PLoS ONE: Expression Mønstre af ikke-kodende splejsede Udskrifter fra Menneskelig Endogen Retrovirus HERV-H Elementer i Colon Cancer

Abstrakt

Baggrund

Up-regulering af de mest udbredte H familie menneskelige endogene retrovirus (HERV-H), især env-relaterede transkripter, korrelerer med tyktarmskræft. Men udtryk mønster af splejset ikke-kodende udskrifter af HERV-H er ikke klart.

Metode /vigtigste resultater

I denne undersøgelse udtryk for HERV-H splejsede transkripter i tyktarmskræft blev undersøgt ved en RT-PCR-strategi under anvendelse af primere rettet mod tRNA

Hans primer-bindingssted og R region i 3’lange terminale gentagelse (LTR), efterfulgt af kloning og sekventering af amplikoner. Sekvenser blev derefter tildelt til individuel HERV-H loci ved at anvende private nukleotidforskelle mellem loci. Forskellige ekspressionsmønstre af HERV-H splejsede udskrifter fra forskellige aktive elementer blev fundet i tyktarmskræft cellelinjer HT29, LS 174T, RKO, SW480 og SW620. Desuden blev udtrykket mønstre i SW480 og RKO ændret væsentligt ved demethylering behandling. Interessant, blev flere HERV-H elementer fundet at være transkriptionelt aktiv i tyktarmen tumorvæv end i tilstødende normale væv (14

vs.

7).

Konklusioner /Betydning

dette er den første forskning for at undersøge karakteren af ​​ekspression af ikke-kodende splejsede transkripter af HERV-H elementer i tyktarmskræft. Expression mønstre af HERV-H splejsede transkripter afveg blandt tyktarmskræft cellelinjer og kunne blive påvirket af genomisk DNA methylering niveauer. Hvad vigtigere er, udover den almindeligt accepterede opfattelse af opregulering af HERV-H ekspression i colon tumorvæv, fandt vi mere aktiv HERV-H loci i colon tumor i sammenligning med tilstødende normale væv

Henvisning:. Liang Q Xu Z, Xu R, Wu L, Zheng S (2012) Expression Mønstre af ikke-kodende splejsede Udskrifter fra Menneskelig Endogen Retrovirus HERV-H elementer i tyktarmskræft. PLoS ONE 7 (1): e29950. doi: 10,1371 /journal.pone.0029950

Redaktør: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Tyskland

Modtaget: September 15, 2011; Accepteret: December 7, 2011; Udgivet: januar 6, 2012 |

Copyright: © 2012 Liang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af internationalt samarbejde for Videnskab og Teknologi Key Foundation of Zhejiang-provinsen (2009C14010), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (R2090353), National Natural Science Foundation of China (30.973.382 og 81.101.488). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

humane endogene retrovirus (HERVs) udgør 8% af det menneskelige genom [1]. De er udledt at stamme fra kim-celle infektion med eksogene retrovirus under primat evolution [2]. Provirusstrukturen for Herv elementer består hovedsageligt af 5 ‘LTR-

gag

–

pro

–

pol

–

env

-3′ LTR, i som de fire gener (

gag

: gruppe-specifikt antigen,

pro

: protease,

pol

: polymerase, og

env

: kuvert) indkode strukturelle /funktionelle proteiner er essentielle for en replikationskompetent retrovirus, og de lange terminale gentagelser (LTR) i begge ender adskiller HERVs fra andre retrotransposons såsom lange afbrudt nukleare elementer (linjer). De fleste af resterne af HERVs simpelthen isoleret LTR kopier, med det indre sekvens er blevet tabt under integration eller via homolog rekombination. Herv Grupperne defineres efter forskellige kriterier, såsom homogenitet til deres exogene modstykker, sekvenslighed af

pol

gener, og primerbindingsstedet (PBS) umiddelbart nedstrøms for 5′-LTR. H familie HERV (HERV-H) indeholder en PBS med en sekvens svarende til human tRNA

His. Der er omkring tusind HERV-H elementer i hele det humane genom, og de fleste af dem (800-900) mangler næsten hele

env

region [3], [4]. Det er blevet rapporteret, at kun 18 HERV-H elementer i det humane genom er relativt komplet [5], og kun tre blev identificeret til at indeholde intakte

env

åbne læserammer (ORF’er) [6].

