PLoS ONE: Tumor Cell heterogenitet småcellet lungekræft (SCLC): fænotypiske og funktionelle forskelle forbundet med Epithelial-Mesenchymale Transition (EMT) og DNA-methylering ændringer

Abstrakt

småcellet lungekræft (SCLC) er en specifik undertype af lungekræft præsentere som meget metastatisk sygdom med ekstremt dårlig prognose. Trods reagere oprindeligt godt at kemo- eller strålebehandling, SCLC næsten altid tilbagefald og udvikler resistens over for kemoterapi. Dette er mistænkt for at være relateret til tumor celle subpopulationer med forskellige karakteristika ligner stamceller. Epithelial-Mesenchymale Transition (EMT) vides at spille en central rolle i metastatiske processer og i udviklingen af ​​lægemiddelresistens. Dette gælder også for NSCLC, men der er meget få oplysninger om EMT processer i SCLC hidtil. SCLC, i modsætning til NSCLC cellelinier, vokser hovedsagelig i flydende celleklynger og en mindre del som adhærente celler. Vi sammenlignede disse morfologisk forskellige subpopulationer af SCLC cellelinjer til EMT og epigenetiske egenskaber, afsløre betydelige forskelle i de vedhængende subpopulationer med høje niveauer af mesenkymale markører såsom vimentin og Fibronectin og meget lave niveauer af epitel markører som E-cadherin og Zona occludens 1. Desuden ekspression af EMT-relaterede transkriptionsfaktorer, såsom snail /Snai1, Slug /Snai2, og Zeb1, DNA methyleringsmønstre af EMT kendetegnende gener, funktionelle responser som migration, invasion, matrix metalloproteaser sekretion, og modstandsdygtighed over for kemoterapeutisk lægemiddelbehandling alle afveg betydeligt mellem de underlinjer. Denne fænotypiske variabilitet kan afspejle tumorceller heterogenitet og EMT under metastaser

in vivo

, ledsaget af udviklingen af ​​refraktær sygdom i tilbagefald. Vi foreslår, at epigenetisk regulering spiller en central rolle under fænotypiske og funktionelle ændringer i tumorceller og kunne derfor give nye behandlingsmuligheder for SCLC patienter

Henvisning:. Krohn A, Ahrens T, Yalcin A, Plönes T, Wehrle J , Taromi S, et al. (2014) Tumor Cell heterogenitet småcellet lungekræft (SCLC): fænotypiske og funktionelle forskelle forbundet med Epithelial-Mesenchymale Transition (EMT) og DNA-methylering ændringer. PLoS ONE 9 (6): e100249. doi: 10,1371 /journal.pone.0100249

Redaktør: Bernard W. Futscher, The University of Arizona, USA

Modtaget: Februar 4, 2014 Accepteret: 22 maj 2014; Udgivet: 24 Juni 2014

Copyright: © 2014 Krohn et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projekt C3, CRC 850 (til MB), og Deutsche Krebshilfe (110.213 til BH). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lille celle lungekræft (SCLC) er en yderst ondartet og aggressiv pulmonal neoplasme tegner sig for ca. 10-15% af alle lungekræfttilfælde rapporteret. Omkring 30.000 tilfælde diagnosticeres hvert år i USA [1], [2]. Som en separat lunge-cancer undergruppe adskiller sig fra ikke-småcellet lungekræft (NSCLC, herunder pladecellekræft, store celle karcinom, og adenocarcinom), er SCLC karakteriseret ved meget tidlig metastase og dårlig prognose. De fleste patienter til stede med nodal metastaser, og to tredjedele allerede har fjernmetastaser på diagnosetidspunktet [3]. Trods reagere oprindeligt godt at radio- og kemoterapi, langt de fleste tilbagefald med en 1-årige overlevelsesrate for SCLC på kun 40%, og 5-års overlevelse under 5% [4]. Ud fra følgende betragtninger NSCLC behandling er skredet i de seneste år, SCLC behandling fortsat utilfredsstillende [5]. Vi har været vidne til nogen væsentlige fremskridt i dens behandling i de sidste 30 år, siden den standard regime af etoposid i kombination med cisplatin eller carboplatin blev etableret i midten af ​​1980’erne [6]; kirurgisk resektion er undtagelsen og kan kun gavne et mindretal af omhyggelige udvalgte patienter [7]. Der er tydeligvis et akut behov for nye metoder til forståelse og behandling af denne specifikke lungecancer-undertype.

