PLoS ONE: PTK6 Fremmer Cancer Migration og Invasion i bugspytkirtelkræftceller afhængig ERK Signaling

Abstrakt

proteintyrosinkinase 6 (PTK6) er en ikke-receptor-typen tyrosinkinasen der kan være involveret i nogle kræftformer. Men den biologiske rolle og udtryk status PTK6 i bugspytkirtelkræft er ukendt. Derfor vil der i dette studie, afprøvede vi den funktionelle rolle af PTK6 på pancreas invasion kræft. Fem bugspytkirtelkræft cellelinjer udtrykte PTK6 på forskellige niveauer. PTK6 ekspression blev også observeret i humane pancreas adenokarcinomer. PTK6 undertrykkelse af siRNA reducerede signifikant både cellulære migration og invasion (0,59 /0,49 gange for BxPC3, 0,61 /0,62 for Panc1, 0,42 /0,39 for MiaPaCa2 henholdsvis

s 0,05

for hver). I modsætning hertil tvungen overekspression af PTK6 ved transfektion af en PTK6 ekspressionsvektor Panc1 og MiaPaCa2 celler forøget cellulær migration og invasion (1,57 /1,67 gange for Panc1, 1,44 /1,57 for MiaPaCa2 henholdsvis

s 0,05

) . Silencing PTK6 reduceret ERK1 /2-aktivering, men ikke AKT eller STAT3-aktivering, mens PTK6 overekspression øget ERK1 /2-aktivering. U0126, en specifik inhibitor af ERK1 /2, helt afskaffet virkningen af ​​PTK6 overekspression på den cellulære migration og invasion. Disse resultater antyder, at PTK6 regulerer cellulær migration og invasion i bugspytkirtelkræft via ERK-signalering. PTK6 kan være en roman terapeutisk mål for kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Ono H, Basson MD, Ito H (2014) PTK6 Fremmer Cancer Migration og Invasion i bugspytkirtelkræftceller afhængig ERK Signaling. PLoS ONE 9 (5): e96060. doi: 10,1371 /journal.pone.0096060

Redaktør: Noriko Gotoh, Institut for Medicinsk Videnskab, University of Tokyo, Japan

Modtaget: November 22, 2013; Accepteret: April 2, 2014; Udgivet: 1. maj 2014

Copyright: © 2014 Ono et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af forfatternes interne afdelinger forskningsfond. Det bidragyder (Institut for Kirurgi, Michigan State University) havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser eksisterer.

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste dødsårsag kræft i USA. [1] Resultatet af patienter med kræft i bugspytkirtlen har været nedslående med en 5% 5-års-overlevelsesraten. [2] dødelighed af kræft i bugspytkirtlen er på grund af sin aggressive biologiske adfærd, herunder et stort potentiale for invasion og metastase, og modstand mod tiden tilgængelige anti-cancer. De molekylære mekanismer, der er ansvarlige for disse egenskaber er stort set ukendt, og skal forstås at forbedre behandlingsresultater af patienter med kræft i bugspytkirtlen.

Protein tyrosinkinase 6 (PTK6), eller bryst tumor relateret kinase (BRK) er en ikke-receptor-typen tyrosinkinase. Det er relateret til c-Src-kinase-familien, som besidder SH2 og SH3-domænerne. [3] PTK6 fremmer celledifferentiering i normale epitelceller og næsten ikke udtrykkes i modne epitelceller i mavetarmkanalen, bryst eller hud. [3] – [5] Selv afvigende overekspression af PTK6 er blevet identificeret i adskillige epiteliale cancere, herunder cancere i bryst, lunge, melanom, prostata, colon og ovarie, funktioner PTK6 i cancerbiologi er ikke blevet fuldstændigt karakteriseret. [3], [6] – [12].

I denne undersøgelse evaluerede vi rollen som PTK6 om kræft i bugspytkirtlen celle invasion og udforskede downstream signaler, der kan mægle en sådan virkning. Vores resultater tyder på, at PTK6 regulerer invasiv ved at aktivere ERK og hæver den mulighed, at PTK6 kan være en vigtig ny molekylære mål for at forbedre effektiviteten af ​​behandling for kræft i bugspytkirtlen.

