PLoS ONE: mTOR-hæmmere kontrollere væksten af ​​EGFR Mutant lungekræft Selv efter Erhvervelse Modstand af HGF

Abstrakt

Modstand mod epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinasehæmmere (EGFR-TKI’er), gefitinib og erlotinib, er et kritisk problem i behandlingen af ​​

EGFR

mutant lungekræft. Flere mekanismer, herunder bypass signalering af hepatocytvækstfaktor (HGF) -triggered Met-aktivering, er impliceret som mediatorer af resistens. Den pattedyr mål for rapamycin (mTOR), er en downstream kanal af EGFR og MET signalering, og betragtes således som en terapeutisk attraktivt mål i behandling af forskellige typer af kræft. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge, om 2 klinisk godkendte mTOR-hæmmere, temsirolimus og everolimus, overvinde HGF-afhængig modstand mod EGFR-TKI’er i

EGFR

mutant lunge kræftceller. Både temsirolimus og everolimus hæmmede fosforylering af p70S6K og 4E-BP1, som er nedstrøms mål for mTOR pathway, og reduceret levedygtighed

EGFR

mutant lunge kræftceller, PC-9, og HCC827, selv i tilstedeværelse af HGF

in vitro

. I en xenograft model, temsirolimus undertrykte væksten af ​​PC-9 celler overudtrykker

HGF

-gen; dette var forbundet med undertrykkelse af mTOR-signalvejen og tumorangiogenese. I modsætning hertil erlotinib ikke undertrykke denne signalvejen eller tumorvækst. Flere mekanismer, herunder inhibering af vaskulær endotel vækstfaktor produktion af tumorceller og undertrykkelse af endotelcelle levedygtighed, bidrager til den antiangiogene virkning af temsirolimus. Disse resultater viser, at mTOR-hæmmere kan være nyttige til styring af HGF-udløst EGFR-TKI modstand i

EGFR

mutant lungekræft, og de giver rationalet for kliniske forsøg med mTOR-hæmmere hos patienter stratificeret af

EGFR

mutation og HGF udtryk status

Henvisning: Ishikawa D, Takeuchi S, Nakagawa T, Sano T, Nakade J, Nanjo S, et al. (2013) mTOR-hæmmere kontrollere væksten af ​​EGFR Mutant lungekræft Selv efter Erhvervelse Resistance af HGF. PLoS ONE 8 (5): e62104. doi: 10,1371 /journal.pone.0062104

Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea

Modtaget: November 29, 2012; Accepteret: 18 Marts 2013; Udgivet: May 14, 2013 |

Copyright: © 2013 Ishikawa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af KAKENHI (Tilskud-i-Aid for Videnskabelig Forskning om innovative områder ‘Integrative Kræftforskningscenter mikromiljø Network “(til SY) og Grant-in-Aid for Unge Forskere (til TY og ST)), og Grants-in- Støtte til projekt for udvikling af innovative Kræftforskningscenter Therapeutics (P-Direct) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (MEXT). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Seiji Yano modtaget honorarer fra Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. og AstraZeneca. Seiji Yano modtaget forskningsmidler fra Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd og Eisai Co., Ltd. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

lungekræft er den hyppigste årsag til malignitet dødsfald på verdensplan, og mere end 80% af tilfældene er klassificeret som ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) aktiverende mutationer, såsom exon 19 deletion og exon 21 L858R punktmutation, der findes i en population af NSCLC, og er knyttet til en klinisk respons på EGFR tyrosinkinaseinhibitorer (EGF-TKI’er), gefitinib og erlotinib [1] – [3]. Men næsten alle respondenter erhverve modstand og udvikle tilbagefald efter kortere eller længere perioder (erhvervet resistens) [4]. Desuden 20-30% af patienterne viser ugunstige reaktioner, selv om deres tumorer har målmutationer (indre resistens) [5]. Mange undersøgelser er blevet udført for at afgrænse strategier, der kan overvinde erhvervede og iboende modstand. Disse undersøgelser har identificeret flere mekanismer erhvervet resistens, herunder

