PLoS ONE: Doxycyclin Inducerbar Kruppel-Like Factor 4 Lentiviral Vector medierer Mesenchymale til Epithelial Transition i kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

Ovariecancer præsenterer terapeutiske udfordringer på grund af sin typisk sent afsløring, aggressiv metastase, og terapeutisk modstand. Transkriptionsfaktoren Krüppel-lignende faktor 4 (KLF4) er blevet impliceret i humane cancere som en tumor suppressor eller onkogen, selvom dens rolle i høj grad afhænger af den cellulære kontekst. Rolle KLF4 i æggestokkræft er ikke blevet belyst i mekanistisk detaljer. I denne undersøgelse undersøgte vi rolle KLF4 i ovariecancerceller ved at transducere de ovarian cancercellelinjer SKOV3 og OVCAR3 med en doxycyclin-inducerbar KLF4 lentiviral vektor. Overekspression af KLF4 reduceret celleproliferation, migration og invasion. Den epitelcelle markør-gen E-cadherin blev signifikant opreguleret, mens mesenkymale celler markørgener vimentin, twist1and snail2 (slug) blev nedreguleret i både KLF4 udtrykker SKOV3 og OVCAR3 celler. KLF4 inhiberede den transformerende vækstfaktor β (TGFp) -induceret epitelial til mesenkymale overgang (EMT) i ovariecancerceller. Tilsammen vores data, at KLF4 fungerer som et tumorsuppressorgen i ovariecancerceller ved at inhibere TGFp-induceret EMT

Henvisning:. Chen Z, Wang Y, Liu W, Zhao G, Lee S, Balogh A et al. (2014) Doxycyclin Inducerbar Kruppel-Like Factor 4 Lentiviral Vector medierer Mesenchymale til Epithelial Transition i æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 9 (8): e105331. doi: 10,1371 /journal.pone.0105331

Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA

Modtaget: Marts 18, 2014 Accepteret: 20 juli 2014; Udgivet: 19 August, 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette projekt blev delvist støttet af National Institute of Health (HL095957, HD061420 til JY, og CA092160 til GT) og UTHSC opstart finansiering, Western klinik Cancer center (JY) og kinesiske regering (2010CB530204 til CL, 112.102.310.110 til YG, 2011DFA33290 til WG). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Junming Yue er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier. Alle forfattere har nogen konkurrerende interesse at erklære.

Introduktion

Kræft i æggestokkene har en høj dødelighed, efter sigende forårsager 15.000 dødsfald årligt i USA [1]. Selv om der er gjort betydelige forbedringer i afsløring af ovariecancer i det seneste årti, er mere end 20.000 nye tilfælde diagnosticeres hvert år [1], [2]. De terapeutiske muligheder for ovariecancer er begrænset på grund af dens resistens over for kemo- og stråleterapi fører til hyppige gentagelser [3], [4].

KLF4 har vist sig at regulere celleproliferation og differentiering, dens rolle har blevet omfattende undersøgt i adskillige humane cancere ved hjælp GAIN- og tab-af-funktion tilgange. I colon og prostatakræft, KLF4 fungerer som et onkogen [5], [6]. Derimod spiller det en tumor suppressor rolle i neuroblastom, lungecancer, mavecancer, lymfom, livmoderhalskræft, pancreascancer duktal cancer og hepatocellulært carcinom [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]. I brystcancer, kan KLF4 fungere både som et onkogen [14], [15] og en tumor suppressor [16], [17], [18]. Rolle KLF4 i æggestokkræft er ikke blevet tilstrækkeligt og mekanistisk behandlet. En tidligere undersøgelse viser, at ekspressionsniveauet af KLF4 blev reduceret betydeligt i ovariecancer forhold til normal ovarieepitelet, hvilket antyder, at KLF4 potentielt kan virke som en tumorsuppressor i ovariecancer [19].