Materialer og metoder

Materialer

Vækstmedium, føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin (P /S) blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Anti-PTK6 antistof blev opnået fra Santa Cruz Biochemistry (Santa Cruz, CA), anti-p44 /42 ERK1 /2, anti-phospho-p44 /42 ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), anti-p38 MAPK, anti-phospho -p38 MAPK (Thr180 /Tyr182), anti-STAT3, og anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antistoffer blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA), og anti-β-actin-antistof blev opnået fra Sigma-Aldrich. Den selektive ERK1 /2-inhibitor U0126 blev opnået fra Sigma-Aldrich.

humane væv

bugspytkirtelkræft væv slides blev opnået fra Patologisk Institut ved Sparrow Hospital, Lansing MI. Brugen af ​​arkiverede prøver til denne undersøgelse blev godkendt af Michigan State University (MSU) og Sparrow Hospital Institutional Review Boards (interne metoder). Vores IRB udvalg frafaldes behovet for samtykke. Ni patienter, som gennemgik bugspytkirtlen resektion for pancreas duktalt adenokarcinom fra 2002 selvom 2012 blev udvalgt og blev inkluderet i denne undersøgelse. De arkiverede formalinfikserede, paraffinindlejrede prøver blev opdelt på en roterende mikrotom på 4 um s. Enzym epitopgenfinding blev udført ved 0,03% protease E i 10 minutter ved 37 ° C. Anti-PTK6 antistof blev fortyndet i 1/100 med Normal Antibody Diluent (NAD) (Scytek – Logan, UT) og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Antigen-antistof-reaktioner blev visualiseret med avidin-biotin-peroxidase-kompleks-system (R.T.U. Vectastain Elite ABC reagens, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Glassene blev revideret og PTK6 udtryk blev gradueret efter cytoplasmatisk farvning intensitet som følger; negativ, ingen farvning eller svag intensitet farvning i mindre end 5% af celler; svag til moderat positive, svagt til moderat intensitiy; stærk positiv, stærk intensitet.

Cell Cultures

Humane bugspytkirtelkræft cellelinier af BxPC3, Capan1, Hs766T, Panc1, og MIA PaCa2 blev indhentet fra American Type Culture Collection. BxPC3 blev opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og 1% P /S i en fugtig (37 ° C, 5% CO

2) kammer. De andre cellelinier blev opretholdt i DMEM-medium indeholdende 10% FBS og 1% P /S.

Western blot-analyse

Celler blev lyseret i cellelyse-buffer (Cell Signaling Technology) med 1 mM phenylmethansulfonylfluorid (Cell Signaling Technology). Koncentrationen af ​​hvert cellelysat protein blev estimeret ved BCA-assay (Pierce Chemical). Cellelysater, der indeholder i alt 20 ug protein blev påført på 10% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Invitrogen, Grand Island, NY). Efter at være blevet blokeret med Tris pufret saltvand med 0,2% Tween-20 (TBST) indeholdende 5% BSA eller skummetmælk i 4 timer ved stuetemperatur blev membranerne inkuberet med antistof i passende fortynding ved 4 ° C. Peberrodsperoxidasekonjugeret æsel anti-kanin IgG eller fåre-anti-muse-IgG (GE Healthcare, Piscataway, NJ) blev anvendt som sekundære antistoffer og inkuberet med membranerne ved en 1/3000 fortynding i 1 time. β-actin blev anvendt som en loading kontrol markør for normalisering af hver bane.