Selv om de fleste HERV-H elementer er strukturelt ufuldstændigt på grund af mutation og sletning under evolutionen, er der hundredvis af dem støttemure komplette 5 ‘og 3’ LTR’er og en PBS-tRNA

Hans umiddelbart nedstrøms for 5′ LTR [7]. Ekspressionen af ​​Herv elementer er for det meste under kontrol af deres LTR’er [8]. En komplet LTR element har en struktur af U3-R-U5 (5 ‘→ 3′), der indeholder både transkription igangsættende og afslutning signaler. Transkriptionen af ​​Herv elementer normalt starter fra R-region i 5′-LTR og ophører ved slutningen af ​​R-region i 3’-LTR. Det foreslås også, at celletype-afhængig ekspression af Herv elementer, der normalt styres af regulatoriske sekvenser lokaliseret hovedsagelig i U3-regionen [9].

På grund af den immunosuppressive ejendom i kappeproteinet af HERV-H, mange undersøgelser fokuseret på de

env

-relaterede udskrifter [10], og dem, ikke

env

-relaterede udskrifter sjældent opmærksom på. Opregulering af den mest rigelige H familie HERV, især

env

-relaterede udskrifter, er blevet rapporteret at være forbundet med kolorektal cancer [5], [11], [12]. I vores tidligere undersøgelse, observerede vi, at der var mange splejsede ikke-kodende RNA transkriberet fra HERV-H elementer, både i normale og cancerøse colonvæv, samt kolon cancercellelinjer. Imidlertid ekspressionsmønsteret for de splejsede ikke-kodende transkripter fra HERV-Hs er ikke klart. I løbet af undersøgelser af de tre nyligt identificerede HERV-H-relaterede gener [13], [14], [15] i vores laboratorium, bemærkede vi, at den samlede udtryk for HERV-H elementer i tyktarmskræft var kompleks og forskellige mellem tumorprøver og tilstødende normale prøver. Vi observerede også, at mange

env

-deleted HERV-Hs var transkriptionelt aktive, og mange splejset ikke-kodende RNA transkriberet i både tumor og normale væv samt cancercellelinjer. I denne undersøgelse indledte vi den første undersøgelse for at finde ud af den nøjagtige loci af de mest aktive HERV-H elementer tyktarmskræft.

Resultater

RT-PCR-sekventering strategi til at tilslutte HERV -H ikke-kodende transkripter

Da der er over tusind medlemmer af HERV-H familie hele det humane genom, med sekvenser af lav kompleksitet og homologe med hinanden, er det vanskeligt at studere deres transkription profil ved tager hvert medlem i betragtning. For at profilere udtryk for HERV-H i tyktarmskræft cellelinjer, kolon tumor og tilstødende normale væv, og for at identificere den nøjagtige loci af de mest aktive HERV-H elementer, vi udviklet en RT-PCR-kloning strategi for at tilslutte en udvalgt gruppe af HERV-H-relaterede udskrifter. Transkriptionen af ​​Herv elementer typisk startet fra 5’R region og termineret ved enden af ​​3’R region [16]. Vi designede primerne ved at henvise til sekvensen af ​​HERV-H konsensus konstrueret ved Jern

et al.

[5], med den fremadrettede primer rettet mod PBS-tRNA

Hans nedstrøms for 5′-LTR og den reverse primer målretning R-regionen af ​​3 ‘LTR (fig. 1A). Dette par primere skulle generere PCR-produkter fra HERV-H-udskrifter af blandede størrelser. Følgelig blev de samlede RT-PCR-produkter klones ind i pGEM-T Easy vektorer og transficeret ind

E. coli

. Mere end tredive kolonier af hver prøve blev tilfældigt udvalgt og plasmider blev derefter sekventeret. Sekventering resultater blev tildelt specifik HERV-H loci baseret på private nukleotid forskelle mellem de enkelte loci (en eller flere nukleotider, der er karakteristiske for en HERV-H locus). Sekvensbestemmelsesresultater resultaterne af alle de tilfældigt udvalgte kolonier viste, at ingen indsatse var fra ikke-HERV-H udskrifter, der viser vores strategi fungerede godt.