SCLC antager en lang række morfologiske udseende histopatologisk, med tumorceller sædvanligvis mindre end størrelsen af ​​3 hvilende lymfocytter. Der er dog prøver indeholdende celler nå så stort som 7 lymfocytter, hvilket viser deres morfologiske variabilitet [8] inden tumorvævet. Typiske cytologiske funktioner er fint granuleret kromatin, mangel på prominente nucleoli og celle grænser, og udtryk for neuroendokrine markører [8]. Siden 2004, SCLC s WHO klassificering beskriver to undertyper: ren SCLC med mindre end 10% store celler, og kombineret SCLC med over 10% ikke-lille-celle komponenter [9]. Tumorer med en høj mængde ikke-lille-celle-komponenter er beskrevet som værende mere terapi-resistent end ren SCLC [10]. Det er også blevet postuleret, at SCLC tumorer erhverve kemo- og radioresistance under behandlingen, udvikle sig til kombineret SCLC [11].

For at metastaserer, celler nødt til at ændre deres fænotype. Individuelle celler eller små grupper af celler erhverver evnen til at migrere og invadere gennem det omgivende væv basale membran. Under denne proces tumorceller opløse celle-celle-forbindelser, miste deres basal-apikal polaritet, ledsaget af morfologiske ændringer, der viser en spindel form, hvorefter mikrovilli, filopodia og microtentacles bliver udtalt i stedet. Desuden proteaser som matrixmetalloproteinaser (MMP’er) bliver opreguleres, hvilket letter nedbrydning af den ekstracellulære matrix. Disse processer er også kendt som epitel-mesenkymale overgang (EMT) og er blevet beskrevet i en række forskellige cancertyper [12] – [15]. Men der er næsten ingen oplysninger om EMT processer i SCLC hidtil [16]. Der er beviser for, at EMT er afgørende for både metastaser og i forbindelse med kemo- og radioresistance [17]. EMT er en flertrins proces, der involverer udtalt cellulære plasticitet og talrige forskellige genetiske og epigenetiske ændringer [18]. Transkriptionsfaktorer, såsom snail /Snai1, Slug /Snai2, Zeb1 FSP m.fl. forårsage op- og nedregulering af adskillige gener. E-cadherin er blevet beskrevet som en central faktor i overgangen mellem epitel og mesenkymale fænotype. Zeb1 og snail /Snai1 binder til E-cadherin promotoren og repressere transkriptionen af ​​celleadhæsionsmolekyler [19]. Henviser E-cadherin og Zona occludens 1 typisk nedreguleret under EMT, er mesenchymale gener, såsom vimentin, Fibronectin, og MMP’er opreguleret. Epigenetiske ændringer såsom DNA methylering, histon modifikationer og microRNA’er er kendt for at være involveret i EMT-relaterede genregulering [15], og derfor kan også være ansvarlig for ændringer i celle fænotype for at muliggøre at sprede og tilpasning til nye mikro-miljøer.

i denne undersøgelse analyserede vi forskellige celle subpopulationer i SCLC celler linjer, især i NCI-H69-celler, for forskelle i EMT vigtige gener og funktionelle egenskaber. Vi sammenlignede floating-celle aggregater (NCI-H69) med adhærent voksende variant subpopulationer (NCI-H69V). NCI-H69V blev udvalgt fra den parentale cellelinie NCI-H69 og er en variant på grund af lave niveauer af neuroendokrine markører [20]. Sammenligne underlinjer af NCI-H69 afslører klart et andet ekspressionsmønster for EMT markører og DNA-methylering, som på sin side forbundet med funktionelle konsekvenser såsom evnen til invasion, migration, MMP-sekretion og aktivering, celleproliferation, og kemoresistens. Sammenfattende denne undersøgelse postulerer, at der er en del af mesenkymale celler i SCLC-cellelinier, som kunne afspejle

in vivo

situation i SCLC med tumorer indeholdende heterogene tumor cellesubpopulationer med mere eller mindre epitel- og /eller mesenchymal egenskaber, der kan være forbundet med de funktionelle reaktioner i løbet af metastase processer.