KLF4 spiller en unik rolle i stamceller omprogrammering ved at lette mesenkymale til epitelial overgang (MET) [20]. Den cellulære fænotypiske skifte fra epitel til mesenchymal celle overgang (EMT) er en grundlæggende proces i tumor metastase, der er en fremtrædende del af ovariecarcinomer. Den MET eller EMT fører til ændringer af epitel og mesenkymale markør genekspression, der omfatter snail1 2, Zeb 1 2, Twist, vimentin, E-cadherin [18], [21], [22]. EMT er reguleret af flere signalveje, som omfatter WNT, TGFp, og Notch. [23], [24], [25]. Nylige undersøgelser viser, at miRNA regulere EMT eller MET veje ved at målrette epitel- eller mesenkym celle markørgener, der omfatter MIR-194, MIR-203, og MIR-200C [22], [26]. KLF4 er blevet vist at regulere EMT i flere forskellige cancerceller. I hepatocellulært carcinom, bryst, og prostatacancerceller, KLF4 aktiverer transkriptionen af ​​epitelcelle markørgenet E-cadherin og undertrykker mesenchymal celle markørgen snegl 2 (slug) ved binding til deres respektive promotorer. KLF4 i disse kræftformer fremmer MET og hæmmer tumorcellevækst [10], [24], [27]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi rolle KLF4 i ovariecancerceller anvendelse af en doxycyclin (Dox) -afhængig KLF4-inducerbar lentiviral vektor (Tet-on) og fandt, at inducerbar overekspression af KLF4 reduceret celleproliferation, migration og invasion ved at fremme MET i æggestokkene cancerceller.

Materialer og metoder

Cell kultur

æggestokkene kræft cellelinjer SKOV3, OVCAR3 og brystkræft MCF7 blev indhentet fra ATCC og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% FBS (Hyclone, Logan, UT), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). HEK293 FT-celler blev dyrket i DMEM medier med 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 1% glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyre, og geneticin med en slutkoncentration på 1 ug /ml.

Lentiviral vektor produktion

Dox-inducerbare KLF4, omvendt transaktivator (rtTA-M3), og EGFP lentivirusvektorer blev pakket i HEK293FT celler og produceret som tidligere [28] beskrevet. Stabile cellelinjer med overekspression af KLF4- eller EGFP- blev genereret ved co-transduktion af SKOV3, OVCAR3, og MCF7-celler med lentivirusvektorerne KLF4, EGFP med rtTA-M3 og udvalgt med 5 ug /ml puromycin. At fremkalde KLF4 og EGFP udtryk, blev Dox tilføjet i normal vækstmedium som angivet.

Cell kolonidannelse assay

SKOV3, MCF7 og OVCAR3 celler transduceret med KLF4 eller EGFP overekspression vira (200 celler /brønd hver) blev udpladet i tredobbeltbestemmelse i 6-brønds plader og dyrket i 2 uger. De blev derefter farvet med 0,1% krystalviolet, og cellekolonier blev talt som tidligere beskrevet [29].

MTT assay

Celler blev udpladet 8000 pr brønd i 96-brønds plader og dyrket i 24 timer. Derefter blev 10 pi MTT-reagens tilsat til hver brønd og inkuberet i ca. 4 timer. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 100 pi detergent reagens; pladerne blev inkuberet ved 22 ° C i mørke i 2 timer; og derefter absorbansen blev målt ved 570 nm bølgelængde.

cellemigrationsassay

transducerede celler (3 x 10

5 celler per brønd) blev udsået in triplo i 6-brønds plader og dyrket i 24 timer. Celleoverfladen blev ridset med en pipettespids og vasket tre gange med PBS. Frisk vækstmedium blev tilsat i yderligere 24 timer. Migrationen blev beregnet under anvendelse af følgende formel: (arealet af sårområdet ved 0 timer – sårområdet ved 24 H) /sårområdet ved 0 timer. Transwell migration assay blev udført under anvendelse af en modificeret kammer (BD Falcon, San Jose, CA). Disse kamre blev indsat i en plade med 24 brønde. Celler (3 x 10

4) i 300 pi serumfrit DMEM blev tilsat til det øvre kammer. Kemoattraktanten i DMEM blev tilsat til det nederste kammer i hver brønd, og cellerne blev inkuberet i 24 timer. Mediet og ikke-migrerede celler i det øvre kammer blev fjernet henviser blev de migrerede celler i den nedre side af membranerne fikseret med methanol og farvet med krystalviolet. Billeder blev taget ved 10X forstørrelse. Celler i mindst tre forskellige områder blev talt.