A. Skematisk demonstration af primeren steder. TSS, transkriptionsstartsitet; TTS, transkriptionstermineringssted. B. RT-PCR blev udført til påvisning HERV-H splejsede transkripter i kolon cancercellelinier med /uden demethylering /histonacetylering behandling ved hjælp af DNA-demethylering agent DAC og histondeacetylaseinhibitoren TSA. H2O og genomisk DNA-blandingen (gDNA mix) blev anvendt som kontroller. Genomisk DNA blanding produceret bands adskilte fra cDNA prøver, der omvendt blev transkriberet fra DNase-behandlet RNA.

Angivelse af HERV-H splejsede transkripter i tyktarmskræft cellelinjer og ændret udtryk i respons på DNA demethylering behandling

RT-PCR-analyser blev udført på fem tyktarmskræft cellelinjer, herunder HT29, LS 174T, RKO, SW480 og SW620. Forskellige båndmønstre blev opnået fra disse cellelinier (fig. 1B til venstre). Et relativt lavere HERV-H ekspression blev observeret i RKO. Det er blevet rapporteret, at der er DNA-methylering på globalt genomisk niveau ved at målrette repetitive sekvenser [17], så vi yderligere undersøgt, om demethylering behandling ville ændre transkriptionen mønster af HERV-H elementer. Cancerceller blev behandlet med DNA-methylering og histondeacetylaseinhibitorer (DAC og TSA henholdsvis). RT-PCR-resultater viste, at ekspressionsmønstre af HERV-H blev ændret betydeligt i SW480 og RKO celler (Fig. 1B højre). Disse resultater antydede, at den epigenetiske forbindelse med et genom påvirkede ekspressionen af ​​nogle af de HERV-H elementer.

RT-PCR-produkt af hver tyktarmskræft cellelinien blev yderligere analyseret ved sekventering efter kloning. Sekventering resultater blev tildelt genomisk loci ved Blat søgninger mod det humane genom samling (hg19). Genomiske DNA-sekvenser blev derefter hentet og analyseret med RepeatMasker at bestemme HERV-H-sekvenser. Kun et begrænset antal HERV-H elementer fandtes at være transskriptionelt aktiv i hver af disse cellelinier, med seks loci (syv elementer) i HT29 og to eller tre i hver af de andre cellelinier (tabel 1).

Karakterisering af de aktive HERV-H grundstoffer og deres splejsede udskrifter i colon cancer cellelinjer

Pair-kloge alignments blev udført med 9,0 kb HERV-H konsensus bygget af Jern

et al.

at bestemme fragment-sletning mønstre af hver HERV-H element. Alignment Resultaterne viste alle HERV-H elementer aktive i colon cancer cellelinjer var strukturelt mangelfulde, med den længste ene er 6488 bp lang (tabel 1 og fig. S1). Seks fragmenter blev fundet at være almindeligt slettes i disse elementer, herunder en kort en i

gag

region, fire i

pol

region, og næsten hele

env

region (fig. 2A). Der var nogle undtagelser. Elementet placeret på 16q24.1 (aktiv i HT29) og én placeret på 22q11.1 (aktiv i LS 174T) var overordentligt kort (Fig. 2B). Den ene på 16q24.1 var kun 3185 bp i længde, med hele

gag

region og et stort fragment omfatter den

pol

og

env

slettet. Den ene på 22q11.1 var 3842 bp lang, med næsten hele

pol

env

regioner slettet. De fleste af de amplikoner ( 90%) ud fra LS 174T indeholdt sekvenser svarende til splejsede RNA’er fra 3,8 kb HERV-H element ved 22q11.1, hvoraf de fleste ( 60%) formere blev splejset. Interessant to HERV-H elementer placeret på 1p32.3 (2,8 kb separeret) viste sig at være aktive i HT29-celler, der gør brug af 5′-LTR af det første HERV-H og 3′-LTR af den anden (repræsentativ transkript sekvens JK017392). Sekvensanalyse afslørede, at 5 ‘LTR manglede fra sidstnævnte 2.298-bp HERV-H element (fig. 2C).