Materialer og metoder

Cell kultur og reagenser

Menneskelig SCLC-cellelinjer NCI-H69, NCI-H82 og NCI-N592 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC – Manassas, VA, USA). NCI-H69 og NCI-N592 blev verificeret af LGC Standards cellelinje-godkendelse. NCI-H69V blev venligst stillet til rådighed af BIOSs Toolbox (Freiburg, Tyskland). Desuden blev NCI-H69 og NCI-H69V-celler sammenlignet ved SNP-array (data ikke vist), som viste sig samme cellulære oprindelse. Alle cellelinier blev opretholdt i RPMI (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% penicillin /streptomycin (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) i en fugtig atmosfære (5% CO2) ved 37 ° C. For at vælge for vedhængende subpopulationer blev de vedhængende celler i NCI-H69, NCI-H82 og NCI-N592 holdt i kultur, mens flydende celler blev anbragt over flere passager.

Vækstrater og population fordoblingstid

Vækstrater af NCI-H69 og NCI-H69V blev bestemt seeding 3 * 10

6 celler (i tre eksemplarer) i vævskulturkolber. Celler blev talt på dag 2, 4 og 6 ved anvendelse af et hæmocytometer. For at beregne population fordoblingstid (PDT), formlen PDT = h * ln (2) /ln (c2 /c1) blev anvendt ifølge ATCC retningslinjer.

Immunofluorescens-farvning af vimentin, E-cadherin, Zona occludens og Ki-67

Celler blev fikseret i 2% PFA, permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 ved 4 ° i 10 min, og blokeret med PBS indeholdende 5,0% (v /v) normalt gedeserum og 0,3% (volumen /volumen) Triton X-100. Immunofluorescens-farvning blev udført med muse-mAb Ki-67 (Dako, Hamburg, Tyskland), Vimentin XP Rabbit mAb, E-cadherin kanin mAb og Zona occludens mAb (cellesignalering Technologies, MA, USA), og passende sekundære antistoffer (gede-anti -mouse IgG-Alexa488 og ged-anti-kanin IgG-Alexa467, Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Objektglassene blev derefter monteret med Prolong Gold antifade Reagens med DAPI (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

Reverse transcription PCR-analyse

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy Mini Kit ( Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner, efterfulgt af DNA-fordøjelse med DNase i (Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, UK). Til cDNA-syntese 1 ug totalt RNA blev transkriberet under anvendelse af iScript kit (

Bio-Rad

, Hercules, CA, USA). CDNA blev amplificeret under anvendelse af

Taq

polymerase (Qiagen, Hilden, Tyskland) ved anvendelse efter PCR-programmet for alle primere: 94 ° C i 5 minutter efterfulgt af 28 cykler af 94 ° C 30 sek, 55 ° C 30 sek og 72 ° C i 30 sekunder og sidste runde af amplifikation ved 72 ° C i 5 min. PCR-produkter blev analyseret på en 1,0% agarosegel, visualiseret og fotograferet under UV-lys. For kvantificering blev PCR bands analyseret af ImageJ 1.42q. For primersekvenser se tabel 1.

Fremstilling af celleekstrakter og western blot-analyse Salg

Celler blev vasket med iskold PBS, og lyseret ved hjælp Qproteome pattedyrprotein Prep Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) eller ved lysepuffer indeholdende 20 mM Tris /HCl pH 8,0, 150 mM KCI, 1 mM EDTA, 0,2 mM Na3VO4, 1% Triton X-100, 0,5 mM PMSF med protein inhibitor cocktail (komplet, Roche Applied Science, Basel, Schweiz). Lige mængder af proteinprøver blev denatureret ved 95 ° C i 5 minutter, adskilt af 10% SDS-PAGE og overført til PDVF membraner. Membraner blev derefter blokeret med 5% fedtfri tørmælk i PBS /0,1% Tween-20 og inkuberet natten over med følgende antistoffer: ZO-1 mAB, vimentin XP kanin mAb, E-cadherin kanin mAb, snail kanin mAb, Slug kanin mAb, TCF8 /ZEB1 kanin mAb, β-Catenin kanin mAb Anti-kanin IgG, GAPDH kanin mAb, HRP-bundet antistof (Epithelial-Mesenchymale Transition (EMT) Antibody Sampler Kit # 9782 fra cellesignalering Technologies, MA, USA) og L -Dopa (# 8786 cellesignalering Technologies, MA, USA), Neuron-specifik enolase (NSE) (# 9536 cellesignalering Technologies, MA, USA). Endelig blev immunreaktive bånd visualiseret ved anvendelse peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer og forøget kemiluminescens (Amersham Biosciences, Freiburg, Tyskland)

