PLoS ONE: Identifikation af Kininogen-1 som en Serum Biomarkør for tidlig påvisning af fremskreden kolorektal adenom og Colorectal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Serum markører repræsentere potentielle værktøjer til opdagelse af tyk- cancer (CRC). Formålet med denne undersøgelse var at opnå proteom udtryk profiler og identificere serum markører for tidlig påvisning af CRC.

Metoder

proteomiske profiler af serumprøver indsamlet fra 35 raske frivillige, 35 patienter med fremskreden kolorektal adenom (ACA), og 40 patienter med CRC blev sammenlignet under anvendelse Clinprot teknologi. Brug enzymmaerket assays (ELISA), blev desuden analyseret 366 serumprøver, og immunhistokemi studier af 400 væv blev anvendt til at verificere ekspression af kininogen-1 og dens værdi i tidlig påvisning af CRC.

Resultater

Forudsigelse modeller blev etableret blandt de tre grupper, og kininogen-1 blev identificeret som en potentiel markør for CRC hjælp Clinprot teknologi. ELISA også påvist signifikant højere serum Kininogen-1-niveauer i ACA og CRC patienter sammenlignet med kontroller (

P

0,05). Desuden er området under Receiver Operating karakteristiske kurve (AUC) for serum Kininogen-1 i diagnosen af ​​ACA var 0,635 (P = 0,003), og for serum carcinoembryonisk antigen (CEA) var 0,453 (P = 0,358). Den følsomhed, specificitet og nøjagtighed af serum kininogen-1 til diagnosticering af Duke scene A og B CRC var 70,13%, 65,88%, og 67,90%, henholdsvis, mens serum CEA var 38,96%, 85,88%, og 63,58%, henholdsvis. Desuden viste immunhistokemi at ekspressionen af ​​kininogen-1 var signifikant højere i CRC og ACA væv end i normal slimhinde (48,39% mod 15,58% vs. 0%,

P

0,05).

konklusioner

Disse resultater tyder på, at Clinprot teknologi giver et nyttigt værktøj til diagnosticering af CRC, og kininogen-1 er en potentiel serum biomarkør for tidlig påvisning af fremskreden kolorektal adenom og CRC.

Henvisning: Wang J, Wang X, Lin S, Chen C, Wang C, Ma Q, et al. (2013) Identifikation af Kininogen-1 som en Serum Biomarkør for tidlig påvisning af fremskreden kolorektal adenom og tyktarmskræft. PLoS ONE 8 (7): e70519. doi: 10,1371 /journal.pone.0070519

Redaktør: Mitsunobu R. Kano, Okayama University, Japan

Modtaget: November 14, 2012; Accepteret: 25 Juni 2013; Udgivet: 23 Jul 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Videnskab og Teknologi Planlægning Projekt i Guangdong-provinsen (2010B031600098) og Videnskab og Teknologi Development Program for Guangzhou Kommune (2.060.402). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

det anslås, at mere end 143.000 personer i USA vil blive diagnosticeret med tyktarmskræft (CRC) i 2012, og mere end 50.000 personer vil dø af denne sygdom [1]. Ved screening gennemsnit risiko individer, er det en hypotese, at CRC kunne påvises i sin vorden, og derved reducere satserne for dødeligheden forbundet med CRC [2] – [4]. I øjeblikket kan CRC-screening indeholde en fækal okkult blodprøve, sigmoidoskopi, og koloskopi [5]. I mange ressource-begrænset lande, er den fækal okkult blodprøve primært, på trods af den utilstrækkelige følsomhed assay [6], [7]. Desuden med sigmoideoskopi og koloskopi bliver invasive og ubekvemme procedurer, deres ansøgning om CRC screeninger har været begrænset [8]. Derfor er der behov mindre invasive og ikke-invasive metoder til at forbedre følsomheden og patientefterlevelse i CRC screeninger.