A. Skematisk af de seks almindeligt slettede regioner i de aktive HERV-H elementer i tyktarmskræft cellelinjer. B. Skema for de to ekstraordinært korte HERV-H elementer og transskriptioner. Parvise alignments for hver HERV-H element blev udført med HERV-H konsensus bygget af Jern P,

et al

. De forkortede alignment resultater blev vist at angive de manglende områder præcist. Farvetæthed repræsenterer omfanget af homologi med HERV-H konsensus. Grå områder repræsenterer udgår regioner i HERV-H elementer i forhold til HERV-H konsensus. Splejset udskrifter vises over justering resultater i overensstemmelse hermed. Tykke søjler repræsenterer exoner, og linjer repræsenterer introns. Regioner i LTR, pre-gag,

gag

,

pro

,

pol

og

env

er mærket nedenfor. C. Skema af de to combinedly aktive HERV-H elementer placeret på 1p32.3 i HT29.

Flere HERV-H elementer var transkriptionelt aktive i tyktarmen tumor end i tilstødende normale væv

Ekspression af HERV-H transkripter i colon tumor og tilstødende normale væv blev analyseret ved RT-PCR. En lille forskel mellem RT-PCR-produkter af colon tumor og tilstødende normale prøver blev iagttaget, med nogle produkter af større størrelser stede i tumorprøver (Fig. 3). Efter sekventering og sekvensanalyse af PCR-produkterne blev 14 HERV-H elementer fundet at være transskriptionelt aktiv i colon tumorprøver. I modsætning hertil blev kun 7 HERV-H elementer sig at være aktive i de tilstødende normale colon prøver. Nærmere oplysninger om disse HERV-H elementer blev angivet i tabel 2. Sekvensanalyse af parvis alignment mod HERV-H konsensus viste, at alle de aktive HERV-H elementer var strukturelt ufuldstændige, med seks fragmenter almindeligvis slettet som angivet i fig. 2A (. Fig S2)

M, DL2000 stigen.; T, tumor; N, normal.

Fire HERV-H elementer, som ligger på 1q42.2, 16q24.1, 19q13.31 og 5q23.2 henholdsvis var aktive i både tumor og tilstødende normale væv . Vi analyserede endvidere udskrift overflod fra hver aktiv HERV-H element. Interessant, tre af de almindeligt aktive elementer (placeret på 1q42.2, 16q24.1 og 19q13.31) hver bidrog til mere end 10% af de udskrifter i både tumor og tilstødende normale prøver. Der var et andet element, som ligger på 1p31.3, der producerer mere end 10% af de udskrifter i tumor. De fire mest aktive elementer i tumorprøven, dvs. dem, der findes på 1q42.2, 16q24.1, 19q13.31 og 1p31.3 i alt bidraget til 68,89% af udskrifter i tumoren prøven. Derimod er de tre mest aktive elementer i normale prøver (placeret på 1q42.2, 16q24.1 og 19q13.31) bidrog til 85,71% af de samlede udskrifter. Disse resultater viste, at der var flere HERV-H elementer aktive i tyktarmen tumorvæv end i tilstødende normale væv. Desuden blev de fleste transkripter i tilstødende normale prøver fremstillet af færre HERV-H elementer sammenlignet med tumorprøver.

