den i shMock-transficerede celler

Funktionelle analyser af ANXA10 knockdown celler

for at vurdere effekten af ​​ANXA10 knockdown på cellulær vækst, vi udførte en celleproliferation assay. Transficeret med ANXA10 shRNA (shANXA10) – og kontrol shRNA (shMock) transficerede celler blev podet i seks-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

4 levedygtige celler /brønd tælles på 7 på hinanden følgende dage. Der var et signifikant fald i cellulær vækst af shANXA10-transficerede celler sammenlignet med de shMock-transficerede celler (SA3 eller Ho-1-u-1-afledte transfektantcellerne, figur 3; *

s Restaurant 0,05 ).

for at bestemme virkningen af ​​shANXA10 på cellulær proliferation, shANXA10- og shMock-transficerede celler podes i plader med 6 brønde ved en densitet på 1 x 10

4 levedygtige celler /brønd. Begge transfektanter blev talt på 7 på hinanden følgende dage. Den cellulære vækst i shANXA10-transficerede celler (Sa3- og Ho-1-u-1-afledte transfektanter, 2 kloner hver) er signifikant inhiberet sammenlignet med shMock-transficerede celler efter 7 dage (168 timer). Resultaterne er udtrykt som middel ± SEM af værdier fra tre assays. Stjernerne viser signifikante forskelle mellem shANXA10- og shMock-transfekterede celler (*

s

0,05; Mann-Whitney U-test).

For at undersøge en mulig underliggende mekanisme, ville forklare reduceret cellulær proliferation i shANXA10-transficerede celler vurderede vi ERK veje, der ofte opreguleret i endometrisk og andre kræftformer [26] – [29]. Phosphoryleret ERK (pERK) protein faldt betydeligt i shANXA10-transficerede celler sammenlignet med shMock-transficerede celler (figur 4). Disse resultater antydede, at ERK signalvejen ofte er svækket i shANXA10-transficerede celler.

ANXA10 knockdown årsager reducerede niveauer af phosphoryleret ERK (pERK) sammenlignet med shMock-transficerede celler (Sa3- og Ho-1-u -1-afledte transfektanter, 2 kloner hver); ERK niveauet er uændret. Densitometrisk pERK /ERK protein data er normaliseret til a-tubulin protein niveauer.

For at undersøge mekanismen for celle-cyklus progression i shANXA10-transfekterede celler, vi udførte flowcytometrisk analyse af shANXA10-transfekterede celler. Den procentdel af G1 fase i shANXA10-transficerede celler var signifikant (

s

0,05) højere end i mocktransfekterede celler (figur 5A, B). Vi vurderede også udtrykket niveau af cyclin-afhængige kinase hæmmere (CDKIs: p21

Cip1 og p27

Kip1), cyklin D1, cyklin E, CDK2, CDK4 og CDK6. Som forventet, mens CDKIs var opreguleret, blev der påvist en signifikant nedregulering af cyklin D1, cyklin E, CDK2, CDK4 og CDK6 i shANXA10-transfekterede celler (Figur 5C). Disse resultater viste, at nedregulering af ANXA10 hæmmede celleproliferation ved at anholde G1 fasen.

For at undersøge celle-cyklus progression, vi analyserede flowcytometrisk bestemmelse af DNA-indhold ved en FACScalibur i G0-G1, S, og, G2-M-faser. Vi bestemt ekspressionsniveauet af CDKIs (p21

Cip1and p27

Kip1), cyklin D1, cyklin E, CDK2, CDK4 og CDK6 at identificere den mekanisme, hvormed ANXA10 hæmmer celle-cyklus progression i G1 fasen. (A) Efter synkronisering ved G0 /G1-fasen med frataget serum blev flowcytometrisk analyse udført for at undersøge cellecyklus i shANXA10- og shMock-transficerede celler. Den procentdel af G1 fasen i shANXA10-transfekterede celler (Sa3- og Ho-1-u-1-afledte transfektanter, 2 kloner hver) er steget markant i forhold til de mocktransfekterede celler (

s

0,05, Mann-Whitneys

U

test). (C) Immunoblotting analyse viser opregulering af p21

Cip1and p27

Kip1 og nedregulering af cyklin D1, cyklin E, CDK2, CDK4 og CDK6 i shANXA10-transfekterede celler (Sa3- og Ho-1 -u-1-afledte transfektanter;. 2 kloner hver) sammenlignet med shMock-transficerede celler