Identificeringen af ​​serologiske biomarkører specifikke for CRC kunne give en relativt ikke-invasiv og økonomisk fordelagtig fremgangsmåde til påvisning CRC forhold til de nuværende screening muligheder. Men serum er en kompleks kropsvæske, der indeholder mange forskellige proteiner. For eksempel er der fundet mere end 10.000 forskellige proteiner i humant serum, og mange proteiner udskilles eller stald af celler under forskellige fysiologiske eller patologiske processer [9], [10]. Derfor er det vanskeligt at identificere en sygdomsspecifik serum markør. På grund af fremskridt inden for proteomics metoder, er det nu muligt hurtigt at identificere nye kandidat markører for kræft. For eksempel har mange undersøgelser vist kapaciteten til matrix-assisteret laser desorption /ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF-MS) for at adskille komplekse blandinger af proteiner, og derved lette en sammenligning af variationer i proteinekspression for normal og cancerøse serumprøver [11] – [13]. Især Clinprot teknologi, som er baseret på MALDI-TOF-MS, har mange fordele for klinisk anvendelse, herunder dens følsomhed, brugervenlighed, og kapacitet til high-throughput analyse [14], [15].

Brug MALDI-MS, Seraglia

et al.

[16] tidligere rapporteret kininogen-1 til at være en potentielt ny plasma markør for CRC. Kininogen-1 er et multifunktionelt protein, der spiller en vigtig rolle i mange patofysiologiske processer [17], herunder fibrinolyse, thrombose og inflammation, samt have en rolle i onkogenese [18]. For at bekræfte disse resultater og til at identificere yderligere roman plasma markører for CRC, sera fra patienter med CRC, blev patienter med fremskreden kolorektal adenom (ACA), og raske personer analyseret ved hjælp Clinprot teknologi, enzymmaerket assays (ELISA), og immunhistokemi.

Materialer og metoder

Patient Selection

Alle prøver blev indsamlet fra Nanfang Hospital. Sera blev indsamlet mellem oktober 1, 2009 og den 31. december blev 2010. Paraffin-indlejrede væv indsamlet fra april 1, 1999 og 31. december 2007. Patienter med en kendt historie af familiær adenomatøs polypose, HNPCC, forhøjet blodtryk, hvilket som helst andet tumorer og åbenlyse inflammatoriske sygdomme, blev udelukket. Følgende faktorer blev registreret for hver væv: patientens alder, patientens køn, tumorstørrelse, tumor placering til CRC og ACA, væv histologi og tumor kvalitet til intraepitelialneoplasi til ACA, differentiering, Duke etape, og Tumor-Node-Metastase (TNM) fase (7th EDN) for CRC. Kolorektal adenom patienter, der har mindst én adenom ≥10 mm, eller som har en villøs struktur eller karcinom

in situ

, blev klassificeret som ACA patienter [19].

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med institutionelle etiske retningslinjer og blev godkendt af Medical Ethics Committee of Southern Medical University (# 2.011.119). Skriftligt informeret samtykke formularer blev opnået fra alle patienter.

Prøveforberedelse

Sera blev indsamlet fra raske frivillige, ACA patienter, præoperativ CRC patienter (opnået forud for ethvert klinisk behandling), og postoperative CRC patienter (opnået syv dage efter operationen). For Clinprot analyse blev opnået i alt 110 serumprøver fra raske frivillige (n = 35), ACA-patienter (n = 35), og præoperativ CRC patienter (n = 40). For ELISA, blev i alt 366 sera opnået fra yderligere 85 raske frivillige, 80 ACA patienter, 143 præoperativ CRC patienter, og 58 postoperative CRC patienter. Asymptomatisk og tilsyneladende raske frivillige blev udvalgt, som ikke har en tidligere historie af kræft. Alle prøver blev opsamlet i 5 ml serumseparatorrør, og derefter blev inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter centrifugering ved 3000 rpm i 10 min, blev sera fordelt i 50 pi alikvoter og opbevaret ved -70 ° C indtil brug.