Discussion

På grund af overflod af HERV-H elementer i det humane genom og deres høje sekvens lighed med hinanden, synes der ikke at være nogen hensigtsmæssig metode til at undersøge hele genomet transskription profil HERV-H elementer, mens på samme tid at tage hvert element i betragtning individuelt. Selvom resultaterne af denne undersøgelse ikke repræsenterede den samlede faktiske genom-dækkende udtryksmæssige profil HERV-H elementer, tog vi fordel af PCR berigelse strategi for at tilslutte de mest aktive HERV-H elementer, der producerede udskrifter, der indeholder PBS-tRNA

Hans og 3’R regioner, og med held identificerede den nøjagtige provirale loci af disse elementer i colon cancer cellelinjer og vævsprøver. Expression mønstre af HERV-H splejsede udskrifter fra HERV-H elementer var forskellige blandt kolon tumor, tilstødende normale prøver, og tyktarmskræft cellelinjer.

Expression mønstre af HERV-H splejsede udskrifter fra HERV-H elementer var forskellige blandt de testede fem kolon cancercellelinier, dokumenteret ved begge gelelektroforese af RT-PCR-produkter (fig. 1B venstre) og sekventering af amplikoner efter kloning (tabel 1). Sekvensanalyse ved at sammenligne dem med den beregnede HERV-H konsensus viste, at de aktive HERV-H elementer, der findes i denne undersøgelse blev alle strukturelt ufuldstændig vis udstrækning. Dette kan også udledes af de længder, som alle var meget kortere end fuldlængde HERV-H konsensus (9,0-kb). Båndmønstrene var forskellige mellem SW480 og SW620 celler. Selv om de stammer fra de primære og metastatiske tumorer i samme patient, kan denne forskel mellem SW480 og SW620 være lige skyldes langtidsdyrkning. Ligeledes kan det begrænsede antal aktive HERV-H elementer i hver cellelinie også skyldes langtidsdyrkning i definerede

in vitro

betingelser. Det er også interessant, at ved demethylering behandling med DNA methylering og histondeacetylaseinhibitorer, ekspressionsmønstre i RKO og SW480-celler blev ændret betydeligt, hvilket antyder, at transskription af nogle HERV-H elementer reguleres epigenetisk.

Selv om ingen åbenlyse forskel blev observeret i RT-PCR-produktbånd mellem tumor og tilstødende normale prøver, de samlede tal og loci af aktive HERV-H elementer var signifikant forskellige (figur 3;. tabel 2). Syv HERV-H elementer fandtes at være transskriptionelt aktiv i de tilstødende normale colon prøver. Til sammenligning blev 14 elementer fundet at være aktiv i de testede kolon tumorvæv. Angivelse af de tre almindeligt mest aktive elementer ( 10%) syntes at være almindelig; den ene placeret på 1q24.2 producerede 17,78% og 26,19% af produkterne i tumor og normale prøver, og produkter fra den ene placeret på 16q24.1 bestod af 26,67% i tumor og 16,67% i normale prøver, hhv. Interessant, det ene element placeret på 19q13.31 var de mest aktive i tilstødende normale væv, der producerer 42,86% af produkterne, mens kun 11,11% fra tumorprøver tilhørte 19q13.31. Disse resultater viste, at det meste af HERV-H splejsede transkripter i det tilstødende normale colonvæv var fra 19q13.31, mens transkripter i colon tumorvæv involverede flere elementer.

Alle aktive HERV-H elementer, der findes i denne undersøgelse er strukturelt ufuldstændig, med seks fragmenter almindeligt slettet, som er fordelt gennem

gag

,

pol

og

env

regioner (figur 2A.); Alligevel, nogle af dem (40%) tilbageholde formodede åbne læserammer (ORF’er) (tabel 1 og 2;. Fig S1 og S2). Selv om nogle af disse formodede ORF’er er blevet udsat at sekventere deletion i et vist omfang i sammenligning med den tilsvarende region i HERV-H konsensus, syv af de formodede peptidsekvenser (kodet af 6 HERV-H elementer) indeholder konserverede domæner, med én konserveret Protease domæne, en konserveret CREB5 (cAMP responselementet-bindingsprotein 5) domæne og fem konserverede revers transkriptase (RT) -lignende domæner. Interessant, alle de tre almindeligt mest aktive HERV-H elementer (placeret i 1q42.2, 16q24.1 og 19q13.31) i tumor og tilstødende normale væv indeholder formodede ORF’er med konserverede domæner (tabel 2;. Fig S2). Hvorvidt disse ORF’er faktisk producerer proteiner i kolon væv, og hvilken rolle de spiller i colon carcinogenese er spørgsmål, der skal behandles.