Evaluering af ANXA10 udtryk i primære OSCCs

repræsentant immunhistokemi (IHC) resultater for ANXA10 protein i normal oralt væv og primære OSCC er vist i figur 6A-D. De ANXA10 IHC snesevis af cytoplasmaet af primære OSCCs var signifikant (figur 6E; *

s

0,001) højere end i normale væv, hvor IHC snesevis af normale orale væv og OSCCs varierede fra 27,5 til 132,4 (median, 93,5) og 60,5 til 230,4 (median, 150,6), hhv. Tabel 1 viser korrelationerne mellem de clinicopathologic egenskaber ved patienter med OSCC og status for ANXA10 proteinekspression under anvendelse af IHC pointsystem. Blandt de kliniske klassifikationer blev ANXA10-positive OSCCs korreleret med tumoral størrelse (

s

= 0,027) og TNM fase af OSCCs (

s

= 0,041).

repræsentant IHC resultater for ANXA10 protein i normal oralt væv (A, B) og den primære OSCC (C, D) (A, C) Original forstørrelse, × 100. Målestokke 50 uM. (B, D) Original forstørrelse, × 400. Scale barer, 10 pm). Stærk ANXA10 immunoreaktivitet detekteres i primære OSCCs; normale orale væv viser næsten negativ immunfarvning. (E) Staten ANXA10 proteinekspression i primære OSCCs (n = 100) og de normale modstykker. De ANXA10 IHC score er beregnet som følger: IHC score = 1 × (antal svagt farvede celler på området) + 2 x (antal moderat farvede celler i marken) + 3 × (antal intenst farvede celler i felten) . De ANXA10 IHC score for normale orale væv og OSCCs varierede fra 27,5 til 132,4 (median, 93,5) og 60,5 til 230,4 (median, 150,6), hhv. ANXA10 protein udtryk niveauer i OSCCs er betydeligt (*

s

0,001, Mann-Whitneys

U

test). Højere end hos normale orale væv

diskussion

i den aktuelle undersøgelse, ANXA10 blev ofte overudtrykt i OSCC-afledte cellulære linjer, og nedregulering resulterede i nedsat cellulær proliferation ved inaktivering af ERK. Cellen-cyklus analyse viste også, at G1 anholdelse fandt sted i ANXA10 knockdown celler gennem nedsat CDKI (p21

Cip1 og p27

Kip1) udtryk. Desuden ANXA10 var ofte opreguleret i primære OSCCs og højere ANXA10 udtryk var forbundet med tumoral størrelse (

s

= 0,027). Disse resultater viste, at ANXA10 er knyttet til reguleringen af ​​cellecyklussen i G1-fasen og spiller en vigtig rolle i tumoral progression i OSCCs.

Da oral carcinogenese og andre cancertyper menes at være flertrinsprocesser involverer progressiv forstyrrelser af epitelcelleproliferation, mekanismerne for celleproliferation i tumorceller er et vigtigt fagområde for tumoral behandling og molekylær cancer biologi [30], [31]. Annexiner, herunder ANXA10, har spillet en vigtig rolle i tumor udvikling og progression [14] – [16], [18], [19]. Imidlertid har noget direkte bevis vist, at ANXA10 er påkrævet for cellulær proliferation. For at bestemme om ANXA10 funktion er relevant for OSCC progression, udførte vi funktionelle undersøgelser under anvendelse shRNA og fundet, at undertrykkelse af ANXA10 faldt betydeligt cellulær proliferation som følge af inhiberet MAPK signalvejen med nedregulering af pERK. ERK /MAPK-signalvejen er relateret til mange cellulære processer, såsom proliferation, differentiering, homeostase, og cellulær overlevelse [17], [32]. Aktivering af ERK /MAPK-signalvejen fremmer abnorm cellevækst og tumorigenese i multiple typer af tumorer. Vores resultater viste, at ANXA10 ekspression var relevant for phosphorylering af ERK og aktivering af ERK /MAPK signalvej. ERK /MAPK-vejen er stramt kontrolleret af mekanismer ekstracellulære signaler. Dette omfatter kontrol af intracellulære Ca

2 + koncentrationer, hvorved Ca

2+ at tjene som en anden messenger [33]. Ca

2 + -effector proteiner kan mediere cellulære reaktioner på ændringer i intracellulær Ca

2 + niveauer. Annexiner, en familie af sådanne stærkt bevaret Ca

2 + -regulated proteiner, er karakteriseret ved deres evne til at binde til phospholipider i et Ca

2 + -afhængig måde, og de fleste annexin funktioner er forbundet med deres evne til at interagere med cellulære membraner i et reguleret måde [12], [13]. Baseret på disse beviser kombineret med vores resultater, foreslår vi, at ANXA10 kan påvirke intracellulær Ca

2+ homeostase og direkte eller indirekte interagerer med aktiveringen af ​​ERK /MAPK signalveje.