I alt 400 paraffinindlejrede væv blev analyseret ved immunohistokemi, herunder 75 normal colorektal slimhinde væv, som blev indsamlet fra raske frivillige, som gennemgik en endoskopisk slimhinde biopsi. Desuden blev 77 ACA væv indsamlet fra ACA patienter, som gennemgik endoskopisk resektion, og 248 CRC væv blev indsamlet fra CRC patienter, som gennemgik operation. Alle prøver blev fikseret i 10% formalinopløsning og indlejret i paraffin. Sektioner (4 pm) blev skåret og forberedt til hæmatoxylin-eosinfarvning og immunhistokemi analyser.

Udvinding af peptider fra Serum Brug magnetiske perler, efterfulgt af MALDI-TOF-MS analyse

Serum peptider var separeret og oprenset under anvendelse af en magnetisk perle-baserede svage kationbytningskromatografi oprensningskit (Bruker Daltonics GmbH). I alt 110 serumprøver blev fraktioneret ifølge standardprotokollen foreslået af producenten. Streng kvalitetskontrol blev opretholdt for at sikre nøjagtigheden og reproducerbarhed af de opnåede resultater. Serum peptid-profiler blev efterfølgende analyseret ved anvendelse af en Ultraflex MALDI-TOF /TOF-MS (Bruker Daltonik, Bremen, Tyskland). Spektre blev erhvervet i massen /ladning (m /z) intervallet 1.000 til 10.000 hjælp FlexAnalysis software (Bruker Daltonics).

Clinpro Tools software 2.2 (Bruker, Daltonik) blev anvendt til analyse af alle data udledt fra serumprøver. Dette omfattede rå data opnået før behandling, baseline subtraktion af spektre, normalisering af spektre, intern peak justering ved hjælp af prominente toppe og et højdepunkt plukning procedure. Desuden blev forbehandlet data visualiseret og analyseret statistisk ved anvendelse af t-test og genetiske algoritmer (GA). Desuden blev forudsigelsesmodeller etableret ved hjælp af GA. For at bestemme nøjagtigheden af ​​prognosemodeller genererede, var cross-validering udføres. Kort beskrevet blev alle prøver udvalgt som et træningssæt i klassen prædiktor algoritme, så de samme prøver bortset fra en tilfældigt udvalgt prøve blev anvendt som en test sæt. En ‘test’ blev derefter udført ti gange tilfældigt.

Peptide Identifikation af MALDI-TOF /TOF

Efter at have afsluttet den statistiske analyse, differentielt udtrykte peptider blev identificeret. Oprindeligt blev de mono-isotopiske masser af peptider i m /z området fra 1.000 til 3.000 bestemmes ved anvendelse af en reflekterende tilstand. Efter MS /MS spektre af prækursor-ioner blev erhvervet i TOF /TOF-tilstand, blev MS /MS-data underkastet en Mascot database søgning for at identificere de tilsvarende fuld længde protein kampe.

enzymmaerket Assay ( ELISA)

Alle sera blev analyseret i et blindet måde, og standarder og prøver blev kørt i tre eksemplarer. Kininogen-1-koncentrationer blev kvantificeret ved anvendelse af en human Kininogen ELISA Kit (nr EK2001-1, Assaypro, MO, USA). Kort fortalt: (1) 25 pi standard eller prøve, og 25 pi biotinyleret kininogen blev tilsat til 96-brønds polystyren mikroplader overtrukket med et polyklonalt antistof mod human kininogen. Efter 2 timer ved stuetemperatur blev pladerne vasket fem gange, derefter 50 pi streptavidin-peroxidase konjugat blev tilsat til hver brønd. Efter 30 minutter ved stuetemperatur blev pladerne vasket fem gange og 50 pi kromogen substrat blev tilsat til hver brønd. Efter en blå farve tilstrækkeligt udviklet, blev 50 pi stopopløsning tilsat til hver brønd og absorbansværdier ved 450 nm blev registreret ved anvendelse af en mikropladelæser. En standardkurve blev genereret og anvendt til at bestemme koncentrationer af kininogen-1 til stede i de analyserede prøver.

For at detektere serumniveauer af CEA, et kommercielt tilgængeligt enzym-immunoassay-kit (Whiga, Guangzhou, Kina) blev anvendt ifølge producentens anvisninger.