Pyrosequencing

Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og kvantificeres ved hjælp af et NanoDrop 1000 spektrofotometer (peqlab, Erlangen, Tyskland). DNA blev behandlet med bisulfit under anvendelse af EZ DNA-methylering-Gold Kit (Zymo Research, CA, USA) ifølge producentens instruktioner og opbevaret i portioner ved -20 ° C indtil anvendelse. PCR-primere blev udformet under anvendelse Pyrosequencing Assay Design Software (Qiagen, Hilden, Tyskland) (Tab.2). En universelle mærke blev placeret ved 5′-enden af ​​den sekvensspecifikke revers primer for CDH1 og en tilsvarende universel biotinyleret primer, der indeholder en 5′-biotin label blev tilsat til disse PCR-reaktioner. 5′-enden af ​​den sekvensspecifikke reverse primer anvendes til VIM amplicon 1 og amplikon 2 blev biotinmærket. Amplikonet (spanning -61 til +18 i forhold til TSS) af CDH1 omfattede syv bindingssteder for CpG. I tilfælde af vimentin, blev amplikonet opdelt i to dele, adskilt af en 73 bp hul. Den første amplikon af vimentin mellem nt +608 til +703 i forhold til TSS indeholdt tolv og den anden amplikon (spanning +468 til +537 i forhold til TSS) otte CpG sites hhv. Hver 25 pi PCR reaktion indeholdt 1,5 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP, 0,03 U /pl Hotstart Taq DNA polymerase (Invitrogen, CA, USA), 0,16 uM forward og reverse primer og 1 pi bisulfit behandlede DNA. For CDH1 0,16 uM fremadrettet primer og 0,03 pi tailed reverse primer og 0,14 uM universal biotinyleret primer blev anvendt. Cykling var som følger: 95 ° C i 5 min til indledende denaturering; 50 cykler af denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, varierende annealing temperatur i 30 s og ekstension ved 72 ° C i 30 s. PCR-produkter blev visualiseret på 2% agarosegeler. Hver pyrosekventering reaktion blev opnået med 8-10 pi af hver biotinyleret PCR-produkt og Pyromark Gold Kit ifølge producentens anvisninger på en PyroMark Q96 MD pyrosequencer (Qiagen, Hilden, Tyskland). Kort fortalt blev biotinyleret enkeltstreng DNA immobiliseret på streptavidin-coatede Sepharose High Performance kugler (GE Healthcare, UK) og separeret ved denaturering med 0,2 N NaOH. Efter annealing af sekventeringsprimer (0,25 pM /reaktion) til den biotinylerede enkeltstrengede DNA, blev blandingen underkastet sekventering. Pyrograms blev analyseret under anvendelse af Pyro Q-CpG software til at bestemme methylering niveau af methylerede og ikke-methylerede cytosiner på hvert CpG-sted i amplikon. Hver pyrosekventering analyse blev uafhængigt udført mindst tre gange. Studerendes uparrede t-tests blev udført for at teste statistiske forskelle i det gennemsnitlige methylering niveauet af de analyserede ampliconer. Dyrkede lungefibroblaster isoleret fra tre patienter uden fibrotiske sygdomme tjente som normal kontrol. Primerparrene anvendt til PCR, er angivet i tabel 2.

live-cell proteolyse assay

Labtek 4-brønds kammerobjektglas blev overtrukket med phenol-rød fri basalmembranmatrix, indeholdende 30 ng /ml DQ-Collagen IV (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Efter 12 min størkning, 3 × 10

4-celler i phenol-rødt frit RPMI med 1% FCS blev udpladet på toppen af ​​det overtrukne basalmembranmatrix. Efter 48 timers inkubation blev cellerne fikseret med 2% PFA, farvet med Hoechst og monteret. Nedbrydningsprodukter af DQ-substrat (grøn fluorescens) blev analyseret på et automatiseret mikroskop (scan∧R – Olympus) med en 20x, NA 0.75 UPLSAPO målsætning med Hoechst emission målt ved 440-475 nm og DQ-kollagen ved 520-550 nm . Den gennemsnitlige intensitet af DQ-substrat nedbrydning blev beregnet under anvendelse af scan∧R Analysis Software (v. 1.2.0.6) og normaliseret til antallet af cellekerner.

