PLoS ONE: Undertrykkelse af Core 1 Gal-transferase er forbundet med reduktion af TF og gensidig Forhøjelse af Tn, sialyl-Tn og Core 3 Glykaner i Human Colon Cancer Cells

Abstrakt

Det har længe været formodet, dog med overraskende lidt dokumentation, en konkurrence mellem Core 1 Gal-transferase (C1GalT), Core 3 GlcNAc-transferase (C3GnT) og sialyl-transferase (ST6GalNAc-T) for forlængelse af O-bundne glycaner mucin-type indledt med GalNAcα-Ser /Thr. Denne undersøgelse testet denne formodning ved selektiv undertrykkelse af en af ​​disse glycosyltransferaser og derefter analyseret udtrykkene for de enzymatiske produkter af de tre andre glycosyltransferaser. Det blev konstateret, at siRNA undertrykkelse af C1GalT markant reduceret ekspression af Galβ1,3GalNAcα- (Core 1) og i mellemtiden øget udtrykkene for sialyl-GalNAcα- (sialyl-Tn), GalNAcα- (Tn) og GlcNAcβ1,3GalNAcα- ( Core 3) associeret glycaner i humane tyktarmskræft HT29 og SW620 celler. Dette understøtter en konkurrencedygtig modifikation af GalNAcα-Ser /Thr mellem C1GalT, C3GnT og ST6GalNAc-T i O-glycan biosyntese. Som Tn, TF og sialyl-Tn er onkoføtalt antigener og er over-udtrykt i de fleste menneskelige kræftformer, denne information er nyttig for udviklingen af ​​glycosyltransferase målrettet terapeutiske strategier til behandling af cancer

Henvisning:. Barrow H, Tam B, er Duckworth CA, Rhodes JM, Yu LG (2013) Undertrykkelse af Core 1 Gal-transferase associeret med Reduktion af TF og gensidig Forhøjelse af Tn, sialyl-Tn og Core 3 Glykaner i Human Colon Cancer Cells. PLoS ONE 8 (3): e59792. doi: 10,1371 /journal.pone.0059792

Redaktør: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasilien

Modtaget: 19 oktober, 2012; Accepteret: 18 februar 2013; Udgivet: 25 marts 2013

Copyright: © 2013 Barrow et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af en bevilling (CR777) fra forskningsfonden North West Kræft og en University of ph.d. Studentship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Lu-Gang Yu er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Forfatterne bekræfter, at denne redaktionen medlemskab ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

biosyntesen af ​​

O

-forbundet mucin typen glycaner er en multi-trådt, sekventiel, posttranslationel proces katalyseres af de udtryk og aktiviteter i en række glycosyltransferaser. Biosyntesen processen starter med tilsætningen af ​​

N

acetyl-galactosamin (GalNAc) til serin (Ser) eller threonin (Thr) -rester fra fuldt foldede /sammensatte proteiner til dannelse af den oprindelige O-bundne GalNAcα- Ser /Thr struktur (Tn-antigenet) katalyseres af en eller to af en stor familie af op til 20 distinkt UDP-N-acetyl-α-D-galactosamin polypeptid GalNAc-transferaser (ppGalNAc-Ts) [1], [2]. Disse ppGalNAc-T isoenzymer har forskellige, men delvist overlappende, peptid specificiteter til proteiner ved forskellige Ser og Thr sites og udtrykkes forskelligt i celler og væv under udviklingen, differentiering og sygdomstilstande såsom cancer [3], [4], [5 ]. Denne første trin i biosyntesen for O-bundne mucin typen glykaner menes at starte i en inter ER-Golgi rum [6], [7], [8] og finish i Golgi apparatet [9], [10].