Immunhistokemi

Kininogen-1 antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (sc-25.799, CA, USA). En tidligere offentliggjorte protokol blev anvendt til immunhistokemi analyser [20], med kininogen-1 antistof fortyndet 1:150. Alle sektioner blev blindt og uafhængigt vurderet mikroskopisk af to veluddannede patologer. Intensiteten af ​​farvningen blev vurderet ved anvendelse af en semikvantitativ scoringssystem som følger: 0, negativ farvning; 1, svag farvning; 2, moderat farvning; og 3, stærk farvning. Fordelingen af ​​farvning blev også gradueres efter procentdelen af ​​farvede celler til stede i området af interesse: 0, udgjorde positive celler 10% af tumorcellerne; 1, positive celler udgjorde 10-50% af tumorceller; 2, positive celler udgjorde 50-75% af tumorceller; eller 3, positive celler udgjorde 75% af tumorcellerne. Scores for intensitet og fordeling blev tilføjet for at give en samlet score for hver prøve. Kort fortalt blev prøver, der modtager nulpunkter betragtes negative (0), blev sager, der modtager 1-3 point betragtet svagt positive (1+), sager, der modtager 4-7 punkter blev anset moderat positive (2+), og sager, der modtager en endelig score 7 blev betragtet stærkt positiv (3+)

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 13.0.. For at teste forskelle mellem grupper blev Chi-square test anvendt, med den undtagelse, at t-test blev anvendt til alder. Korrelationer mellem de immunhistokemiske scorer bestemt for kininogen-1 og de klinisk-patologiske parametre i den kohorte blev vurderet ved anvendelse af Spearman rank-order korrelationskoefficient. Koncentrationer af kininogen-1 og CEA viste sig at have en normalfordeling. Derfor blev disse data sammenlignet under anvendelse af en envejs variansanalyse test. I modsætning hertil blev multiple sammenligninger analyseret under anvendelse LSD metoder. Data blev udtrykt som middelværdien ± standardfejl på middelværdien (SEM). Receiver Operating Characteristic (ROC) kurver blev anvendt til at bestemme værdierne af serum kininogen-1 og CEA til diagnosticering af kolorektale tumorer. Kaplan-Meier (Log-rank test) blev anvendt for overlevelse analyse. For alle analyser blev en P-værdi mindre end 0,05 anses for væsentlig.

Resultater

proteomisk Profiler af ACA og CRC Patient Serum

I alt 110 serumprøver opnået fra 35 raske frivillige (kontroller), 35 ACA-patienter og 40 præoperativ CRC patienter blev underkastet Clinprot analyse. De vigtigste klinisk-patologiske karakteristika patienter viste i tabel S1. Repræsentative spektre for hver af disse grupper er vist i fig. 1A, og forskelle i topposition og peak intensitet kan observeres. Brug MALDI-TOF analyse blev 70 skelnes toppe i 1000 til 10.000 m /z interval identificeret mellem serumprøver fra kontrol og ACA patienter, og 43 af disse toppe var statistisk signifikant (P 0,01, detaljer i Materials S1). Desuden 61 toppe var skelnes mellem kontrol-sera og CRC patient sera, med 54 af disse toppe bliver statistisk signifikant (P 0,01, detaljer i Materials S2)

A:. Repræsentant masse spektre af kontrol serum (en ), serum fra en patient med ACA (b), og serum fra en patient med CRC (c). B: MALDI /MS /MS-spektre af ionerne ved m /z 1943,95 (a) og m /z 2081,01 (b). Panel c giver resultaterne fra Mascot databasesøgning, som viste begge toppe svarer til Kininogen-1.

Brug hver femte peak, GA var i stand til at generere cross-valideret klassifikationsmodeller for de forskellige grupper. Den bedste forudsigelse modeller (detaljer i tabel 1) opnået en anerkendelse kapacitet på 98,96%, 100,00%, og 100,00% for sammenligninger af CRC og kontrol, ACA og kontrol, og ACA og CRC hhv. Desuden er de på tværs af gyldighedsperioder estimater var 95,49%, 100,00%, og 98,19%, henholdsvis.