Cell invasion assay

SKOV3 og OVCAR3 celler (5 x 10

5) transduceret med EGFP og KLF4 overekspression virus blev podet i serum- frit DMEM onto inserter belagt med Matrigel (BD BioCoat, 24-brønd tumorinvasion System (BD Biosciences, San Jose, CA). DMEM indeholdende 10% FBS blev tilsat til den nederste kammer invasionen system som kemoattraktant. Efter 24 timer, Transwell inserts blev farvet ved anvendelse 4 ug /ml calcein AM (Life Technologies, Grand Island, NY) ved 37 ° C i 1 time. fluorescensintensiteten blev målt ved anvendelse af BioTek Synergy (Winooski, VT) pladelæser ved excitation og emission bølgelængder på 485 nm og 528 nm.

blød agar-assay

i bunden agar, 0,6% Noble agar i DMEM indeholdende 10% FBS blev tilsat til plader med 6 brønde. To millioner celler i DMEM indeholdende 10% FBS og 0,35% Noble agar blev tilsat til bunden agar. vækstmedium blev derefter tilsat til topagar, når det havde størknet, og cellerne blev fodret med frisk vækstmedium hver 5 d, og kolonier blev talt under et lysmikroskop efter 2 uger.

immunfluorescensfarvning

for at detektere ekspressionen af ​​EMT-associerede markørgener, KLF4-udtrykkende og styre SKOV3 celler blev fikseret i 10 minutter under anvendelse af 4% PFA, vasket tre gange med 0,1% Tween20 i PBS (PBST) og inkuberet med blokeringsbuffer (5% normalt gedeserum, 3% bovint serumalbumin og 0,1% Triton-X 100 i PBS) i 1 time. De primære antistoffer mod E-cadherin, snail2, og vimentin (1:200 fortynding, Cell Signaling, Danvers, MA), blev inkuberet med faste celler natten over. Efter skylning tre gange i 5 minutter med PBST, Alexa 488 eller 594 konjugeret gede-anti-kanin (1:200 fortynding, Life Technologies) antistoffer blev tilsat i 1 time ved stuetemperatur. Cellekerner blev modfarvet med DAPI (Vector Laboratories, Inc .; Burlingame, CA). Billeder blev taget ved hjælp af et Nikon inverteret fluorescensmikroskop.

chromatin immunoprecipitation (chip)

chip blev udført ved hjælp af chip-IT Express Enzymatisk kit (Active Motif, Carlsbad, CA) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Kort fortalt KLF4-udtrykkende og kontrol SKOV3-celler blev tværbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur. Celler blev høstet og sonikeret for forskydnings- kromosomale DNA. Immunfældning blev udført ved binding 10 ug kanin-anti-KLF4 antistof eller IgG (Santa Cruz Inc., Dallas, Texas) til lysaterne og inkuberet ved 4 ° C med rotation natten over. Chromatin komplekser blev elueret fra magnetiske perler ved omvendt-tværbinding. Kromatin DNA blev oprenset ved anvendelse af QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA) og elueret i 40 pi vand. DNA (4 pi) blev anvendt til kvantitativ PCR-reaktion til påvisning af tilstedeværelsen af ​​E-cadherin promotoren. Primere anvendt til påvisning promotoren for E-cadherin var 5′-TAG AGG GTC ACC GCG TCT AT-3 ‘(fremadrettet) og 5’-TCA CAG GTG CTT TGC AGT TC-3 (revers) som beskrevet tidligere [16].