efter dannelsen af ​​GalNAcα-Ser /Thr, kan GalNAc rest modificeres med en Gal rest katalyseret af Core 1 Gal-transferase (C1GalT) [11] for dannelsen af ​​Core 1 struktur, Galβ1,3GalNAcα – [Thomsen-Friedenreich (TF) antigen]. Den GalNAc rest af GalNAcα-Ser /Thr kan også ændres med en GlcNAc rest katalyseret af Core 3 GlcNAc-transferase (C3GnT) for dannelsen af ​​Core 3 struktur GlcNAcβ1,3GalNAcα-. GalNAc rest af GalNAcα-Ser /Thr kan også modificeres med en sialinsyrerest af en sialyl-transferase (ST6GalNAc-T) for at danne sialinsyre-β1,6GalNAcα- (sialyl-Tn) antigen [12], [13] . ST6GalNAc-I menes at være den fremherskende sialyl-transferase for dannelsen af ​​sialyl-Tn [13]. Dannelsen af ​​sialyl-Tn afslutter sukkerkæde mens TF og Core 3 strukturer kan yderligere påvirkes af andre glycosyltransferaser på en trinvis måde for at give op til 8 core kompleks glycosylerings strukturer [14]. Kernen 1 til 3 glykanstrukturer kan også modificeres ved acetylering, fucosylering, sialylering eller sulfatering.

Det har længe været spekuleret på, at C1GalT, C3GnT og ST6GalNAc-T konkurrerer om at ændre GalNAc rest af de nyligt syntetiseret GalNAcα-Ser /Thr for dannelsen af ​​TF, Core 3 eller sialy-Tn strukturer i levende celler [15], [16], [17]. Dog er direkte beviser, der understøtter denne konkurrenceprægede modifikation af galna-modifikation overraskende mangler. Mutation eller inaktivering af Cosmc, en ER-lokaliserede molekylære chaperone, der er påkrævet for enzymaktiviteten af ​​C1GalT [18], har vist sig at være forbundet med Tn syndrom, en sjælden autoimmun sygdom, hvor subpopulationer af blodcellerne bære ufuldstændigt glycosyleret Tn-antigenet [19]. Behandling af humane cancerceller med O-glycosylering inhibitor Benzyl-GaINAc, en kompetitiv inhibitor for C1GalT transferase og alfa-2,3-sialyltransferase, formindsker ekspression af cellulære sialinsyrer og øger ekspressionen af ​​TF [20].

i denne undersøgelse vurderede vi konsekvenserne af selektiv undertrykkelse af C1GalT af siRNA på udtryk for TF, Tn, sialyl-Tn og Core 3-associerede glycaner i humane coloncancer-celler.

Materialer og metoder

Materialer

siRNA konstruktioner mod C1GalT og scrambled kontrol ikke-targeting siRNA blev opnået fra Dharmcon (Perbio Science, Northumberland, UK). Biotinylated-

Griffonia simplicifola

lektin II (GSL-II) blev købt fra Vector laboratorier (Peterborough, UK). Monoklonale antistoffer mod Tn (klon HB-TN1) og sialyl-Tn (klon HB-STn1) blev indkøbt fra Dako (Pathology Products, Ely, UK). FITC-konjugeret jordnøddeagglutinin (FITC-PNA) blev opnået fra Sigma.

cellelinier

Menneskelig tyktarmskræft HT29 og SW620 celler blev opnået fra den europæiske Celledyrkning Collection på Public Health Laboratory, Porton Down Wiltshire, UK og dyrket i DMEM suppleret med 10% FCS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 4 mM glutamin som tidligere beskrevet [21].

Undertrykkelse af C1GalT Ekspression af siRNA

cellerne blev dyrket in triplo i 96-brønds plader (5,0 x 10

3 celler /brønd) i anti-biotiske DMEM indeholdende 5% FCS ved 37 ° C i 24 timer før inkuberet med eller uden 100 nM siRNA mod C1GalT eller kontrol scrambled ikke-targeting siRNA ved 37 ° C i 48 timer. Cellerne blev vasket og lyseret for protein kvantificering og slot blotting.

Slot Blotting

De cellulære protein ekstrakter blev blottet til nitrocellulose membran med PR600 SlotBlot (Hoeffer Scientific Instruments, CA). Blottene blev blokeret med 5% BSA, 0,5% Tween-20 i PBS ved 4 ° C natten over før anvendelse af monoklonale antistoffer mod TF (TF5) (0,2 ug /ml) [22], Tn (0,2 ug /ml), sialyl -Tn (0,03 ug /ml) eller biotinyleret GSL-II (0,6 ug /ml) i 1 time. Efter vask og efterfølgende anvendelse af peroxidase-konjugeret sekundært antistof (3 ng /ml) eller peroxidase-Extravidin (Sigma, 1:10,000 fortynding) i 1 time, blev blottene vasket og visualiseret under anvendelse af en chemiluminescens Super-signal immunoblotting detektion kit (Pierce , Rockford IL, USA). Densitometrianalyse af blottene blev udført ved anvendelse Billede Lab-software (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK).