EGFR

T790M mutation [6], [7],

MET

forstærkning [8], [9], hepatocytvækstfaktor (HGF) overekspression [10], tab af PTEN [11], transformation til en småcellet lungecancer (SCLC) fænotype [12] – [14], epithelial-til-mesenchymal overgang (EMT) [15] – [17], aktivering af den NFkB vej [18], ændring af microRNA [19], og Gas6-Axl akse aktivering [20]. Kompleksiteten af ​​NSCLC reflekteres af samtidig forekomst af forskellige kombinationer af disse resistensmekanismer i forskellige individer. Vi har tidligere opdaget, at HGF udløser EGFR-TKI modstand ved at aktivere markedsøkonomisk /PI3K /AKT-aksen [10]. Desuden viste vi, at HGF overekspression er til stede i tumorer fra japanske patienter med erhvervet og iboende tumor modstand mod EGFR-TKI ved frekvenser på omkring 60% og 30%, henholdsvis [21]. Dette indikerer, at HGF er et ideelt mål for at overvinde EGFR-TKI modstand i

EGFR

mutant lungekræftpatienter. For at overvinde HGF-udløst modstand, bør 2 signaler fra EGFR og HGF-MET spærres samtidigt. Vi har allerede rapporteret, at HGF-afhængig modstand kan styres af et anti-HGF-neutraliserende antistof [22], HGF-antagonist-NK4 [22], Met-TKI [23] – [25], og phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) -inhibitorer [26] i kombination med EGFR-TKI. Imidlertid er disse inhibitorer ikke klinisk godkendt og kan derfor ikke anvendes til behandling af cancerpatienter.

mammalian target of rapamycin (mTOR), en serin /threonin-kinase, er en nedstrømsmål af PI3K og AKT pathways , og det spiller en kritisk rolle i celle overlevelse og proliferation [27] – [29]. Aktivering af PI3K /AKT og efterfølgende phosphorylering af mTOR igangsætter phosphorylering af vigtige downstream mål, herunder ribosomale p70S6 serin /threonin-kinase (S6K1) og eukaryot initieringsfaktor (EIF) -4E bindende protein (4E-BP1), hvilket resulterer i en stigning i mRNA-translation og cap-afhængig proteinsyntese hhv. , MTOR kinase er således en central node i PI3K /AKT signalvej [27] – [30]. Til dato har flere mTOR inhibitor rapamycin analoger blevet udviklet, herunder temsirolimus og everolimus, som er blevet anvendt til behandling af nyrecellecarcinomer og pancreatiske neuroendokrine tumorer. Rapamycin og dets analoger binder FK506-bindende protein-12 (FKBP12) og interagere med mTOR, hæmme dens kinase aktiviteter og standse oversættelse af proteiner kritisk for celledeling og overlevelse.

Da mTOR er neden for både EGFR og MET, vi hypotese, at mTOR hæmning, selv som monoterapi agent, kan blokere EGFR- og MET-medieret signalering samtidig og overvinde HGF-udløst EGFR-TKI modstand. I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgt, om den klinisk godkendte mTOR-hæmmere, temsirolimus og everolimus, omgå HGF-udløst EGFR-TKI resistens i

EGFR

mutant lunge kræftceller ved hjælp af

in vitro

in vivo

modeller, og vurderet underliggende mekanismer.