gendæmpning af små interfererende RNA

Tab af funktion-analyse blev udført ved anvendelse siRNA’er rettet mod PTK6 (s11487, Ambion , Grand Island, NY: sense 5′-CAUCCAUGGUUAAGUCAUAtt-3 ‘, antisense 5′-UAUGACUUAACCAUGGAUGaa-3′) og negative kontrol (Lyddæmper Vælg negativ kontrol # 2 siRNA, Ambion). Et andet par af siRNA’er rettet mod PTK6 og negativ kontrol blev anvendt (PTK6 og negativ kontrol, Invitrogen, St Louis, MO: Stealth RNAi-PTK6HSS183907 sense 5’-CAGGCUGUGCGGCACUACAAGAUCU-3 ‘, antisense- 5′-AGAUCUUGUAGUGCCGCACAGCCUG-3’ og Stealth RNAi Negativ Kontrol Medium GC Duplex henholdsvis). Hver siRNA (10 nmol /l) blev transficeret i bugspytkirtelkræftceller anvendelse af Lipofectamine RNA iMAX (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Knockdown af et målgen blev bekræftet på 96 timer ved Western blotting

Overekspression af PTK6 ved stabil transfektion

Humant PTK6 cDNA (klon-ID’et: 5.746.034). Blev købt fra Open Biosystems (Pittsburg, PA ) og amplificeret ved PCR under anvendelse af primere (5′-CCCAAGCTTATGGTGTCCCGGGACCAGGC, og 3′-CGGGATCCTCAGGTCGGGTTCTCGTAGC). PCR-produktet blev indsat i ekspressionsvektoren pcDNA3.1-myc /His B (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Den etablerede PTK6 ekspressionsvektor blev udsat for DNA sekventering analyse for at bekræfte den korrekte indsættelse af fulde længder af PTK6 cDNA. PTK6 ekspressionsvektor eller tilsvarende tom vektor blev transficeret ind bugspytkirtelkræftceller anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Efter 72 timers transfektion blev cellerne inkuberet i dyrkningsmedium indeholdende passende koncentrationer af G418. Ved kultur i udvælgelsen medium med indhold G418 over 2 uger blev stabile transfektantcellerne valgt ud. Udtrykket af PTK6 protein blev efterfølgende bekræftet af western blotting.

Transwell Migration og Invasion Assay

Transwell migration og invasion blev udført i 24-godt modificerede Boyden kamre belagt med (invasion) eller uden (migration) Matrigel (Transwell-kammer, BD Biosciences, San Jose, CA,). Bugspytkirtelkræftceller (BxPC3 1 × 10

5 celler, Panc1, 5 × 10

4 celler, og MiaPaCa2, 7,5 × 10

4 celler per brønd, henholdsvis) i serum-frit medium blev podet på trans-membran i det øvre kammer med 10% FBS i det nedre kammer som en kemoattraktant. Efter en 24 timers inkubation blev celler, der var migreret gennem membranen fikseret og farvet med Diff-Quik Stain Set (Siemens, Newark, DE). De blev derefter talt under forstørrelse på 5 tilfældigt udvalgte højeffekt felter. Hver assay blev udført i tre eksemplarer

Statistisk analyse

Sammenligning af de kontinuerlige værdier blev udført ved hjælp af t-test og 2-sidet

s

-værdier. 0,05 blev anset signifikant.

Resultater

PTK6 Expression status i kræft i bugspytkirtlen

Vi sammenlignede PTK6 niveauer i fem etablerede humane bugspytkirtelkræft cellelinier (BXPC3, Capan1, Hs766T, MiaPaCa2, og Panc1 ) og pancreas cancer væv taget direkte fra 9 patienter, som gennemgik kirurgisk resektion. Western blot viste, at de 5 pancreas cellelinjer udtrykte PTK6 på forskellige niveauer; BXPC3 og Capan1 udtrykte PTK6 robust, mens MiaPaCa2 udtrykte en meget lavere niveau af PTK6 (figur 1A). Immunfarvning for PTK6 i bugspytkirtelkræft væv fra 9 patienter viste, at PTK6 var stærkt udtrykt i 4 patienter (44%), mildt til moderat udtrykt i 2 patienter (22%), og ikke til udtryk på alle i 3 patienter (33%). I det tilstødende normale pancreas kanalen epitel, immunreaktivt PTK6 var ikke påvises i nogen af ​​prøverne, vi undersøgte (Figur 1B).