Fluorescens Immunhistokemi

SW620-celler blev dyrket i 8-brønds kammerobjektglas (BD Biosciences) (1 × 10

4 celler /brønd) i anti-biotiske DMEM indeholdende 5% FCS ved 37 ° C i 24 timer inden inkubering med eller uden 100 nM siRNA mod C1GalT eller kontrol krypteret ikke-targeting siRNA ved 37 ° C i 48 timer. Cellerne blev fikseret i 2% paraformaldehyd i 10 min. Efter to gange vask med PBS blev cellerne inkuberet med 10% kaninserum i 1 time før påføring af antistoffer mod STN, Tn (begge 1/100 fortynding i 10% kaninserum), FITC-PNA (5 ug /ml) eller biotinyleret GSL-II (5 ug /ml) i 2 timer. Cellerne blev vasket med PBS og anvendt med FITC-konjugeret sekundært antistof (1:100 fortynding) eller FITC-streptavidin (1:1,000 fortynding) i 1 time. Cellerne blev vasket med PBS, monteret med DAPI-indeholdende Fluorescensmonteringsmedium og afbildes med et Olympus B51 fluorescens mikroskop under anvendelse af et 40x objektiv.

Resultater og Diskussion

Suppression af C1GalT blev opnået ved siRNA behandling af humane coloncancer HT29 og SW620 celler. Effektiviteten af ​​C1GalT knock-down blev overvåget ved cellulær ekspression af TF med anti-TF-antistof. C1GalT siRNA behandling af HT29-celler i 48 timer forårsagede effektiv undertrykkelse af C1Gal1T ekspression som manifesteret ved 86 ± 3% (middelværdi ± SD) reduktion af cellulær TF-ekspression (fig. 1 A og B). En tilsvarende reduktion af TF ekspression blev også observeret i SW620 celler efter C1GalT siRNA behandling (figur 2 A og B).

A:. HT29 glycan ekspression i celle respons på C1GalT siRNA eller kontrol siRNA. Efter behandling af cellerne med C1GalT siRNA eller kontrollere ikke-targeting siRNA (con-siRNA), cellulære udtryk for TF, Tn, sialyl-Tn og GSL-II binding (GlcNAc-, Core 3-associeret glykaner) blev vurderet ved slot blots med monoklonale antistoffer mod TF (TF5), Tn (HB-TN1), sialy-Tn (HB-STn1) eller med biotin-GSL-II. Parallelle blots blev probet med antistof mod β-actin for lige protein loading. Identiske vurderinger er vist for hver blot. B: Kvantificering af udtrykkene for cellulær TF, Tn, sialy-Tn og GSL-II-bindende (GlcNAc-, Core 3-associeret glycaner) i HT29-celle respons på C1GalT siRNA. Tætheder af de slots blots blev kvantificeret * og glycan udtryk er udtrykt som procentvis ændring til den ikke-siRNA kontrol efter normalisering med protein loading. * Blottet tætheder af TF udtryk fra ubehandlede og C1GalT siRNA behandlede HT29-celler var 5004 og 715; Tn 1314 og 4345; sialyl-Tn 1634 og 4868; GSL-II binding (Core 3) 489 og 1156 og tublin 1898 og 1928.

A: SW620 glycan udtryk i celle respons på C1GalT siRNA eller kontrollere siRNA. Efter behandling af cellerne med C1GalT siRNA eller kontrollere ikke-targeting siRNA (con-siRNA), cellulære udtryk for TF, Tn, sialyl-Tn og GSL-II binding (GlcNAc-, Core 3-associeret glykaner) blev vurderet ved slot blots med monoklonale antistoffer mod TF, Tn, sialy-Tn eller med biotin-GSL-II. Parallelle blots blev probet med antistof mod β-actin for lige protein loading. Identiske vurderinger er vist for hver blot. B: Kvantificering af udtrykkene for cellulær TF, Tn, sialy-Tn og GSL-II-bindende (GlcNAc-, Core 3-associeret glycaner) i SW620 celle respons på siRNA C1GalT. Tætheder af de slots blots blev kvantificeret * og glycan udtryk er udtrykt som procentvis ændring til den ikke-siRNA kontrol efter normalisering med protein loading. * Blottet tætheder af TF udtryk fra ubehandlede og C1GalT siRNA behandlede SW620 celler 5144 og 834; Tn 1437 og 4313; sialyl-Tn 1748 og 4792; GSL-II binding (Core 3) 481 og 1229 og tublin 1984 og 1982.