Materialer og metoder

Cellekulturer og reagenser

EGFR

mutant human lunge adenocarcinom celle linjer PC-9 (del E746_A750) og HCC827, med deletioner i

EGFR

exon 19, blev indkøbt fra Immuno-Biological Laboratories Co. (Takasaki, Gunma, Japan) og American Type Culture Collection (Manassas, VA ), henholdsvis. Human

HGF

-gen transfektanter (PC-9 /HGF) og vektor kontrol (PC-9 /Vec) -celler blev etableret som tidligere beskrevet [10]. Alle cellelinier blev opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og antibiotika. Alle celler blev passeret i mindre end 3 måneder før fornyelsen fra frosne, tidlig-passage bestande. Celler blev regelmæssigt screenet for mycoplasma ved hjælp MycoAlert Mycoplasma Detection Kits (Lonza, Rockland, ME). De cellelinjer blev autentificeret på laboratoriet af National Institute of Biomedical Innovation (Osaka, Japan) ved kort tandem repeat analyse. Erlotinib, everolimus, og temsirolimus blev opnået fra Selleck kemikalier (Houston, TX). Human rekombinant HGF blev fremstillet som tidligere beskrevet [10].

Produktion af HGF og VEGF i cellekultursupernatanter

Celler (2 x 10

5) blev dyrket i 2 ml medium med 10% FBS i 24 timer, vaskes med PBS og inkuberet i 48 timer i medium med 10% FBS. I nogle eksperimenter blev HGF tilsat til mediet. Dyrkningsmedierne blev høstet og centrifugeret, og supernatanterne blev opbevaret ved -70 ° C indtil analyse. Koncentrationerne af HGF og VEGF blev bestemt ved IMMUNIS HGF EIA (Institute of Immunology, Tokyo, Japan) og Quantikine VEGF ELISA (R Sigma, St. Louis, MO), som tidligere beskrevet [10]. Hvert forsøg blev udført med tredobbelte prøver.

Antistoffer og Western blotting

Protein portioner (25 ug hver) blev opløst ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (Bio-Rad, Hercules, CA) og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Bio-Rad). Efter vask 4 gange, blev membranerne inkuberet med Blokering One (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan) i 1 time ved stuetemperatur (RT) og natten over ved 4 ° C med primære antistoffer til p-actin (13E5), Met (25H2), phospho-MET (anti-p-MET, Y1234 /Y1235, 3D7), p-EGFR (Y1068), AKT eller p-AKT (S473), mTOR, p-mTOR (S2448), p70S6K, pp70S6K ( T389), 4E-BP1, p4E-BP1 (T37 /46) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), human EGFR (1 ug /ml), human /mus /rotte ERK1 /ERK2 (0,2 ug /ml), og p-ERK1 /ERK2 (T202 /Y204, 0,1 mikrogram /ml) (R 0,01 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

mTOR-hæmmere undertrykker levedygtighed

EGFR

mutant lungekræft celler i tilstedeværelse af HGF.

PC-9 og HCC827 er humane lunge adenocarcinom cellelinjer med sletninger af exon 19 i

EGFR

, hvilket resulterer i konstitutiv aktivering af dette protein. Disse cellelinjer var følsomme over for erlotinib, mens HGF inducerede erlotinib modstand (fig. 1). Behandling med enten mTOR inhibitor (temsirolimus eller everolimus) alene discernibly undertrykt levedygtighed disse cellelinier. Under disse eksperimentelle betingelser havde HGF ikke nedsætte følsomheden af ​​disse cellelinier til hvert lægemiddel. Disse resultater tyder på, at mTOR-hæmmere effektivt kan styre væksten af ​​

EGFR

mutant lunge kræftceller, uanset tilstedeværelsen af ​​HGF, som ville fremkalde EGFR-TKI modstand.

PC-9 eller HCC827 celler blev inkuberet med eller uden erlotinib, temsirolimus, eller everolimus, i nærvær eller fravær af HGF (20 ng /ml) i 72 timer. Derefter blev cellelevedygtighed bestemt ved MTT-assayet. Barer viser SD. De viste data er repræsentative for 5 uafhængige forsøg med lignende resultater.