Årsagen til den transkriptionelle forskel i HERV-H elementer mellem colon tumor og tilstødende normale væv er fortsat ukendt. Celler i tumor og tilstødende normale prøver er forskellige i mange aspekter. Colon-tumorceller i en prøve er heterogene og omfatter flere faser af cellecyklussen, mens ikke-tumorceller er normalt i G0. Imidlertid har der ikke været nogen undersøgelser for, om HERVs udtrykkes i en cellecyklus-afhængig måde endnu. Endvidere tumorceller er i en mere udifferentieret tilstand sammenlignet med ikke-tumorceller, der minder om tilstanden af ​​embryonale celler. Ekspression af HERVs i en vævsspecifik og udviklingsstadiet-afhængig måde er blevet rapporteret [18]. Der er også fundet Herv elementer at være stærkt udtrykt i reproduktive væv, såsom testis og placenta, som indeholder udifferentierede celler [5], [19]. Hvorvidt HERV-H elementer udtrykt i en differentiering afhængig måde, efterfølgende forårsager forskellen mellem colon tumor og tilstødende normale væv, bør også undersøges. Disse to punkter kan indikere retningslinjer for videre undersøgelse af den mekanisme, hvormed HERV-H elementer er differentielt reguleret mellem colon tumor og tilstødende normalt væv.

Dette er det første forsøg på at undersøge egenskaberne ved ekspression af HERV-H splejset udskrifter i tyktarmskræft. Sammenfattende vores resultater viste, at ekspressionsmønstre af HERV-H elementer afveg blandt tyktarmskræft cellelinjer og kunne blive påvirket af demethylering behandling. Endnu vigtigere, vores resultater viste, at HERV-H udtryk involveret mere aktiv HERV-H elementer i tyktarmen tumor end i tilstødende normale væv.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Zhejiang University, og skriftlige samtykke blev opnået fra alle patienter, der er involveret.

vævsprøver, cellekultur og RNA forberedelse

Colon tumor og tilstødende normale vævsprøver var opnået efter kirurgisk resektion i det andet tilknyttede hospital af Zhejiang University og opbevaret nedfrosset ved -80 ° C indtil RNA ekstraktion. Vævstyper (tumor eller normale) blev vurderet ved histologisk farvning. Cancerceller blev opnået fra American Type Culture Collection og dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum. Totalt RNA blev fremstillet med Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens vejledning. RNA blev altid behandlet med RQ1 RNase-fri DNase (Promega) før cDNA-syntese for at fjerne genomisk DNA-kontaminering.

Demethylering behandling med DNA methylering og histondeacetylaseinhibitorer

Celler blev behandlet med DNA-methylering inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin (DAC; Sigma) og histondeacetylaseinhibitoren Trichostatin A (TSA; Beyotime) som beskrevet [20]: initial behandling med DAC (200 nM) i 48 timer, med lægemiddel og mediet erstattet 24 h efter begyndelsen af ​​behandlingen, efterfulgt af udskiftning af medium indeholdende TSA (300 nM) i yderligere 24 timer. Total RNA fra lægemiddelbehandlede celler eller ikke-behandlede celler blev isoleret med Trizol-reagens og behandlet med DNase før cDNA-syntese.

revers transkription-PCR (RT-PCR)

RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af M-MLV revers transkriptase (Promega) ifølge producentens vejledning. PCR-analyser blev udført med