matrixmetalloproteinase antistof-array

Matrix metalloproteinaser i celle-konditionerede medier blev analyseret med human MMP Array 1 (RayBiotech, Norcross, GA, USA). Celler blev vasket med PBS og inkuberet med FCS-frit og phenol-rød fri RPMI 1640 natten over. Efter centrifugering blev celle-konditioneret medium påført på de for-blokeret membraner, inkuberet ved 4 ° C natten over og bearbejdet i overensstemmelse med producentens anvisninger. Antistof arrays blev kvantificeret med ImageJ software v. 1.42q.

Gelatine Zymografi

MMP-2 og MMP-9 aktiviteter blev vurderet af gelatinezymografi. Celler blev vasket med PBS og inkuberet med FCS-frit og phenol-rød fri RPMI 1640 natten over. Cell konditionerede medier blev koncentreret under anvendelse af Amicon Ultracel 10 k kolonner. Efter bestemmelse proteinkoncentrationer ved Bradford-assay, lige store mængder af protein og 2 pi MMP-2 Zymografi Kontrol (ProteaImmun, Berlin, Tyskland) blev elektroforeret i 7% SDS-polyacrylamidgeler, der indeholder 1 mg /ml gelatine (Merck, Darmstadt, Tyskland) . Geler blev vasket i 2,5% Triton X-100 opløsning i 1 time og derefter inkuberet natten over i inkubationspuffer (0,05 M Tris /HCl pH 7,5, 0,2 M NaCl og 0,005 M CaCl2) ved 37 ° C. Geler blev fikseret i 12% TCA i 1 time og farvet i Coomassie brilliant blue-R250-farvning opløsningen i 1 time efterfulgt af affarvning. For lastning kontroller blev prøver læsset på SDS-PAGE og farvet med Coomassie brilliant blue-R250 farvning.

Drug Resistance

For at teste kemosensitivitet, 3 × 10

4 NCI-H69 eller NCI-H69V-celler blev podet i 6 brønds plader i 12 timer og blev derefter behandlet med 200 pM Etoposid (Sigma-Aldrich, München) i 48 timer som beskrevet tidligere [21]. Derefter blev cellelevedygtighed testet ved anvendelse propidiumiodid (PI) (Sigma-Aldrich, München, Tyskland) og 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodid (DIOC6) (Sigma-Aldrich, München). Celler blev inkuberet i RPMI 1640 indeholdende 0,5% BSA, 10 nM DIOC 6 og 2 mg /ml PI ved 37 ° C i 20 minutter og analyseret ved flowcytometri på en FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Flowcytometri blev analyseret under anvendelse FlowJo software v.7.6.3 (Tree Stjerne Inc., San Carlos, CA, USA).

Transwell migration

Migration af SCLC celler blev vurderet ved anvendelse 24- såvel microchemotaxis plader (Costar, New York, USA), hvori 1 × 10

6 celler i 100 pi RPMI 1640 uden FCS efter udsultning for 12 timer blev anbragt i det øvre kammer og det nedre kammer indeholdt RPMI med 10% FCS . Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C i 5% CO

2 blev celler talt i overensstemmelse med producentens anvisninger. Invaderet celler i bunden af ​​indsatsen membranen blev dissocieret med trypsin og talt under anvendelse af et hæmocytometer. Migration Index blev beregnet som antallet af migrerede celler divideret med antallet af migrerede celler i den ubehandlede gruppe. Hvert eksperiment blev udført tre gange. Dataene repræsenterer middelværdien +/- SD fra tre uafhængige forsøg

Invasion analyser

For invasion assays den QCMTM 24-Well Cell Invasion analysen. (ECM 550; Chemicon International, Temecula, CA, USA) med en 8 uM porestørrelse polycarbonat membran og et lag af ECMatrix-lignende materiale blev anvendt. Assays blev udført ifølge producentens anvisninger, hvorved 6 × 10

5-celler blev udsultet i 12 timer, podes i det øvre kammer, og inkuberet i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO

2. Det nedre kammer indeholdt RPMI med 10% FCS. Efter 48 h celler i det øverste kammer blev fjernet under anvendelse af vatpinde blev invaderede celler i bunden af ​​indsatsen membranen dissocieret med trypsin og talt under anvendelse af et hæmocytometer. Eksperimenter blev udført tre gange.