Vores tidligere undersøgelse viste, at hos patienter med NSCLC, er HGF primært påvist i kræftceller med erhvervet resistens over for EGFR-TKI’er, tyder på, at produktionen af ​​HGF af disse celler sker hovedsagelig via en autokrin mekanisme. For yderligere at undersøge virkningen af ​​mTOR-hæmmere på autokrine HGF produktion, genereret vi stabile

HGF

-genet transfektanter i PC-9-celler (PC-9 /HGF). PC-9 /HGF celler udskilles høje koncentrationer af HGF (28 ± 1 ng /48 h), mens koncentrationerne af HGF udskilles af PC-9- og kontrol vektor-transficerede PC-9 /VEC celler var under detektionsgrænsen. Derudover PC-9 /HGF-celler blev resistente overfor erlotinib (fig. 2). Vi fandt, at temsirolimus eller everolimus discernibly reduceret levedygtigheden af ​​både PC-9 /Vec og PC-9 /HGF celler i samme omfang, mens kombinationen af ​​mTOR-hæmmer plus erlotinib havde ingen effekt i PC-9 /VEC cellerne i nærvær af HGF, hvilket indikerer, at mTOR-hæmmere ikke yderligere bevidstgøre disse celler til erlotinib

in vitro

(fig. S1). Banke ned af mTOR af siRNA resulterede i inhibering af levedygtighed PC-9 /Vec og PC-9 /HGF-celler med 30% (Fig S2 B), hvilket indikerer, at inhiberede cellelevedygtighed ved temsirolimus selv i nærvær af HGF skyldes mTOR inhibering. Vi udførte også flowcytometri under anvendelse af Annexin V og fandt, at temsirolimus ikke inducerede mærkbar apoptose i PC-9 /Vec eller PC-9 /HGF-celler (Fig. S3). Disse resultater viser, at mTOR-hæmmere, når det anvendes som enkelte agenter, undertrykke væksten af ​​

EGFR

mutant lunge kræftceller via hæmning af spredning frem induktion af apoptose.

PC-9 /Vec og PC -9 /HGF-celler blev inkuberet med erlotinib (A), temsirolimus (B), eller everolimus (C) i 72 timer. Derefter blev cellelevedygtighed bestemt ved anvendelse af MTT-assayet. Barer viser SD. (D) PC-9 /Vec og PC-9 /HGF-celler blev behandlet med eller uden erlotinib (0,3 uM), temsirolimus (0,3 uM), eller everolimus (0,3 uM) i 4 timer. Cellelysaterne blev høstet og underkastet western blotting. De viste data er repræsentative for 3 uafhængige forsøg med lignende resultater.

mTOR-hæmmere undertrykker p70S6K og 4EBP1 fosforylering selv ved tilstedeværelse af HGF

At udforske den molekylære mekanisme, hvormed mTOR-hæmmere undertrykt cellelevedygtighed selv i nærvær af HGF, undersøgte vi proteinekspression og phosphoryleringsstatus af EGFR, MET, og deres downstream molekyler (ERK1 /2, PI3K /AKT, p70S6K, og 4EBP1) i PC-9 /Vec og PC- 9 /HGF-celler ved Western blotting (fig. 2D). PC-9 /VEC celler udtrykte EGFR og mødte proteiner, mens kun EGFR var discernibly phosphoryleret. Erlotinib inhiberede bemærkelsesværdigt phosphorylering af EGFR, samt downstream ERK1 /2 og AKT, men det marginalt inhiberes p70S6K phosphorylering. Mens hverken temsirolimus eller everolimus påvirkede phosphorylering af EGFR, MET, ERK1 /2 eller AKT, de hæmmede fosforylering af p70S6K og 4EBP1, downstream molekyler af mTOR.