Taq

DNA-polymerase (Promega) i reaktion, der indeholder 0,2 mmol /l frem og reverse primere hver. Thermal cycler parametre var 94 ° C 5 min, (94 ° C 30 s, 55 ° C 30 s, 72 ° C 90 s) × 36 cyklusser, 72 ° C 10 min. PCR-produkter af hver celleprøve, blev PCR-produkt blanding af seks tumorprøver og PCR-produkt blanding af seks hosliggende normale prøver oprenset med AxyPrep PCR Cleanup kittet (Axygen), klonet ind i pGEM-T-easy-vektor (Promega) og transficeret ind i

E. coli

bakterier. Mere end 30 kolonier fra hver celleprøve og 100 kolonier fra tumor eller normalt væv prøver blev underkastet Sanger-sekventering. Mål for primerne er vist i fig. 1A og deres nukleotidsekvenser er som følger: fremad (rettet mod PBS-tRNA

His): 5′-TGGTGCCGTGACTCGGAT-3 ‘, omvendt (målrettet R region): 5′-GCTGAGTCCGAAAAGAGAGTC-3’. Primerne blev designet ved at henvise til den HERV-H konsensus konstrueret ved Jern

et al.

[5], med “G” i den fremadrettede primer modificeres i overensstemmelse med hele genomet sekvensanalyse på HERV-H-relaterede primer binding sites på vores egne (ikke vist).

Sekvensanalyse

Sekvenser blev søgt med BLAT metode mod humane genom ved hjælp af online-server (https://genome.ucsc.edu/cgi -bin /hgBlat? kommando = start). Sekventering resultater blev udelukket, hvis sekvenserne i-mellem primerne havde mere end fem forskelligheder til genomisk DNA. Genomiske DNA-sekvenser blev hentet fra det humane genom samling (hg19) ved https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway. Sekvenser blev analyseret med værktøjet RepeatMasker på https://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker at identificere gentagne elementer. Parvise alignments blev udført med GeneDoc. ORF forudsigelse blev udført ved hjælp af online-program ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). Derefter formodede aminosyresekvenser blev sprængt mod den ikke-redundante protein-database under anvendelse af online BLASTP programmet (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Sequence indsendelse

i alt 92 nukleotidsekvenser af de nyligt identificerede HERV-H splejsede transkripter er blevet deponeret i dbEST med antallet af JK017330-JK017415 og JK475044-JK475049 (med 7 EST bibliotek tiltrædelse antal LIBEST_027280 – 027.286) tiltrædelse.

Støtte Information

Figur S1.

Pair-kloge linjeføringer for hver HERV-H element blev udført med HERV-H konsensus bygget af Jern P,

et al

. De forkortede alignment Resultaterne er vist for at angive de manglende områder præcist. Farvetæthed repræsenterer omfanget af homologi med HERV-H konsensus. Linjer repræsenterer slettet regioner i HERV-H elementer i forhold til HERV-H konsensus. Røde rektangler angiver de områder, hvor formodede ORF’er er nærede, mens de røde rektangler med tykke linjer angiver ORF’er med konserverede domæner. Regioner i LTR, pre-gag,

gag

,

pro

,

pol

og

env

er mærket nedenfor. Genomisk locus af hver HERV-H element er angivet tilsvarende på højre side

doi:. 10,1371 /journal.pone.0029950.s001

(TIF)

Figur S2.

Pair-kloge linjeføringer for hver HERV-H element blev udført med HERV-H konsensus bygget af Jern P,

et al

. De forkortede alignment Resultaterne er vist for at angive de manglende områder præcist. Farvetæthed repræsenterer omfanget af homologi med HERV-H konsensus. Linjer repræsenterer slettet regioner i HERV-H elementer i forhold til HERV-H konsensus. Røde rektangler angiver de områder, hvor formodede ORF’er er nærede, mens de røde rektangler med tykke linjer angiver ORF’er med konserverede domæner. Regioner i LTR, pre-gag,

gag

,

pro

,

pol

og

env

er mærket nedenfor. Genomiske locus på hver HERV-H element er angivet tilsvarende på højre side. Antallet af hvert element er vist til venstre som vist i tabel 2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0029950.s002

(TIF)

Tak

forfatterne er taknemmelige for Ms Heather Simkin for korrekturlæsning manuskriptet.