Under effektivt undertrykt den C1GalT udtryk, vi derefter sammenlignet de cellulære udtryk for sialyl-Tn (STN), Tn og Core 3 glycaner. Udtrykkene for cellulær sialyl-Tn og Tn glykaner blev vurderet ved slot blots med antistoffer mod sialy-Tn og Tn. Ingen antistof mod Core 3 glycan er i øjeblikket tilgængelig, og vi brugte derfor

Griffonia simplicifola

lektin II (GSL-II) binding som en indikator af ekspressionen af ​​Core 3-associerede glykaner. GSL-II er et lektin isoleret fra

Griffonia (Bandeiraea) simplicifola

og anerkender a- og p-linked GlcNAc rester på den ikke-reducerende terminal af alle oligosaccharider [23]. Det konstateredes, at undertrykkelse af C1GalT resulterede i 198 ± 8% stigning af sialyl-Tn og 136 ± 24% stigning af GSL-II-bindende (GlcNA-, Core 3), henholdsvis i HT29 og 174 ± 11% og 155 ± 37 % stigning i SW620-celler (fig. 1 og fig. 2). Undertrykkelse af C1GalT blev også set at blive ledsaget af en markant stigning af Tn udtryk i HT29 (231 ± 6%) og SW620 (200 ± 5%) celler.

For at bekræfte disse glycosylerings ændringer observeret af slot blot, vi yderligere analyseret udtryk for disse glycaner i SW620 celler i deres respons på C1GalT siRNA ved immunohistochemstry. Behandling af cellerne med C1GalT siRNA viste igen tydelig reduktion af cellulær TF ekspression (PNA-binding) og markeret forøgelse af Tn, sialyl-Tn og Core 3 (GSL-II-bindende) udtryk, mens behandling af cellerne med kontrol-siRNA viste ringe virkning på udtrykkene for disse glykaner (fig. 3).

Sub-sammenflydende SW620 celler dyrket i 8-brønds glas kammer slides blev behandlet uden eller med C1GalT siRNA eller kontrollere ikke-targeting siRNA i 48 timer, før de udtryk for celle TF, Tn, sialyl-Tn og GSL-II-bindende (Core 3-associeret) glycaner blev vurderet ved hjælp af fluorescens immunohistokemi anvendelse af biotin-PNA, biotin-GSL-II eller antistoffer mod Tn (HB-TN1) eller sialyl-Tn (HB -STn1). Repræsentative billeder vises.

Disse resultater viser, at suppression af C1GalT der styrer biosyntesen af ​​Core 1 strukturen af ​​mucin type O-bundne glykaner er ledsaget af øgede udtryk for sialyl-Tn og GSL- II binding (Core 3) i humane colon cancerceller. Dette understøtter den længe mistænkt konkurrencedygtig modifikation af GalNAc rest af GalNAcα-Ser /Thr mellem C1GalT, C3GnT og ST6GalNAc-T i biosyntesen af ​​komplekse O-bundne mucin typen glycaner. Et skematisk diagram af påbegyndelsen og forlængelse af mucin typen O-bundne glykaner, understøttet af denne undersøgelse, er vist i figur 4.