Ud over den MAPK signalering vej, OSCC celler med shANXA10 afslørede celle-cyklus anholdelse ved G1 fase med opregulering af p21

Cip1 og p27

Kip1 og nedregulering af cyklin D1 og cyclin E. de sidste to er også kritiske regulatorer af G1 progression og G1-S overgang. Hæmme deres udtryk blokke G1-S overgangen i cellecyklus. Aktiviteterne af cyklin-CDK komplekser moduleres af to typer CDKIs, Cip /Kip (p21

Cip1and p27

Kip1), som regulerer celle-cyklus progression. Medlemmer af Cip /Kip familien binder til cyklin-CDK komplekser og hæmme deres aktiviteter, hvilket fører til G1 celle-cyklus anholdelse. Cyclin D1, cyclin E-, p21

Kip1, og p27

Kip1 niveauer påvirkes af flere signalveje, herunder ERK /MAPK signalvejen [25], [34]. Cyclin D1 og cyclin E-ofte opreguleret i humane kræftformer [35], [36]. Mekanismen til at aktivere ERK i adhærerende fibroblaster er blevet rapporteret at påvirke cyclin D1 [37]. I andre rapporter, aktivering af ERK fører til opregulering af cyclin D1 [38]. Den CDKIs, p21

Kip1 og p27

Kip1, ofte nedreguleret i humane kræftformer [39], [40]. Mekanismen af ​​ERK regulering af p21

Kip1 og p27

Kip1 fortsat uklart. ERK kan direkte phosphorylere p21

Kip1 og p27

Kip1 [41] – [43]. Disse data antydede, at ANXA10 aktiverer MAPK signalvejen ved phosphorylering ERK og fremmer G1 cellecyklus ved nedregulering CDKIs i OSCC progression.

Til dato udtryk for ANXA10 i OSCC væv og dens korrelation til klinisk-patologiske træk er ikke blevet belyst. I vores undersøgelse, selvom de positive satser ANXA10 i den tidlige fase tumorer var signifikant lav, de positive satser i fremskredne-tumorer blev væsentligt forøget; denne stærkt indebærer, at ANXA10 kan spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft. I betragtning af at ANXA10 overekspression kan forudsige malignitet, patient stratificering efter ANXA10 status kan give en mere personlig tilgang til menneskelig oral kræftbehandling.

Som konklusion vores resultater viste, at ANXA10 er overudtrykt hyppigt i OSCCs og at denne overekspression kan være forbundet med tumoral progression ved at fremme cellecyklusfremadskriden i G1-fasen ved aktivering af ERK /MAPK signalvej, hvilket fører til nedsat ekspression af CDKIs. Mens yderligere undersøgelser er nødvendige for at studere interaktionen af ​​ANXA10 og ERK /MAPK signalvejen disse data antydede, at ANXA10 spiller en vigtig rolle i cellulær proliferation og ekspression sandsynligvis er en biomarkør for progression og et potentielt terapeutisk mål for udvikling af anticancer narkotika i primær OSCCs.

Materialer og metoder

Etik Statement

undersøgelsen protokol den blev godkendt af Etisk Komité Graduate School of Medicine, Chiba Universitet (det godkendelsesnummer, 236) og blev udført i overensstemmelse med de etiske standarder, der er fastsat i Helsinki-erklæringen. Skriftligt informeret samtykke blev modtaget fra alle patienter.

OSCC cellulære linjer og vævsprøver

De humane OSCC cellulære linjer (HSC-2, HSC-3, HSC-4, køn, Ho-1 -u-1, og Ca9-22) blev købt fra human Science Research Resources Bank, Osaka, Japan. Sa3 blev venligst stillet til rådighed af Dr. S. Fujita på Wakayama Medical University, Wakayama, Japan [44]. Primære dyrkede HNOKs tjente som normale kontroller [45] – [49]. Alle celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium /F-12 HAM (Sigma, St. Louis, MO, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Sigma) og 50 enheder /ml penicillin og streptomycin (Sigma) i en befugtet 5 % CO

2 /luft atmosfære ved 37 ° C.