Western blot

æggestokkene og brystkræft celler blev indsamlet i RIPA buffer (Thermo Scientific, Rockford, IL), der indeholder 1% Halt proteinaseinhibitor Cocktail (Thermo Scientific, Rockford, IL). En tilsvarende mængde protein (40 ug /bane) blev påsat 10% SDS-PAGE geler og overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri mælk i 1 time og inkuberet med primære antistoffer mod KLF4 (Cell Signaling), GAPDH (Sigma; St. Louis, MO), vimentin, E-cadherin, eller snail2 (cellesignalering).

Statistisk analyse

Signifikante forskelle blev bestemt ud fra to eller tre uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer og præsenteres som middelværdi ± SD hjælp Students

t

-test.

s

. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Overekspression af KLF4 i æggestokkene cancerceller hjælp Tet-on system

For at fastlægge den rolle, KLF4 i ovariecancerceller konstruerede vi en inducerbar lentiviral vektor, hvori KLF4 genet blev drevet af tetracycline- (Tet) eller en Dox-responsiv promotor (TRE-tight). Revers transkription aktivator rtTA-M3 blev drevet af en konstitutiv humant allestedsnærværende C promotoren klonet i en separat lentiviral vector (fig S1A). KLF4 ekspression kan aktiveres ved rtTA-M3 i nærvær af Dox på en dosis-afhængig måde. En EGFP-inducerbar lentiviral vektor blev konstrueret og tjente som kontrol. For at undersøge den inducerede ekspression af KLF4 og EGFP i æggestokkene cancercellelinjer SKOV3 og OVCAR3, blev Dox tilsat ved en slutkoncentration på 1 ug /ml, og ekspressionen af ​​KLF4 og EGFP på forskellige tidspunkter blev påvist ved Western blot. Ekspression af EGFP og KLF4 øges gradvist over en 24 timers periode (figur S1B). EGFP ekspression i SKOV3 og OVCAR3 ovariecancerceller blev visualiseret med fluorescerende mikroskopi 48 timer efter tilsætning af Dox (fig. S2A, B). Dox-behandling forårsagede ændringer i cellemorfologi af SKOV3-celler. En afrundet epitelcelle-lignende morfologi blev observeret i KLF4-transducerede SKOV3-celler sammenlignet med fladtrykte multipolær epitelcelle-lignende form af EGFP eller KLF4 kontrolceller efter 48 og 72 timer (fig. S1c og fig. S2C). Imidlertid blev morfologi i KLF4-transducerede OVCAR3 celler ikke ændret følgende Dox behandling sammenlignet med kontrol-celler (data ikke vist).

KLF4 hæmmer celledeling og kolonidannelse

For at undersøge den rolle, KLF4 i ovariecancer celleproliferation, blev MTT-assayet udføres i KLF4-transducerede SKOV3 og kontrolceller. Efter Dox behandling, proliferation i KLF4-overudtrykker celler var signifikant inhiberet sammenlignet med EGFP eller KLF4 (ikke-Dox) kontrolceller (figur 1A). Vi udførte også kolonidannelse assays af SKOV3 og OVCAR3 celler transduceret med KLF4 og EGFP styrevektorer. Antallet af kolonier i KLF4-overudtrykkende celler blev signifikant reduceret sammenlignet med EGFP og KLF4 kontrolceller (figur 1B, C). Desuden blev blød agar-kolonidannelse assays også udført for at bestemme, om KLF4 påvirker forankringsuafhængig cellevækst. Tilsvarende vores resultater indikerede, at KLF4 inhiberer celleproliferation i de halvfaste dyrkningsmedier sammenlignet med kontrolceller (fig 1D).