Identifikation af CRC Markers

En højere koncentration af peptider med m /z-værdier for 1943 og 2081 var tydelige i CRC spektre, endnu ikke i kontrol spektre (

P

0,01). Brug MALDI-TOF /TOF-MS og Mascot databasen (fig. 1B), MS /MS fragmentering af disse to peptider identificerede følgende sekvenser, NLGHGHKHERDQGHGHQ og HNLGHGHKHERDQGHGHQ hhv. Desuden blev disse peptider fundet at repræsentere regioner i samme kininogen-1 forløber, a2-thiol proteinase inhibitor.

serumkoncentrationer af Kininogen-1 og CEA for de forskellige Sera Grupper

For at validere ekspressionen af ​​kininogen-1 detekteret i sera fra patienter med CRC, blev serum ELISA-assays udført under anvendelse af 366 sera opnået fra 85 raske frivillige, 80 ACA patienter, 143 præoperativ CRC patienter og 58 postoperative CRC patienter. Alder, køn, serum kininogen-1-koncentrationer og CEA koncentrationer blandt forskellige grupper blev vist i tabel 2. De gennemsnitlige koncentrationer af kininogen-1 fundet i kontroller og præoperativ CRC patienter var 153,22 ± 8,43 ug /m og 215.62 ± 7,63 mg /ml, henholdsvis med sidstnævnte er signifikant højere (

P =

0,000). Desuden niveauer af kininogen-1 var signifikant lavere i CRC patienter efter operation (188,04 ± 11,70 ug /ml;

P =

0,044). For ACA patienter var den gennemsnitlige Kininogen-1 koncentrationen opdaget var 194,26 ± 10,14 pg /ml, hvilket var betydeligt højere end for kontrolgruppen (

P =

0,003). Derimod var der ingen signifikant forskel mellem kininogen-1 koncentrationer detekteret for præoperativ CRC patienter og ACA patienter (

P =

0,082).

For serum CEA koncentrationer niveauer for præoperativ CRC patienter, postoperative CRC patienter, ACA patienter og kontroller var 14,66 ± 2,25 mg /l, 4,48 ± 0,72 mg /l, 3,10 ± 1,15 mg /l, og 2,43 ± 0,28 mg /l, henholdsvis (ACA

vs.

sund kontrol,

P =

0,797;.. CRC

vs

sund kontrol,

P =

0,000)

diagnostisk Værdi af Serum Kininogen -1 og CEA for kolorektal tumorer

for at evaluere den diagnostiske værdi af kininogen-1, blev udført en ROC-kurve analyse. Som vist i fig. 2 Aa, arealet under ROC-kurven (AUC) for serum Kininogen-1 i association med en diagnose af ACA var 0,635 (95% CI: fra 0,551 til 0,719, P = 0,003), mens AUC forbundet med en diagnose af CRC var 0,706 (95% CI:. 0,635 til 0,777, P = 0,000, fig 2 Ac). Baseret på disse ROC kurver, et serum Kininogen-1 koncentration på 162,99 ug /ml blev valgt som den optimale cutoff-værdi til differentiering ACA-patienter og kontroller, med følsomhed, specificitet, positive og negative prædiktive værdier, og nøjagtighed satser er 51,25%, 63,53 %, 56.94%, 58.06%, og 57.58%, hhv. Tilsvarende vil en serum Kininogen-1 koncentration på 173.96 ug /ml blev valgt som den optimale cutoff-værdi til differentiering CRC-patienter og kontroller, med den tilhørende følsomhed, specificitet, positive og negative prædiktive værdier, og nøjagtighed har ligget 63.64%, 65.88%, 75,83%, 51,85% og 64,47%, henholdsvis

a:. The ROC-kurven for serum kininogen-1 (a) og CEA (b) for en diagnose af ACA, og ROC-kurven for serum kininogen- 1 (c) og CEA (d) for en diagnose af CRC. B: En sammenligning af følsomheden (Se), specificitet (Sp), positiv prædiktiv værdi (PV +), negativ prædiktiv værdi (PV-), og nøjagtighed (AC) priser til detektering af kininogen-1 og CEA for en diagnose af hertugens stadium a og b CRC (a) eller Dukes stadie C og D CRC (b)