Et hundrede par af primære OSCC prøver og tilsvarende normale orale epitelvæv blev opnået under operationer på Chiba Universitetshospital, Chiba, Japan. Alle patienter forudsat informeret samtykke til brug af protokollen, som den institutionelle gennemgang bestyrelse Chiba University og godkendt. De resektion væv blev delt i to dele; en blev straks nedfrosset og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-isolering, og den anden blev fikseret i 20% pufret formaldehydopløsning for patologisk diagnose og IHC. Histopatologisk diagnose af hvert væv blev udført i overensstemmelse med World Health Organization kriterier ved Patologisk Institut, Chiba Universitetshospital. Klinisk-patologisk iscenesættelse blev bestemt i henhold til tumoren-node-metastaser klassificering af Den Internationale Union mod Kræft. Alle OSCC prøver blev bekræftet histologisk og kontrolleres for at sikre tilstedeværelsen af ​​tumoral i mere end 80% af enheder.

Kvantitativ real-time revers transkription-PCR

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol Reagent ( Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. cDNA blev dannet fra 5 ug totalt RNA under anvendelse Ready-To-Go Du-Prime First-Strand Beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) og oligo (dT) primer (Hokkaido System Science, Sapporo, Japan) ifølge producentens instruktioner . QRT-PCR blev udført for at evaluere ekspressionsniveauet af

ANXA10

mRNA i OSCC-afledte cellulære linjer og HNOKs. Ekspressionsniveauerne blev bestemt ved anvendelse af primere og prober, der var designet under anvendelse af Universal Probe Library (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens anbefalinger. Primersekvenserne anvendes til QRT-PCR var:

ANXA10

, frem 5’GCATCCATTATGGGATTGAAA-3 ‘, omvendt 5’CAAAATGTTTTGTGGAGACTATGTG-3’, og universel sonde # 24. Alle QRT-PCR blev udført under anvendelse af en LightCycler® 480 PCR-system (Roche). Amplifikationer blev initieret ved en 10-minutters præinkubation ved 95 ° C efterfulgt af 45 cykler af 10 sekunder ved 95 ° C i template-denaturering, 30 sekunder ved 55 ° C i primerannealing /udvidelse og afkøling i 30 sekunder ved 40 ° C. Udskriften beløb for

ANXA10

blev estimeret ud fra de respektive standard kurver og normaliseret til

glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase

(

GAPDH

) (fremadrettet 5′-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA -3’cell, omvendt 5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ‘, og universel sonde # 60) udskrift opgjorte beløb i tilsvarende prøver.

Immunoblotting analyse

cellerne blev vasket to gange med kold phosphat- saltvand (PBS) og centrifugeret kortvarigt. De cellulære pellets blev inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter i en lysepuffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% vægt /volumen CHAPS, og 10 mM Tris [pH 7,4]) med proteinase inhibitor cocktail (Roche). Proteinkoncentrationen blev målt med et Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Proteinekstrakter (20 ug) blev separeret ved natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese i 4-12% gel, overført til nitrocellulosemembraner, og blokeret i 1 time ved stuetemperatur i Blokering One (Nacalai Tesque, Tokyo, Japan). Membranerne blev inkuberet med kanin anti-ANXA10 polyklonale antistof (Abnova, Taipei, Taiwan), mus anti

α

tubulin monoklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californien USA), muse-anti-ERK 1/2 monoklonalt antistof (R 2+, moderat; og 3+, intens. De cellulære numre og farvningen intensiteten blev derefter ganget at producere ANXA10 IHC score. Sager med en ANXA10 IHC score på over 132,0 (3 standardafvigelse (SD) score for normalt væv) blev defineret som ANXA10-positive. Den ± 3 SD cutoff, som statistisk set er blot 0,2% af målingen og forventes at falde uden for dette område, blev brugt, fordi det var usandsynligt, at blive påvirket af en tilfældig eksperimentel fejl produceret af prøve manipulation [56]. To uafhængige patologer, ingen af ​​dem havde kendskab til patienternes kliniske status, gjorde disse domme.

Statistisk analyse

Betydningen af ​​ANXA10 ekspressionsniveauerne blev evalueret ved hjælp af Fishers eksakte test eller Mann -Whitney U test.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Dataene er udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien (SEM).

Tak

Vi takker Ms Lynda C. Charters til redigering dette manuskript.