A. Celleproliferation af SKOV3-celler transduceret med enten EGFP eller KLF4 blev undersøgt ved MTT-assay på forskellige tidspunkter efter Dox behandling. Overekspression af KLF4 signifikant reduceret celleproliferation sammenlignet med den i Dox-behandlede kontrolceller (*

s Restaurant 0,05). B. 200 SKOV3-celler transduceret med lentivirale KLF4 eller EGFP styrevektorer blev podet i hver brønd i en 6-brønds plade og dyrket i 14 d. Cellekolonier blev talt efter krystalviolet farvning. Antallet af kolonier i KLF4-overudtrykkende celler blev signifikant reduceret sammenlignet med den i Dox-behandlede kontrolceller (***

s Restaurant 0,001). C. Antallet af kolonier i KLF4-overudtrykker OVCAR3 celler var signifikant reduceret sammenlignet med den i Dox-behandlede kontrolceller (**

s Restaurant 0,01). D. blød agar-kolonidannelse assay blev udført tredobbelt under anvendelse af SKOV3-celler. Kolonier blev fotograferet og talt efter 3 uger. Antallet af kolonier i KLF4-overekspression celler var signifikant reduceret i forhold til, at der i Dox-behandlede kontrol celler (***

s

0,001).

KLF4 reducerer celle migration og invasion

En afgørende egenskab af invasive cancerceller er deres øgede mobilitet. For at undersøge om KLF4 påvirker cellemigrering i æggestokkene cancercellelinie SKOV3, sårhelende assay blev udført under anvendelse KLF4-transducerede SKOV3 og kontrolceller. Som vist i figur 2A blev cellen vandringshastigheden signifikant reduceret i KLF4-overudtrykkende celler sammenlignet med satser i EGFP- og KLF4-transducerede kontrolceller. Celle kemotaksi blev undersøgt under anvendelse Transwell migration assay. Som vist i figur 2B og C blev migrerede celler signifikant reduceret i KLF4-overekspression SKOV3 og OVCAR3 celler sammenlignet med celler EGFP og KLF4 kontroller. For at undersøge om KLF4 påvirker celleinvasion, blev en celleinvasion assay udført på KLF4-transducerede SKOV3 og OVCAR3 celler under anvendelse Matrigelcoatede transwell plader. Overekspression af KLF4 væsentligt reduceret invasion celle i forhold til, at der i kontrollen i begge cellelinier (figur 3A, B).

A. Sårheling assay blev udført for at undersøge migration på SKOV3 celler transduceret med KLF4 og EGFP lentivirusvektorer. Fotografier blev taget ved 0 og 24 timer efter den oprindelige bunden. Vandringshastigheder blev kvantificeret ved at måle tre forskellige sår områder. Der blev udført tre separate forsøg. Migration rate blev signifikant reduceret i KLF4-overekspression celler sammenlignet med i Dox-behandlede kontroller (**

s

0,01). B, blev C. Transwell migration assay udføres i SKOV3 og OVCAR3 celler. Overekspression af KLF4 signifikant reduceret cellemigration i SKOV3 (B) og OVCAR3 (C) celler sammenlignes med den i Dox-behandlede kontroller (***

s Restaurant 0,001).

A, blev B. Cell invasion assay udført under anvendelse Matrigelcoatede transwell-plader for SKOV3 (A) og OVCAR3 celler (B). Invasionen rate blev signifikant reduceret i KLF4-overekspression celler sammenlignet med i Dox-behandlede kontrol celler fra både SKOV3 og OVCAR3 celler (**

s

0,01). Data blev indsamlet fra tre separate eksperimenter og analyseret ved hjælp af Student

t

-tests.