En

, Endogen udtryk for PTK6 i humane pancreas cancer cellelinjer. PTK6 ekspression blev bekræftet i 5 bugspytkirtelkræft cellelinjer, BXPC3, Capan1, Hs766T, MiaPaCa2, og Panc1 på forskellige niveauer ved Western-blotting.

B

, immunhistokemisk staning for PTK6 i tilstødende normal bugspytkirtel og kræft i bugspytkirtlen væv. Mens der ikke var nogen påviselig PTK udtryk i tilstødende normal pancreas ductal epitel (øverst til venstre), blev PTK6 udtryk på forskellige niveauer (fra negativ gennem stærkt positiv) i pancreascancer.

PTK6 Expression Påvirker Cell Migration og invasion af bugspytkirtelkræft cellelinier

Flere undersøgelser har antydet, at PTK6 påvirker cellulære maskineri medierende migration og invasion. [13] – [15] Vi hypotese derfor, at PTK6 er en vigtig regulator af bugspytkirtlen migration kræft og invasion og vi evaluerede effekten af ​​nedsat PTK6 udtryk på disse celle adfærd. Efter PTK6 ekspression blev undertrykt af gendæmpning hjælp siRNA (fra Ambion) i 3 bugspytkirtelkræft cellelinier (figur 2A), blev den vandrende potentiale bugspytkirtelkræftceller analyseret ved hjælp af en Boyden kammer. Som vist i figur 2B, gendæmpning af PTK6 væsentligt reduceret migration i alle 3 bugspytkirtelkræft cellelinjer (0,59 gange fald i BXPC3, 0,61 i Panc1, 0,42 i MiaPaCa2 henholdsvis

s

0,05 for hver) . Cellular invasiv potentiale blev på lignende analyseret under anvendelse Matrigelcoatede Boyden kamre, og invasion var signifikant reduceret med gendæmpning af PTK6 i alle 3 pancreas cancercellelinjer, som vist i figur 2C (0,49-gange fald i BXPC3, 0,62 i Panc1, 0,39 i MiaPaCa2 henholdsvis

s

0,05 for hver). Disse hæmmende virkninger af PTK6 gendæmpning på celle migration og invasion blev bekræftet af de tilsvarende forsøg ved hjælp af andre siRNA rettet mod forskellige sekvens af PTK6 (fra Invitrogen) (Figur S2).

En

, PTK6 gene silencing. Celler blev transficeret med PTK6-specifikke siRNA (siRNA-PTK6) eller negativ kontrol-siRNA (siRNA-NC) i 96 timer. Knockdown af PTK6 ekspression blev comfirmed ved Western-blotting. Tallene i bunden indikerer den relative intensitet af de bånd til PTK6 til tilsvarende kontroller (normaliseret ved β-actin).

B

,

C

, Effekten af ​​PTK6 gendæmpning på celle motilitet (B) og invasion (C). Celler blev behandlet med PTK6-specifikke siRNA eller negativ kontrol-siRNA i 48 timer, derefter udsat for migration eller invasion assay under anvendelse Boyden kamre uden eller med Matrigel. Gene silencing af PTK6 reducerede cellulære migration i alle 3 bugspytkirtelkræft cellelinjer (0,59 gange fald i BXPC3, 0,61 i Panc1, 0,42 i MiaPaCa2 henholdsvis *

s

0,05 af t-test). Ligeledes gen silencing af PTK6 reducerede cellulære invasion i alle 3 bugspytkirtelkræft cellelinier (0,49 gange fald i BXPC3, 0,62 gange i Panc1, 0,39 gange i MiaPaCa2 henholdsvis *

s

0,05 ved t-test). Hver assay blev udført tre gange.