AUC for serum CEA som en diagnose af ACA var 0,459 (95% CI:. 0,370-0,547, P . = 0,358, fig 2 Ab), og som en diagnose af CRC var 0,695 (95% CI: 0,627-0,767, P = 0,000, fig 2 Ad).. Den bredt accepteret cutoff værdi på 5 ug /l for serum CEA blev anvendt i denne undersøgelse, da cutoff-værdien beregnes ud fra ROC-kurven var 5,095 ug /L. Derfor blev fundet, ved hjælp af denne cutoff værdi for differentiering CRC patienter og kontroller, følsomhed, specificitet, positive og negative prædiktive værdier og nøjagtighed satser til at være 38,46%, 85,88%, 82,09%, 45,34%, og 56,14%, henholdsvis. Således blev CEA associeret med lavere følsomhed og nøjagtighed sammenlignet med kininogen-1.

De førnævnte fem parametre blev også anvendt til at vurdere kininogen-1 og CEA detektering for hertugens stadium A og B CRC patienter. For kininogen-1, satserne var 70,13%, 65,88%, 65,06%, 70,88%, og 67,90%, henholdsvis. For CEA, satserne, der var 38,96%, 85,88%, 71,43%, 60,83%, og 63,58%, henholdsvis. Bortset specificitet og positive prædiktive værdier, værdierne af de andre parametre, der er forbundet med kininogen-1 var bedre end dem, for CEA (fig. 2 Ba). Når patienter hertugens etape C og D CRC blev analyseret, de førnævnte fem parametre for kininogen-1 var 72,73%, 65,88%, 62,34%, 75,68%, og 68,87%, henholdsvis og for CEA, var 34,85%, 85,88%, 65,71 %, 62,93% og 63,58%, henholdsvis. Svarende til hertugens trin A og B CRC patienter, parametrene for kininogen-1, med undtagelse af specificitet og positive prædiktive værdier, var bedre end dem, for CEA (fig. 2 Bb). Desuden blev følsomhed, negative prædiktive værdier og nøjagtighed blev forbedret, når CRC patienter havde et positivt resultat for serum kininogen-1 og /eller serum CEA. I modsætning hertil specificitet satser forbundet med disse positive tests væsentligt reduceret (tabel 3).

Expression Niveauer af Kininogen-1 i Normal Colorectal mucosa, ACA Væv, og CRC Væv

Kininogen -1 kan påvises i blodet under fysiologiske betingelser. Det forbliver imidlertid uklart, om højere niveauer af kininogen-1 detekteret i serum fra patienter med colorektale tumorer stammer fra selve colorektal tumor. Derfor blev immunhistokemiske assays udført for at vurdere ekspression af kininogen-1 i kolorektale væv. I alt 75 normale kolorektale mucosa væv, 77 ACA væv og 248 CRC væv blev undersøgt. Ingen signifikant forskel i ekspressionen af ​​kininogen-1 blev fundet mellem hanner versus kvinder blandt de tre grupper (

P

. 0,05;. figur 3D)

Repræsentative immunfarvninger af kininogen-1. i normal colorektal mucosa (A), ACA væv (B), og CRC væv (C). Både oversigt (20 ×) og forstørrelse (40 ×) billeder er forudsat, med sidstnævnte leveres som indsatsbokse i øverste venstre hjørne af hvert panel. D: Kvantificering af kininogen-1-niveauer i kontrol-, ACA, og CRC-grupper. E: Overlevelse kurver for kontrol, ACA, og CRC-grupper. Den blå linje repræsenterer CRC patienter negative for kininogen-1-ekspression og den grønne linje repræsenterer CRC patienter positive for kininogen-1-ekspression.