I PC-9 /HGF celler, MET var også phosphoryleret, formodentlig på grund af HGF, der blev produceret på en autokrin måde. Erlotinib hæmmede EGFR fosforylering, men det gjorde ikke bemærkelsesværdigt hæmme phosphorylering af MET, AKT, p70S6K eller 4EBP1. Mens hverken temsirolimus eller everolimus inhiberede phosphorylering af EGFR, MET, ERK1 /2, eller AKT, de markant inhiberede phosphorylering af p70S6K og 4EBP1. Disse resultater indikerer, at mTOR inhibitorer undertrykker phosphorylering af downstream molekyler af mTOR, uanset tilstedeværelsen af ​​HGF.

mTOR inhibering undertrykker HGF-induceret vækst af erlotinib-resistente tumorer

in vivo

Vi næste vurderet, om mTOR-hæmmere vil styre væksten af ​​

EGFR

mutant lungekræft celler med HGF-udløst EGFR-TKI-modstand

in vivo

. Oral administration af erlotinib undertrykte væksten af ​​PC-9 /VEC-tumorer, men ikke PC-9 /HGF tumorer, hvilket indikerer modstand af pc-9 /HGF tumorer til erlotinib

in vivo

(Fig. 3A). På den anden side, intravenøs administration af temsirolimus undertrykte væksten af ​​både PC-9 /vec tumorer og PC-9 /HGF tumorer. Disse resultater viste, at mTOR inhibering kan være nyttig til bekæmpelse af væksten af ​​HGF-inducerede tumorer

in vivo

.

(A) SCID-mus bærende PC-9 /Vec eller PC-9 /HGF tumorer blev indgivet 25 mg /kg erlotinib gang dagligt eller 50 mg /kg temsirolimus gang om ugen fra dag 8 til dag 20. Tumorvolumen blev målt ved anvendelse calipre på de angivne dage. Middelværdi ± SE tumorvolumener er vist for grupper af 5 mus. * P 0,01 (envejs ANOVA). De viste data er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter med lignende resultater. (B) SCID-mus med PC-9 /Vec eller PC-9 /HGF-tumorer blev indgivet 25 mg /kg erlotinib gang dagligt i 4 dage eller 50 mg /kg temsirolimus gang fra dag 8. Fire timer efter endelig erlotinib administration, tumorer var høstet, og de relative niveauer af proteiner i tumoren lysater blev bestemt ved western blotting.

Vi vurderede endvidere de molekylære mekanismer, som temsirolimus inhiberede væksten af ​​PC-9 /HGF-tumorer. Western blot-analyser afslørede, at erlotinib markant inhiberede phosphorylering af EGFR, ERK1 /2, og AKT, og lidt undertrykt phosphoryleringen af ​​p70S6K i PC-9 /Vec-tumorer (fig. 3B). Mens erlotinib bemærkelsesværdigt hæmmet EGFR fosforylering, kun det lidt hæmmet ERK1 /2 og p70S6K fosforylering, hvorimod det ikke hæmme AKT fosforylering i PC-9 /HGF-tumorer. På den anden side, selvom temsirolimus ikke mærkbart påvirker phosphorylering af EGFR eller ERK1 /2 i både PC-9 /Vec tumorer og PC-9 /HGF tumorer, det bemærkelsesværdigt hæmmede p70S6K phosphorylering, hvilket tyder virkemåden af ​​dette stof som et mTOR-hæmmer.

Interessant temsirolimus hæmmede lidt den Akt fosforylering i PC-9 /HGF tumorer, men det øgede AKT fosforylering i PC-9 /HGF celler

in vitro

tilstand (fig. 2D). For at klarlægge årsagen til denne uoverensstemmelse, vi undersøgte tidsforløbet for mTOR-hæmmer behandling på AKT fosforylering

in vivo

(Fig S4). Vi fandt, at i overensstemmelse med resultaterne af

in vitro

eksperimenter blev AKT phosphorylering i tumorerne steg 4 timer efter temsirolimus behandling. Men så er niveauet af AKT-phosphorylering blev sænket, og det var lidt inhiberet ved 96 timer efter behandlingen, i overensstemmelse med resultaterne vist i fig. 3B. Derfor forskellen på resultaterne mellem fig. 2D og fig. 3B var på grund af forskellen i timingen prøverne blev høstet.