Suppression af C1GalT sås også i denne undersøgelse at resultere i markant stigning i cellulær Tn udtryk. Dette indikerer, at det endelige dannelse af cellulære TF, Tn, sialyl-Tn og Core 3 glycaner styres ikke alene af aktiviteten af ​​disse konkurrencedygtige glycosyltransferaser. Koncentrationerne af nukleotid sukker-donor og hastigheden af ​​substratet transport hele Golgi tidligere er blevet vist at bidrage til udtrykkene for specifikke glycaner [17]. Den relative placering af glycosyltransferaser inden Golgi er også rapporteret at være en vigtig determinant. Arbejde ved Kellokompu og kolleger [24], [25] og af os selv [26] har vist, at Golgi forstyrrelse forekommer i epiteliale cancere og kan efterlignes ved midler, der blokerer normal Golgi forsuring, i begge tilfælde fører til forøget dannelse af onkoføtalt carbonhydrat-antigener . Endvidere kan ekspressionen og virkningen af ​​ER-lokaliserede molekylære chaperoner også spille en rolle i ekspressionen af ​​de onkoføtalt glycaner ved at styre foldningen og dermed aktiviteten af ​​de relevante glycosyltransferaser [18]. Således de overordnede cellulære udtryk for Tn, sialy-Tn, TF og Core 3 strukturer er konsekvensen af ​​en række komplekse faktorer, der omfatter konkurrence mellem de relevante glycosyltransferaser, det rumlige arrangement af glycosyltransferaser i Golgi, tilgængeligheden af ​​nukleotid sukker -donors i Golgi apparatet og handlinger relevante molekylære chaperoner.

Tn, TF og sialyl-Tn-antigener er alle kendt som onkoføtalt kulhydrat strukturer. De udtrykkes i føtal epitel derefter bliver skjult af andre sukkerarter rester i raske voksne væv, men opstår igen i kræft og forstadier til kræft dysplastiske celler. Det anslås, at op til 90% af alle humane cancere bære disse onkoføtalt carbonhydrat-antigener [27], [28], [29], [30]. Øget forekomst af disse onkoføtalt carbohydratstrukturer er forbundet med udviklingen og progressionen af ​​forskellige humane cancere, herunder bryst- [31], colon [27], [32] og pancreas [33] cancere. Stigende tyder på, at ændring af disse onkoføtalt glycaner kan spille en aktiv rolle i metastaser. Deletion af intestinale Core 1-afledt O-glycaner er for nylig blevet vist at forårsage spontan colitis hos mus [34]. Nedregulering af C3GnT6 ekspression er forbundet med øget dysplasi /neoplasi i human colorectal cancer [35]. Over udtryk for sialyl-Tn-antigen af ​​cancerceller har vist sig at forårsage mere aggressiv celle adfærd, såsom øget vedhæftning til ekstra-cellulær matrix og øget migration og invasion

in vitro

[36], [37] og

in vivo

i svær kombineret immundefekt (SCID) mus [37]. Overekspression af ST6GalNAc-I har vist sig at være co-lokaliseret med sialyl-Tn i human intestinal metaplasi samt i gastrisk carcinom og er blevet foreslået at spille en vigtig rolle i sialyl-Tn overekspression i cancer betingelser [12], [13] . En øget samspil mellem TF udtrykt på cancerassocieret mucin protein MUC1 og cirkulerende galectins, som følge af den forøgede ekspression af TF-udtrykkende MUC1 af cancerceller og også af den øgede frigivelse af galectins ved cancer /stromale /immune væv /celler i cirkulationen, som begge er fælles træk i cancer, har vist sig at fremme cancercelle metastatisk spredning til fjerne organer [21], [38], [39]. Denne virkning af TF /MUC1-galectin interaktion forekommer som et resultat af den forøgede cancercelle heterotypisk adhæsion til vaskulært endotel [38] og også som et resultat af cancercelle homotypisk aggregering til dannelse mikro-tumor emboli, der forlænger tumorcelleoverlevelse i cirkulation og tillade logi inden kapillærer på metastatisk site [40], [41]. Det er også blevet rapporteret, at brystkræftpatienter med højere niveauer af anti-TF-antistof viser bedre prognose end de patienter med lavere anti-TF-niveauer [42]. Målretning disse onkoføtalt glycaner ved immunterapi med TF-efterligner peptider til potentiel behandling af kræft har vist lovende resultater i mus [43].

Således konkurrencen mellem glycosyltransferaser om ændring af den GalNAc rest af GalNAcα-Ser /Thr og dens konsekvenser for ekspressionen af ​​onkoføtalt kulhydrat-antigener indebærer en potentielt nyttig strategi for udvikling af glycosyltransferase målrettede behandlinger for kræft.