KLF4 fremmer MET i æggestokkene cancerceller

For at undersøge om KLF4 regulerer EMT i ovariecancerceller, epitel celle markør gen E-cadherin og mesenkymale markørgener snail2 og vimentin blev undersøgt i KLF4-transducerede SKOV3 og OVCAR3 celler ved hjælp af Western blot. Den epitel markør E-cadherin blev signifikant opreguleret, mens mesenkymale markører vimentin og snail2 blev væsentligt reduceret i KLF4-overekspression celler i forhold til EGFP og KLF4 kontroller (figur 4A, B). Vi udførte også immunfarvning på KLF4-overudtrykkende og kontrol celler til at undersøge markedsøkonomisk markører. Både E-cadherin og vimentin farvning var fremtrædende i cellemembraner, mens snail2 farves cellekernerne. I lighed med de vestlige blots viste immunfarvning, at E-cadherin ekspression blev opreguleret, mens vimentin og snail2 blev nedreguleret (figur 4C, D og E). Vi undersøgte også udtryk for twist1 hjælp realtime RT-PCR i KLF4 transducerede SKOV3 celler og fandt, at twist1 var signifikant nedreguleret i KLF4 udtrykker SKOV3 celler sammenlignet med kontrol (fig. S4). Disse resultater understøtter den hypotese, at KLF4 fremmer MET i æggestokkene cancerceller. For yderligere at undersøge, om E-cadherin opregulering skyldtes transkriptionel aktivering, udførte vi chromatin immunoprecipitation i KLF4-udtrykkende og styre SKOV3-celler, og promotorområdet af E-cadherin blev amplificeret fra beriget kromatisk DNA ved real-time PCR som tidligere beskrevet [ ,,,0],16]. KLF4 ekspression i SKOV3-celler førte til en omtrent 15 gange berigelse af E-cadherin sammenlignet med kontroller (Figur 4F), hvilket indikerer, at KLF4 binder til promotoren for E-cadherin og aktiverer E-cadherin-ekspression i ovariecancerceller.

A. B. Western blots blev udført i KLF4- og EGFP-transducerede SKOV3 (A) og OVCAR3 celler (B) med eller uden Dox induktion. E-cadherinekspression var signifikant opreguleret (***

s

0,001), mens vimentin (**

s

0,01) og snail2 (***

p

0,001) blev nedreguleret i KLF4- overekspression SKOV3 celler sammenlignet med kontrol celler (A). E-cadherin (**

s

0,01) blev opreguleret, mens vimentin (*

s

0,05) og snail2 (***

s

0,001) blev nedreguleret i KLF4-overekspression OVCAR3 celler sammenlignet med Dox-behandlede kontrolceller (B). E-cadherin (C) og vimentin (D) blev immunfarvet i cellemembranerne i KLF4-udtrykkende og styre SKOV3-celler. E. Snail2 var farves i cellekerner i KLF4-udtrykkende og styre SKOV3-celler. F. KLF4 binding til promotoren af ​​E-cadherin i SKOV3-celler blev undersøgt ved chromatin immunoprecipitation under anvendelse KLF4 antistof og påvises ved real-time PCR under anvendelse E-cadherin-specifikke primere. Chippen-beriget DNA-niveauer blev normaliseret til input-DNA, efterfulgt af subtraktion af ikke-specifik binding bestemmes af kontrol IgG (***

s

0,001)

KLF4. hæmmer TGFP-induceret EMT i æggestokkene cancerceller

for at undersøge mekanismen om KLF4 regulerer TGFP inducerede EMT i æggestokkene cancerceller, blev SKOV3 og OVCAR3 celler behandlet med forskellige doser af TGF. Ekspression af EMT markørproteiner E-cadherin, vimentin, og snail2 blev undersøgt under anvendelse af Western blot. Vores data indikerer, at TGFp fremmet EMT i ovariecancerceller ved nedregulering E-cadherin og opregulering snail2 og vimentin (figur 5A, B). Endvidere, når vi behandlede KLF4-udtrykkende og kontrollere SKOV3 og OVCAR3 celler med stigende doser af TGFp, KLF4 ekspression inhiberes signifikant TGFp-induceret EMT i begge cellelinier (figur 6A, B).

humanovarie cancercellelinier SKOV3 (A) og OVCAR3 (B) blev behandlet med forskellige doser af TGFp i 48 timer. EMT-associeret markørgener, herunder E-cadherin, snail2, og vimentin blev undersøgt ved hjælp af Western blot. Betydninger blev bestemt ved at sammenligne TGFp behandlet til ikke-behandling (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