mTOR hæmning undertrykker angiogenese

in vivo

Vi har også undersøgt tumorcelleproliferation (Ki-67) og angiogenese (CD31) ved immunhistokemi. Erlotinib behandling markant hæmmet tumorcelleproliferation og angiogenese i PC-9 /VEC xenografter, mens erlotinib ikke påvirkede celledeling eller angiogenese betydeligt i PC-9 /HGF xenografter (Fig. 4). I modsætning hertil temsirolimus markant hæmmet celledeling og angiogenese i både PC-9 /Vec og PC-9 /HGF tumorer. Disse resultater antyder, at temsirolimus hæmmer væksten af ​​PC-9 /HGF tumorer (i det mindste delvist) ved at hæmme angiogenese.

SCID mus med PC-9 /Vec eller PC-9 /HGF tumorer blev indgivet som beskrevet i fig. 3B. Fire timer efter den endelige administration af erlotinib blev tumorer høstet, og tumorcelleproliferation (A, B: Ki-67) og angiogenese (C, D: CD31) blev bestemt ved immunohistokemi. B og D viser kvantificering af positive celler.

* P 0,01, (en-vejs ANOVA). Barer viser SD.

For yderligere at udforske de molekylære mekanismer, som hæmmede temsirolimus angiogenese, vi undersøgte dens virkning på tumor celle produktion af VEGF, en fremtrædende pro-angiogene molekyle. Både PC-9 og PC-9 /Vec celler konstitutivt producerede detekterbare niveauer af VEGF, der blev stimuleret af HGF (fig. 5A). I overensstemmelse med disse observationer, PC-9 /HGF-celler producerede højere niveauer af VEGF end PC-9 og PC-9 /Vec celler. Temsirolimus undertrykt VEGF-produktion i disse cancerceller i nærvær eller fravær af HGF. Knock ned af mTOR af siRNA resulterede i hæmning af VEGF produktion af PC-9 /Vec og PC-9 /HGF celler, ligesom temsirolimus behandling (Fig S2). Disse resultater viser, at inhiberede VEGF produktion ved temsirolimus selv i nærvær af HGF skyldes mTOR hæmning. Vi vurderede også den direkte virkning af temsirolimus på levedygtigheden af ​​endotelceller

in vitro

. Temsirolimus inhiberede ikke konstitutiv levedygtighed HMVEC celler i medium med 10% FBS alene (figur 5B). VEGF og HuMedia-MVG, der indeholder EGF og fibroblastvækstfaktor-2 (FGF-2), øget levedygtighed HMVECs. Temsirolimus, ved koncentrationer på 1 nM og højere, hæmmede denne stigning i levedygtighed. Disse resultater indikerer, at temsirolimus inhiberer angiogenese ved flere mekanismer.

(A) Tumorceller blev inkuberet med eller uden HGF (50 ng /ml) i nærvær af forskellige koncentrationer af temsirolimus i 48 timer. Derefter blev supernatanter høstet, og antallet af tumorceller blev talt. koncentration VEGF i supernatanterne blev bestemt ved ELISA. VEGF-niveauer korrigeret af tumorcellen nummer vises. (B) HMVECs blev inkuberet i RPMI-1640-medium med 10% FBS (kontrol), RPMI-1640-medium med 10% FBS plus VEGF, eller HuMedia-MVG med forskellige koncentrationer af temsirolimus i 72 timer. Derefter blev cellelevedygtighed bestemt ved anvendelse af MTT-assayet. Barer viser SD. De viste data er 2 uafhængige forsøg med lignende resultater.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi viste, at mTOR-hæmmere undertrykte væksten af ​​

EGFR

mutant lunge kræftceller, selv ved tilstedeværelse af HGF,

in vitro

in vivo

. Vore resultater indikerer også, at mTOR inhibitorer undertrykker angiogenese ved inhibering VEGF-produktion og endotel proliferation stimuleret med forskellige pro-angiogene faktorer. Disse observationer antyder, at mTOR-hæmmere, som monoterapeutisk midler, er nyttige til styring af progressionen af ​​

EGFR

mutant lungekræft og HGF-udløst modstand mod EGFR-TKI’er.