Omvendt vi næste evalueret effekten af ​​PTK6 overekspression om migration og invasion. En ekspressionsvektor, der koder fuld længde PTK6 cDNA blev transficeret ind Panc1 og MiaPaCa2 celler og stabile transfektanter overudtrykker PTK6 blev fastsat for hver cellelinje (figur 3A). I modsætning til virkningen af ​​PTK6 gendæmpning, PTK6 overekspression forøget cellulær migration og invasion sammenlignet med kontroller. (1,6 /1,7-gange stigning i Panc1, og 1,4 /1,6 i MiaPaCa2, for vandrende og invasive potentiale, henholdsvis

s

0,05) (Figur 3B, 3C) Disse resultater tyder på, at PTK6 udtryk i bugspytkirtlen kræft er forbundet med dets cellulære vandrende og invasive potentiale.

En

, Overekspression af PTK6. Celler blev transficeret med pcDNA3.1-Mock (tom vektor) eller pcDNA3.1-PTK6. Overekspression af PTK6 i stabil trasfectant blev bekræftet ved Western blotting i Panc1 og MiaPaCa2 celler. Tallene i bunden indikerer den relative intensitet af båndet for PTK6 til de tilsvarende kontroller (normaliseret ved β-actin).

B

,

C

, Effekten af ​​PTK6 overekspression på cellulær migration (B) og invasion (C). Etablerede transfektantcellerne blev evalueret med migration og invasion-assays. Tvungen overekspression af PTK6 forøget cellulær migration i Panc1 og MiaPaCa2 bugspytkirtelkræftceller (1,6-dobling for Panc1, og 1,4 gange for MiaPaCa2 henholdsvis *

s

0,05 af t-test). Tilsvarende tvungen overekspression af PTK6 øget cellulær invasion i disse 2 cellelinier (1,7-dobling for Panc1, og 1,6 gange for MiaPaCa2 henholdsvis *

s

0,05 af t-test). Hver assay blev udført tre gange.

MAPK /ERK Signaling er en kritisk Mediator i PTK6-relaterede Cell motilitet

For at belyse den mekanisme, hvor PTK6 regulerer cellulær migration og invasion, vi udforskes signalveje nedstrøms til PTK6. Adskillige signalmolekyler er tidligere blevet rapporteret at være nedstrøms for PTK6, herunder STAT3 [16], Akt [17], [18], Erk5 [15], [19], p38 MAPK [19], og ERK1 /2 [20] (revideret i Ostrander 2010). Da PTK6 ekspression manipuleret ved hjælp siRNA, phosphorylering af STAT3, Akt, og p38 MAPK blev ikke ændret konsekvent blandt 3 cellelinier vi testede (Figur S1). Aktivering af ERK5 var ikke påviselig i vores undersøgelser (data ikke vist) Derimod aktiveret (phospholylated) ERK1 /2 var signifikant reduceret i alle PTK6-gen-lyddæmpet bugspytkirtelkræftceller forhold til deres tilsvarende kontrol celler, mens tvungen overekspression af PTK6 induceret aktivering af ERK1 /2 i både Panc1 og MiaPaCa2 celler (Figur 4A.B). ERK1 /2 derfor opstået som kandidat til mediator af PTK6-regulerede cellulære motilitet i bugspytkirtelkræft og vi søgte derfor at afgøre, om virkningerne af PTK6 på cellulær migration og invasion afhænger af ERK1 /2-aktivitet. Vi bruges den selektive inhibitor af ERK1 /2, U0126 at inhibere ERK1 /2-aktivitet. Som vist i figur 5A, PTK6-induceret ERK /1/2-aktivering blev fuldstændig blokeret af U0126 ved 10 uM. Når vi analyseret den cellulære migration og invasion af Panc1 og MiaPaCa 2-celler i nærvær af U0126, U0126 reduceret basal cellulær migration og invasion og afskaffede evne PTK6 overekspression at stimulere dem (figur 5B). Dette antyder, at PTK6 regulerer cellulær migration og invasion gennem ERK1 /2.

En

, Effekt af PTK6 gendæmpning på total ERK1 /2 og aktiveret (phosphoryleret) ERK1 /2. Gene silencing af PTK6 reducerede niveauet af phosphoryleret ERK1 /2 i alle 3 bugspytkirtelkræft cellelinjer. Tallene i bunden indikerer den relative båndintensitet for pErk1 /2 til tilsvarende kontroller (normaliseret ved total ERK1 /2).