Statistisk analyse

Statistisk signifikans mellem kontrol- og individuelle betingelser blev vurderet ved GraphPad Prism 5 Software vha t-test. * Betegner en P værdi fra 0,01 til 0,05, ** betegner en P værdi fra 0,01 til 0,001 og *** betegner en P-værdi mindre end 0,001. En p-værdi på 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

De vigtigste EMT markører vimentin og E-cadherin udtrykkes forskelligt

SCLC cellelinjer, såsom. NCI-H69 typisk vokse så tæt pakket flydende aggregater. Men en sammenhængende del (5-10%) af det samlede observerbare celleantal vokser adhærent. For cellelinie NCI-H69 en Tilhænger sublinie er fastslået navngivet NCI-H69V [20]. Immunfluorescensfarvning afveg betydeligt, når man sammenligner NCI-H69 og dets sublinie NCI-H69V for de centrale markører af epitel og mesenkym cellefænotyper E-cadherin og vimentin: NCI-H69 var positive for E-cadherin (fig 1a) og Zona occludens (figur 1b ) men viste ingen vimentin ekspression (figur 1c), hvorimod det vedhængende NCI-H69V var negativ for E-cadherin (fig 1d) men stærkt positive for vimentin (fig 1f). Flertal af NCI-H69V-celler var negative for Zona occludens (figur 1e); men nogle enkelte celler viste svag resterende Zona occludens udtryk (figur 1e, stjerne). Ekspression af E-cadherin og vimentin, som kendetegnende gener af EMT, skelner mellem de forskellige subpopulationer i cellen linje, viser et flertal af epitel-lignende celler og færre adhærent-voksende celler med en mesenchymale-lignende fænotype.

suspensionsceller (NCI-H69) er stærkt positive for E-cadherin (rød) (a) og Zona occludens (rød) (b), hvorimod adhærente NCI-H69V celler er negative for E-cadherin (d). Flertal af NCI-H69V-celler var negative for Zona occludens, men nogle enkelte celler viste svag Zona occludens udtryk (stjerne, e). Suspension celler (NCI-H69) er negative (c), hvorimod vedhængende NCI-H69V er positive (f) for vimentin (rød). Ki-67 blev co-farvet (grøn). Cellerne blev afbildet af Zeiss Axioplan mikroskop og AxioCam Digital og analyseret af ZeissAxioVision software. Bar repræsenterer 20 um.

Forskellige cellemorfologi inden SCLC-cellelinjer

Vi undersøgte celle morfologi delpopulationer (flydende vs. vedhængende) i SCLC-cellelinjer. Til dette formål det vedhængende subpopulation blev forøget ved selektion, indtil cellerne voksede som et helt vedhæftende monolag (figur 2b, e, g). De cellelinjer viste forskelle i spontan tilslutning: NCI-N592 knyttet oftere og hurtigere end NCI-H69 (NCI-H69: 2a, b /NCI-N592: Tal 2d, e). En klæbende delområde er blevet etableret for NCI-H69, nemlig NCI-H69V (Figur 2c) [20]. Den adhærerende cellelinje udvalgte vi os afslørede lignende morfologi (fig 2b, c). Vækstrater og en fordobling tider med NCI-H69 og NCI-H69V var sammenlignelige med 28 timer (± 6,02) for NCI-H69 og 30 h (± 7,34) for NCI-H69V (figur S1).

NCI-H69 SCLC-cellelinier vokser i flydende klynger (a) med en lille subpopulation af adhærent-voksende celler, der blev udvalgt ved at bortskaffe flydende celler over flere passager (B) ligner den etablerede sublinie NCI-H69V (c). NCI-N592 og NCI-H82 i typiske flydende klynger (d, f) og udvalgte adhærente celler (e, g). Adhærerende subpopulationer afslører en spindel form, filopodia og microtentacles. Cellerne blev afbildet af Zeiss Axioplan mikroskop og AxioCam Digital og analyseret af Zeiss LSM Image Browser. Bar repræsenterer 200 um

Der er imponerende morfologiske forskelle mellem vedhængende og flydende celler i alle undersøgte SCLC-cellelinjer:. Mens celler i flydende klynger synes lille og rund, med små kerner, vedhæftede celler er større, spredt ud, og har et stort cytoplasma-til-kerne-forhold. Især NCI-H69V celler har en spindel form med lang pseudopodia og fibre, fine, granulære chromatin og mangel på fremtrædende nucleoli. Hertil kommer, at adhærente celler vokser ikke via stramme celle-celle-kontakter, indtil de er særdeles sammenflydende.