HGF, også kaldet spredningsfaktor , er et multifunktionelt cytokin [31]. Nylige undersøgelser viste, at HGF er involveret i carcinogenese, invasion /motilitet, EMT, angiogenese og metastase i lungekræft, og det er derfor forbundet med dårlig prognose af patienterne [32]. Vi har tidligere rapporteret, at HGF inducerer EGFR-TKI-resistens i

EGFR

mutant lungekræft celler ved at genoprette MET /PI3K /AKT-vejen signalering [10]. HGF Overekspression er involveret, ikke kun i erhvervet resistens, men også iboende modstand mod EGFR-TKI’er [21]. Desuden HGF stimulerer VEGF-produktion af

EGFR

mutante lungecancerceller, samt letter angiogenese og derved fremme tumor progression [24]. HGF overekspression er ofte co-opdaget med

EGFR

-T790M gatekeeper mutation i erhvervet resistente tumorer [9], [11], [21]. HGF inducerer resistens over for irreversibel EGFR-TKI’er og mutant EGFR-selektive TKI’er [33], som er udviklet til at overvinde T790M-medieret EGFR-TKI modstand. De seneste kliniske forsøg med irreversible TKI monoterapi ikke kunne påvise et objektivt respons i

EGFR

mutant lungekræftpatienter, der var refraktære over for behandling med den reversible EGFR-TKI’er-gefitinib og erlotinib [34]. Disse resultater tyder på, at sameksistensen af ​​ændret HGF signalering bidrager til den ugunstige reaktion på irreversibel EGFR-TKI’er hos disse patienter [32]. Desuden er tilstedeværelsen af ​​HGF accelererer væksten af ​​allerede eksisterende EGFR-TKI-resistente kloner, som skjuler

MET

amplifikation [35]. For nylig HGF blev rapporteret at inducere resistens mod ALK selektive inhibitorer i

EML4-ALK

lungekræft [36] og BRAF inhibitorer i

BRAF

mutant melanom [37]. En sådan akkumulere data viser, at HGF er et fælles mål for at overvinde modstand mod målrettede lægemidler i onkogen-afhængige tumorer.

Vores resultater tyder også på, at mTOR-hæmmere har fordel af flere mekanismer til at undertrykke væksten af ​​EGFR-TKI-resistens udløst af HGF i

EGFR

mutant lunge kræftceller. For eksempel, disse inhibitorer sandsynligvis blok mTOR /p70S6K /4E-BP1 overlevelsessignaler, der normalt beskæftiger under PI3K /AKT aktivering i kræftceller. Den PI3K /AKT /mTOR pathway bidrager til overlevelse

EGFR

mutant lunge kræftceller [38], [39]. Vi har tidligere rapporteret, at denne vej er også afgørende for at erhverve HGF-udløst modstand mod EGFR-TKI’er i

EGFR

mutant lunge kræftceller [40]. I den foreliggende undersøgelse, både temsirolimus og everolimus delvist undertrykt phosphoryleringen af ​​p70S6K og 4E-BP1, samt inhiberes overlevelse

EGFR

mutante cancerceller

in vitro

. Således mTOR inhibitorer opnå vækstinhibering ved at undertrykke begge overlevelse signaler fra EGFR og modstandstermometre signaler fra MET i cancerceller.