Korrelation af Kininogen-1 Expression med klinisk-patologisk funktioner i ACA og CRC Patienter

Korrelationer mellem cytoplasmatiske kininogen-1-niveauer og klinisk-patologiske træk ved ACA og CRC patienter blev analyseret separat. Mens cytoplasmatisk akkumulering af kininogen-1 viste sig at negativt korrelere med væv histologi for ACA patienter (

r

s

= -0,250, P = 0,029), det ikke korrelerer med tumor placering, tumorstørrelse, eller kvalitet af intraepitelialneoplasi (alle

P

0,05, detaljer i tabel S2). I modsætning hertil cytoplasmatisk ophobning af kininogen-1 signifikant korreleret med hertugens scene og lymfeknude metastaser status for CRC’er (

r

s

= 0,151, P = 0,018 og

r

s

= 0,128, P = 0,045, henholdsvis). Men det ikke korrelerer med tumor placering, tumorstørrelse, tumor celledifferentiering, eller fjernmetastaser (alle

P

0,05, detaljer i tabel S3).

Survival Analysis

CRC patienter (n = 110) blev yderligere analyseret for at vurdere en mulig sammenhæng mellem kininogen-1 immunreaktivitet og patient overlevelse. I figur 3E, overlevelseskurven ifølge cytoplasmatiske kininogen-1-niveauer er vist. Den gennemsnitlige overlevelsestid for CRC patienter med negativ versus positiv kininogen-1-ekspression var 45,21 ± 3,17 måneder og 38.15 ± 3,07 måneder hhv. Således patienter med negativ kininogen-1-ekspression havde en længere overlevelse periode end dem med positive kininogen-1-ekspression, selv om forskellen ikke var signifikant (

P =

0,166).

Diskussion

Screening for adenomer og tidlige fase CRC er faldet forekomsten og dødeligheden for CRC i USA i de seneste årtier [3]. Men de nuværende screeningsmetoder ikke giver god følsomhed. Derfor er indsatsen fortsat være rettet mod at udvikle nye diagnostiske eller screening serum markører for CRC. Derudover har fremskridt inden proteomics teknologi lettet identifikationen af ​​hidtil ukendte biomarkører. Især har Clinprot teknologi vist sig at tilvejebringe yderst nøjagtige og reproducerbare resultater, en god grad af følsomhed, og er forenelige med et højt throughput format for hurtig identifikation af proteiner [21]. Derfor har proteomiske profiler for forskellige humane sygdomme blevet opnået under anvendelse Clinprot metodik [22] – [24]. I den foreliggende undersøgelse, at Clinprot protokollen tilvejebragt forudsige modeller for CRC og ACA versus raske kontrolpersoner, og også mellem ACA og CRC. Desuden kapacitet på disse modeller anerkendelse var 98,96%, 100,00%, og 100,00%, hhv. Således Kininogen-1 blev identificeret som et potentielt markør for CRC og ACA, og disse resultater blev valideret ved anvendelse af ELISA. Tilsammen disse resultater bekræfter nøjagtigheden af ​​Clinprot teknologi.

Akkumulerende beviser fortsætter med at vise en rolle for kininogen-1 i carcinogenese [25]. For eksempel er der fundet signifikant reducerede niveauer af kininogen-1 i urinen hos patienter med ovariecancer sammenlignet med kontrolindivider [26]. Tidligere undersøgelser har også vist, at kininogen-1 udviser antiangiogeniske egenskaber og medierer hæmmende handlinger på spredning af endotelceller [27]. Desuden i kræftpatienter, er blevet opdaget, lavere niveauer af kininogen-1-ekspression i blodprøver, og disse niveauer kan bidrage til overlevelsen af ​​kræftceller til stede [28]. Imidlertid rolle kininogen-1 i carcinogenese, især i CRC, er forblevet uklar. I den foreliggende undersøgelse, serum Kininogen-1-niveauer hos patienter med ACA eller CRC blev fundet at være signifikant højere sammenlignet med de raske kontroller. Det er almindeligt accepteret, at ACA er en præcancerøse læsion af CRC [29]. Således er en signifikant stigning i serum Kininogen-1-niveauer i disse patienter kan udgøre en markør for tidlig påvisning af CRC, og dette er i overensstemmelse med resultaterne af Qiu

et al.