Ovariecancer cellelinier SKOV3 (A) og OVCAR3 (B) transduceret med lentiviral KLF4 overekspression og kontrol vektor blev behandlet med TGFp i 48 timer, og proteinet udtryk for EMT-associerede markørgener E-cadherin, snail2 og vimentin blev undersøgt under anvendelse af Western blot. Signifikante forskelle blev sammenlignet mellem KLF4 udtrykke og kontrolgruppen (** p 0,05, *** p 0,001)

Diskussion

I denne undersøgelse undersøgte vi rolle. KLF4 i ovariecancerceller under anvendelse lentiviral vektor medieret inducerbar ekspression. Tidligere undersøgelser har vist, at KLF4 blev nedreguleret i ovariecancere sammenlignet med kontroller, og at KLF4 ikke påvirkede celleproliferation men steg Bcl-2 /Bax-forhold og inhiberede apoptose [19]. I modsætning hertil fandt vi, at KLF4 inhiberer proliferationen af ​​SKOV3-celler i kolonidannelse og MTT-assays (fig. 1A, B og C). Forskellen kan skyldes den lave transfektionseffektivitet i denne undersøgelse i forhold til vores højeffektive inducerbare lentiviral transduktion. Vi fandt også, KLF4 inhiberer celleproliferation i OVCAR3 celler (Fig. 1C). Vores data viser, at KLF4 hæmmer celledeling, migration og invasion, hvorfor det fungerer som en tumor suppressor i både SKOV3 og OVCAR3 celler.

KLF4 kan have en dobbelt effekt, enten som et onkogen eller et tumor suppressor i brystet kræftceller [14], [16], [18], [30]. For at sammenligne handlinger KLF4 i MCF7 brystcancer med at i æggestokkene kræftceller, vi udførte tilsvarende forsøg ved hjælp af den samme lentivirale Tet-on inducerbare vektor-transducerede i MCF7-celler. Vi fandt, at KLF4 inhiberer MCF7-celleproliferation (fig. S3A). Vores konklusion er magen til resultaterne vist i MCF10A celler ved Yori et al. [16]. Yu et al., Viste imidlertid, at KLF4 fungerer som et onkogen i MCF7-celler [14], som er modsat vores konklusion.

morfologi i KLF4 udtrykker SKOV3 cellerne i nærvær af Dox blev tydeligt ændret fra kontrolceller uden Dox på de forskellige tidspunkter (fig S2C); Men vi ikke observere indlysende morfologiske ændringer i OVCAR3 celler efter induktion af KLF4 udtryk. En af årsager til dette fænomen er, at KLF4 også induceret celle apoptose i ovariecancerceller baseret på vores upublicerede data. De morfologiske forskelle kan skyldes de forskellige reaktioner på KLF4 induceret apoptose i begge cellelinier. I begge SKOV3 og OVCAR3 celler epitelcellen markørgenet E-cadherin blev opreguleret, og mesenchymale markørgener vimentin og snail2 blev nedreguleret efter induktion af KLF4 overekspression (fig. 4A, B). Tilsammen antyder disse data at KLF4 primært fremmet MET i ovariecancerceller. Ekspressionen af ​​EMT associeret markørgener i ovariecancerceller svarer til hvad vi observeret i MCF7 brystcancerceller, selvom den endogene ekspression af vimentin i MCF7 ikke var påviselig i KLF4-overudtrykkende eller kontrolceller. Dette kan være forårsaget af lav endogen ekspressionsniveauet af vimentin i MCF7-celler. Vore data understøtter den hypotese, at KLF4 er en vigtig regulator fremme MET og inhibering EMT i ovarie- og brystcancerceller.

Tidligere undersøgelser har vist, at KLF4 binder til promotorregionerne af E-cadherin og snail2, således kan aktivere udtryk for E-cadherin eller undertrykke udtryk for snail2 i fibroblaster og flere kræft cellelinjer [18], [24], [27], [31]. Ekspressionen af ​​epitelcelle markør E-cadherin er påkrævet for stamcelle omprogrammering. KLF4 letter MET processen ved at aktivere E-cadherin udtryk [31]. I æggestokkene kræftceller, observerede vi en KLF4-afhængig opregulering af E-cadherin og en nedregulering af vimentin og snail2. Vores data viser, at KLF4 transkriptionelt binder sig til fortalerne for E-cadherin, hvilket fører til aktivering af E-cadherin udtryk i æggestokkene cancerceller.