Ekspression af EMT-beslægtede gener og DNA methylering ændringer i vimentin og E-cadherin under EMT

mRNA-ekspression af typiske EMT genprodukter blev sammenlignet mellem de forskellige SCLC-cellelinier, og den valgte adhærente underlinjer ved RT-PCR (figur 3a). Epitel markørgen E-cadherin blev højt udtrykt i flydende NCI-H69. I modsætning hertil E-cadherin ekspression var lav i vedhængende NCI-H69V. Vimentin var fraværende i de flydende NCI-H69 celler, mens det stærkt blev udtrykt i adhærent voksende NCI-H69adh og NCI-H69V (figur 3a). Der blev også påvist Disse forskelle i mRNA-ekspression i NCI-H82 og NCI-N592 underlinjer, med omliggende celler fremviser en mere mesenchymal-lignende mønster. Men konverteringen var, ikke så klar som i NCI-H69 /NCI-H69V (figur 3a).

EMT markører og transkriptionsfaktorer udtrykkes forskelligt inden for de SCLC linjer (NCI-H69, NCI-H82, og NCI-N592). NCI-H69-celler udtrykte ikke mesenchymale markører eller induktionsspoler i suspensionskulturer, tydeligt på mRNA-niveauet ved RT-PCR (a). Zeb1, Snail /Snai1, Slug /Snai2, og FSP er udtrykt i vedhængende delområde (NCI-H69V), men E-cadherin kun udtrykkes i suspension celler. Mesenchymal markører Fibronectin og vimentin opreguleres i de adhærerende underlinjer (a). MRNA-ekspression i NCI-H82 og NCI-N592 sammenlignet med dets vedhængende subkulturer generelt viste en lignende tendens mod en mesenchymal fænotype i de adhærente celler (A). Western blot-analyse viser faldt protein niveauer i epitel markører E-cadherin og Zona occludens 1, og udtryk for mesenchymale markører Vimentin og ZEB1 i NCI-H69V. EMT spoler Snail /Snai1, Slug /Snai2 udtrykkes i NCI-H69V (b). Udtrykket ændring i adhærerende NCI-N592 mod en mesenchymal-lignende fænotype er mere markant på proteinniveauet end mRNA-niveauet (b). Den neuroendokrine markører NSE og L-dopa er udtrykt i den parentale cellelinie NCI-H69, men ikke er påviselige i det vedhængende sublinie NCI-H69V (c). DNA-methylering analyse (d), EMT kendetegnende gen Vimentin demonstrerer stærk methylering i NCI-H69 og betydelig hypometylering i NCI-H69V, E-cadherin methylering er betydeligt højere i H69V. Som kontrol dyrkede lungefibroblaster isoleret fra tre patienter til vimentin methylering niveauer og fra to patienter for E-cadherin methylering niveauerne uden fibrosesygdomme tjente som normal kontrol. Baren viser middelværdien af ​​tre uafhængige målinger. Forskellene mellem middelværdien methylering niveauer af den analyserede amplikon blev testet under anvendelse af Students uparrede t-test (* p værdi fra 0,01 til 0,05, ** p værdi fra 0,01 til 0,001 og *** p-værdi mindre end 0,001).

tilsammen EMT-relaterede transskription faktorer Zeb1, Snail /Snai1, Slug /Snai2 og FSP blev udtrykt variabelt i de forskellige cellelinjer (figur 3a). Vi bemærkede de stærkeste forskelle i NCI-H69V sammenlignet med NCI-H69 og derfor fokuseret på de celler i følgende eksperimenter.