[30]. Selv om der i en undersøgelse af kininogen-1-ekspression påvist i 118 plasmaprøver opnået fra patienter med gastrointestinal cancer, signifikant lavere niveauer af kininogen-1 blev påvist [31]. Mens dette er i modsætning til resultaterne af den foreliggende undersøgelse, kan denne forskel skyldes forskelle i prøvestørrelse, prøvens ressourcer, og metoden til detektion anvendes.

Målinger af CEA-niveauer har vist sig at være uegnet til population screeninger på grund af manglende følsomhed denne analyse i de tidlige stadier af CRC [32], [33]. Et panel af American Society of Clinical Oncology har også anbefalet mod CEA test for CRC-screening [34]. Tilsvarende CEA assays udført i den foreliggende undersøgelse viste ingen diagnostisk værdi for ACA (AUC = 0,453), og også udviste en lavere følsomhed (38.96%

vs.

70.13%) og nøjagtighed (63,58%

vs

67,90%) for hertugens stadium A og B CRC, sammenlignet med kininogen-1. Disse resultater viser, at overvågningen serumniveauer af kininogen-1 er mere værdifuld end påvisning CEA i de tidlige stadier af CRC. Desuden, når begge serumniveauer af kininogen-1 og niveauer af CEA blev overvåget i CRC patienter, specificiteten og positive prædiktive værdi af disse resultater forbedres. Derfor anbefales påvisning af kininogen-1 i kombination med andre tumormarkører. Desuden, hvis en patient viser sig at være positive for kininogen-1 og CEA, men negativ for alpha føtalt protein, så er det muligt at han /hun lider af CRC snarere end leverkræft. vil være behov for yderligere undersøgelser for at bekræfte denne hypotese.

I postoperative CRC patienter, serumniveauer af kininogen-1 var lavere end præoperative CRC patienter. Selvom det er uklart, hvorfor dette blev observeret, er det en hypotese, at øget produktion af Kininogen-1 stammer fra tumorvæv. Dette understøttes af de immunhistokemiske opnåede resultater, der viste kininogen-1 akkumuleret i cytoplasmaet i colorektale tumorceller. Imidlertid er de mekanistiske detaljer i denne proces er fortsat uklare. Desuden cytoplasmatisk akkumulering af kininogen-1 signifikant korreleret med lymfeknudemetastaser status hos patienter med CRC. Men en overlevelse analyse af CRC patienter i henhold til Kininogen-1-ekspression fundet nogen signifikant forskel mellem negative og positive kininogen-1-ekspression gruppe, angiver prognosen værdien af ​​kininogen-1 er begrænset.

Så vidt vi ved, er dette er den første undersøgelse til at rapportere påvisning af kininogen-1 i ACA og CRC patienter, med validering af ELISA og immunhistokemi. Baseret på disse resultater, kininogen-1 synes at være en potentiel CRC markering, som kan være værdifulde til tidlig påvisning af CRC, især i kombination med andre biomarkører i befolkningens screeninger for CRC. En analyse af yderligere patienter, herunder standardiseret behandling af prøverne opnåede, er nødvendig for at kontrollere og udvide de nuværende resultater. Desuden er mekanistiske studier af kininogen-1 i kolorektale tumorer berettiget.

Støtte oplysninger

tabel S1.

De vigtigste klinisk-patologiske karakteristika patienter inkluderet i opdagelse og validering kohorter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0070519.s001

(DOC)

tabel S2. .

Sammenhængen mellem kininogen-1-ekspression og clinicopathologic funktioner i ACA patienter

doi: 10,1371 /journal.pone.0070519.s002

(DOC)

tabel S3. .

Sammenhængen mellem kininogen-1-ekspression og clinicopathologic funktioner i CRC patienter

doi: 10,1371 /journal.pone.0070519.s003

(DOC)

Materialer S1.

ClinProt Peak Statistik mellem sund kontrol og ACA patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0070519.s004

(XLS)

Materialer S2.

ClinProt Peak Statistik mellem sund kontrol og CRC patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0070519.s005

(XLS)

anerkendelser

Forfatterne takker Profs . Yali Zhang og Yadong Wang, for deres forslag om patologi.