EMT eller MET er stramt reguleret af flere signalveje. Adskillige undersøgelser har vist, at flere signalveje, herunder WNT, Notch, NFkB, og TGFp, er involveret i EMT eller MET overgang i kræft [32], [33], [34], [35]. Tidligere undersøgelser viste også, at TGFp fremmer EMT i æggestokkene cancerceller [36], [37]. Men der er ingen relaterede undersøgelser om at beskrive den mekanisme, hvordan KLF4 er involveret i EMT og interagerer med disse veje i æggestokkene kræftceller. Vores nuværende undersøgelser viser, at KLF4 hæmmer TGFp-induceret EMT i både SKOV3 og OVCAR3 celler (fig. 6A, B), hvilket antyder, at KLF4 dæmper TGFp inducerede EMT i ovariecancere. Derfor vil synergistisk overekspression af KLF4 og inhibering af TGFp pathway tilvejebringe en ny fremgangsmåde i udviklingslandene nye terapeutiske lægemidler til behandling af ovariecancer.

Sammenfattende er dette den første rapport, der viser, at KLF4 fungerer som en tumor suppressor ved at hæmme celledeling, migration og invasion i æggestokkene kræftceller gennem formildende TGFP-induceret EMT.

Støtte oplysninger

figur S1.

Induktion af KLF4 udtryk i æggestokkene cancerceller hjælp lentiviral Tet-on vektor. A. Lentiviral Tet-on vektorsystemet. Omvendt transaktivator (rtTA-M3) var drevet af menneskelig ubiquitin C (UBC promotor), og EGFP eller KLF4 blev drevet af Dox promotor TRE-tight. For at inducere ekspression af EGFP eller KLF4 er Dox nødvendig for at aktivere Tet-promotoren efter rtTA binding til Tet-responsive element i promotorregionen. B. EGFP og KLF4 udtryk blev induceret ved Dox i SKOV3 ovariecancer celler og detekteret ved Western blot. C. SKOV3 celler overeksprimerer KLF4 display afrundede epitelcelle-lignende morfologi

doi:. 10,1371 /journal.pone.0105331.s001

(PDF)

figur S2.

Dox-induceret EGFP ekspression i SKOV3 og OVCAR3 celler. EGFP udtryk i SKOV3 (A) og OVCAR3 celler (B) transduceret med EGFP lentiviral vector blev visualiseret under fluorescerende mikroskopi med eller uden Dox induktion. Cell morfologier blev undersøgt under lysmikroskopi. C. Cell morfologier blev afbildet på forskellige tidspunkter under lysmikroskopi

doi:. 10,1371 /journal.pone.0105331.s002

(PDF)

Figur S3.

KLF4 fremmer MET i brystkræft MCF7-celler. A. Colony-dannelse blev udført i MCF7-celler transduceret med EGFP og KLF4 overekspression lentivirale vektorer. Antallet af kolonier i KLF4-overudtrykkende celler blev signifikant reduceret sammenlignet med den i Dox-behandlede kontroller (***

s Restaurant 0,001). B. Western blot analyse af KLF4 (**

s

0,01), E-cadherin (**

s

0,01), og snail2 (*

p

0,05) i MCF7-celler, der overudtrykker KLF4 og EGFP med eller uden Dox behandling

doi:. 10,1371 /journal.pone.0105331.s003

(PDF)

Figur S4.

KLF4 nedregulerer twist1 udtryk i æggestokkene kræft SKOV3 celler. Twist1 udtryk i KLF4 udtrykker SKOV3 og kontrol celler blev opdaget af real time RT-PCR efter KLF4 induktion i 24 timer ved hjælp af 1 ug /ml doxycyclin (*

s

0,05)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0105331.s004

(PDF)

Tekst S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0105331.s005

(DOCX)