En anden mulig mekanisme er inhibering af angiogenese. Nylige studier har vist, mTOR-medieret signalering stimulerer HIF-1α transskription, som regulerer VEGF, via 4E-BP1 phosphorylering [41]. mTOR inhibitorer undertrykker HIF-1α transskription og derved inhibere VEGF-produktion [28], [29], [41] – [43]. Vi har tidligere rapporteret, at HGF aktiverer MET /GAB1 vej og øger VEGF produktion af

EGFR

mutant lunge kræftceller [24]. I den foreliggende undersøgelse, bekræftede vi dette fund og videre vist, at mTOR-hæmmere undertrykt både konstitutive VEGF produktion og HGF-stimuleret VEGF produktion. Desuden fandt vi, at mens mTOR-hæmmere ikke påvirkede levedygtighed stimulerede endothelceller, de hæmmede endotel proliferation stimuleret af forskellige pro-angiogene faktorer, herunder VEGF. mTOR aktiveres efter indgreb af flere receptortyrosinkinaser såsom VEGFR-2, EGFR, og FGFR-1 [41]; Derfor kan mTOR inhibitorer ophæve stimuleringen forårsaget af flere pro-angiogene faktorer i endotelceller. Derfor kan mTOR-hæmmere undertrykke angiogenese med mindst 2 former for handlinger. For det første kan de inhiberer VEGF-produktion, selv i nærvær af HGF. For det andet kan de hæmme endotelcelleproliferation, der stimuleres af forskellige pro-angiogene faktorer.

Resultater af nyere kliniske forsøg med målrettede lægemidler indikerer vigtigheden af ​​patientudvælgelse. For eksempel svarprocent på gefitinib var kun 10-20% i uselekterede NSCLC [44], men det var omkring 80% i

EGFR

mutation-positiv NSCLC [43]. Den progressionsfri overlevelse på

EGFR

mutant lungekræftpatienter var også meget længere end for ikke-valgte NSCLC patienter [45]. Mens et stort antal mTOR-hæmmere er blevet udviklet og er ved at blive evalueret i kliniske forsøg i lungekræft, ingen af ​​sirolimus, temsirolimus eller everolimus, når det anvendes som monoterapeutisk agenter, viser kliniske effekt i uselekterede NSCLC [46] [47]. Desuden nylige undersøgelser af mTOR-hæmmere kombineret med EGFR-TKI heller ikke godtgjort klinisk fordel i uselekterede NSCLC [46], [48] – [50]. Vores nuværende undersøgelse er prækliniske, og vi viste, at mTOR-hæmmere viste betydelig effekt i lungekræft celler med HGF-medieret resistens over for EGFR-TKI modstand både

in vitro

in vivo

. Dong et al. også rapporteret anti-tumor aktiviteten af ​​mTOR-hæmmere mod EGFR-TKI-resistente

EGFR

mutant lungekræft celler med T790M gatekeeper mutationen [51]. Både HGF og T790M gatekeeper mutationer ofte påvist i EGFR-TKI tumorer, hvor de bidrager til modstand. Derfor er disse observationer illustrerer nødvendigheden af ​​kliniske forsøg med mTOR-hæmmere i

EGFR

mutant lungekræftpatienter, der bliver resistente over for gefitinib og erlotinib. Da HGF giver resistens over for målrettede lægemidler i flere tumortyper, kliniske forsøg med mTOR-hæmmere er berettiget.

Støtte Information

Figur S1.

mTOR-hæmmere ikke yderligere bevidstgøre

EGFR

mutant lungekræft celler til erlotinib

in vitro

. PC-9 /Vec celler blev inkuberet med eller uden temsirolimus (A) eller everolimus (B), i nærvær eller fravær af HGF (20 ng /ml) og erlotinib (0,3 uM) i 72 timer. Derefter blev cellelevedygtighed bestemt ved MTT-assayet. Barer viser SD. De viste data er repræsentative for 3 uafhængige forsøg med lignende resultater

doi:. 10,1371 /journal.pone.0062104.s001

(TIF)

Figur S2.

Knock-down af mTOR vækst hæmmet celle og VEGF produktion.