Denne konvertering fra epitel NCI-H69 celler i en mesenchymale fænotype (NCI-H69V) var demonstreret endnu mere indlysende på proteinniveauet (figur 3b): vi har registreret signifikant nedregulering af den epiteliale markører E-cadherin og Zona occludens 1 i NCI-H69V ledsaget af opregulering af EMT induktionsspoler og effektorer såsom ZEB1, snail /Snai1, Slug /Snai2 og vimentin. Selvom mRNA ekspression af NCI-N592 kun lå i en mesenchymal fænotype (figur 3a), proteinekspression klart afslørede en mesenchymal mønster (figur 3b).

Interessant, neuroendokrine markører NSE og L-dopa blev udtrykt i forældrenes cellelinie NCI-H69, men var ikke påvises i sin klæbende sublinie (figur 3c).

DNA methylering af vimentin og E-cadherin

for at vurdere, om epigenetisk regulering af DNA promotor methylering kan spille en rolle i ekspressionsniveauer, vi anvendte kvantitativ pyrosekventering til promotorregionerne af vimentin og E-cadherin (fig 3d). Mens vimentin-promotoren viste DNA-methylering niveauer af 35% i NCI-H69-celler, DNA methylering niveauer i NCI-H69V-celler var signifikant lavere med 1,3% (p 0,0001). Dette fører til aktiv gentranskription, som falder i tråd med den observerede stigning i vimentin på mRNA /proteinniveau (figur 1 og 2). Normale lungefibroblaster (n = 3) viste vimentin methylering niveauer af 1,1%. Omvendt DNA methylering niveauer af E-cadherin /CDH1 var 31% i H69-celler og forøget til 40% i NCI-H69V-celler (p = 0,0032). Normale lungefibroblaster (n = 2) udviste 17% og 8% methylering, hhv. Denne omvendte korrelation mellem udtryk og DNA methylering kan antyde, at DNA-methylering bidrager til vimentin og E-cadherin mRNA regulering og proteinekspression under EMT-processen i SCLC-cellelinjer.

Højere migration og invasive potentiale for vedhængende NCI-H69

For at undersøge, om disse dramatiske fænotypiske forskelle har funktionelle konsekvenser, vi gennemført Transwell migration og invasion assays. De adhærente NCI-H69V-celler udviste signifikant højere migration og invasion i ekstracellulære matrixproteiner i retning 10% FCS-holdigt medium end NCI-H69-celler (figur 4). NCI-H69 viste meget lidt migration potentiale og næsten ingen invasion. Overfoeringen i NCI-H69 suspension celler var 15 celler pr migration kammer (± 6 /n = 3), hvorimod NCI-H69V steg 11 gange med 196 celler pr migration kammer (± 81 /n = 3) (p = 0,0001 ). Invasionen niveau i H69 var 7 celler pr migration kammer (± 3 /n = 3), hvorimod NCI-H69V var 16 gange højere med 118 celler pr migration kammer (± 35 /n = 3) (p = 0,0001).

adhærent voksende NCI-H69 celler demonstrerer signifikant højere migration (a) og invasion (b) mod 10% FCS indeholdende medium i forhold til suspensionen cellelinien (*** p = .0001). Migration Index blev defineret som antallet af migrerede celler divideret med antallet af migrerede celler i den ubehandlede gruppe (ingen FCS) efter 48 timer. Invasion Index blev defineret som antallet af optalte celler i fem view felter divideret med antallet af migrerede celler i den ubehandlede gruppe (ingen FCS) efter 48 timer.

levende celler af ekstracellulær proteolytisk aktivitet indikerer højere proteolytisk potentiale adhærente underlinjer

cancercelleinvasion er ledsaget af nedbrydning af ekstracellulær matrix (ECM). På grund af større invasion af det klæbende underlinie analyserede vi dens potentiale for kollagen IV-nedbrydning. Efter 48 timers inkubation på matrigel indeholdende DQ-collagen IV, adhærente NCI-H69V-celler afslørede signifikant højere pericellulært nedbrydning af collagen end NCI-H69-celler som målt ved grøn fluorescens. Kvantificering af proteolytisk aktive celler viste, at 77% af NCI-H69V celler var positive, mens kun 8% af NCI-H69 suspension celler var positive (figur 5)

Direkte-celle proteolyse analyse:. Suspension NCI -H69 og adhærente NCI-H69V-celler blev inkuberet i 48 timer på matrigel indeholdende 30 ng /pl DQ-collagen IV. (A) Nedbrydning af kollagen bestemmes ved grøn fluorescens, der omgiver positive celler. Bar repræsenterer 30 um.