B

, Effekt af PTK6 overekspression på total ERK1 /2 og aktiveret ERK1 /2. Tvungen PTK6 overekspression induceret aktivering af ERK1 /2 i både Panc1 og MiaPaCa2 celler. Tallene i bunden indikerer den relative band intensitet for pErk1 /2 til tilsvarende kontroller (normaliseret ved total ERK1 /2).

En

, Cellerne blev behandlet med det specifikke ERK1 /2-inhibitor, U0126 ved 10 uM i 24 timer. ERK1 /2 phosphorylering blev inhiberet og PTK6-induceret aktivering af ERK1 /2 ikke længere blev detekteret i Panc1 eller MiaPaCa2 celler.

B

, Effekten af ​​ERK1 /2 hæmning på cellulær migration (

venstre

) og invasion (

højre

) ERK1 /2-hæmning ikke kun reduceret basal migration og invasion i Panc1 og MiaPaCa2 celler, men afskaffet effekten af ​​PTK6-overekspression om migration og invasion. *

s

0,05 vs tilsvarende kontrol med DMSO køretøj (af

t

-test). **

s

0,05 vs PTK6-overudtrykte celler med DMSO køretøj (af

t

-test). Hver assay blev udført tre gange.

Diskussion

Selv om der er en akkumulerende bevis på, at PTK6 afvigende udtrykkes i forskellige epiteliale kræftformer, konsekvenserne af PTK6 udtryk og dens rolle i den biologiske opførsel af kræft er kontroversielle og dårligt defineret. Faktisk er den rolle og funktion PTK6 troede stærkt afhængig af den sammenhæng, hvori PTK6 udtrykkes. For eksempel har PTK6 blevet omfattende undersøgt i brystcancere for dens

pro Salg -oncogenic roller herunder cellecyklusprogression [21], angiogenese [22], anoikis resistens [23] og den cellulære migration [13], mens PTK6 har vist sig at fungere

anti

-oncogenically i esophageal cancer [24]. Til vores viden, dette er den første undersøgelse undersøger udtryk og funktion PTK6 i bugspytkirtelkræftceller.

Vores vigtigste fund i denne undersøgelse er, at PTK6 overekspression stiger cellulære migration og invasion, og at PTK6 gendæmpning, i derimod falder dem i bugspytkirtelkræftceller. Virkningerne af PTK6 på cellulær migration kan variere blandt typer af cacners. I undersøgelserne af brystcancerceller, er PTK6 blevet rapporteret at forbedre EGF-induceret cellulære migration [13] – [15], [19], mens overekspression af PTK6 blev rapporteret at øge cellulær invasive potentiale ved at inducere epitel- mesenkymale oversættelse (EMT) i prostatacancerceller [25]. I modsætning hertil Ma et al rapporterede, at PTK6 formindsker vandringen af ​​esophageal cancer celler [24]. Disse tilsyneladende modsatrettede rapporter om den indflydelse af PTK6 om kræft biologi understreger vigtigheden af ​​studier, der undersøger effekten af ​​de enkelte signaler i de enkelte typer af kræft. Det forekommer sandsynligt, at virkningerne af PTK6, ligesom mange andre signaler, afhænge af den generelle kinome hvori PTK6 udtrykkes. Forstå kinomic forskelle mellem kræft, hvor PTK6 fremmer migration og dem, hvor det hæmmer migration kan være et frugtbart emne for fremtidig undersøgelse. Adskillige downstream effektormolekyler forbundet med PTK6 er tidligere blevet identificeret i andre kræftformer. Disse omfatter p190RhoGAP, Rho, RAS [14], Rac1, paxillin [13], p38MAPK, og ERK5 [15], [19] i brystkræft, og AKT, GSK3p, og βCatenin [24] i kræft i spiserøret. I den aktuelle undersøgelse af multiple pancreascancer cellelinier, at de fleste af de molekyler, der har tidligere rapporteret at være forbundet med PTK6 signalering i andre cancere ændrede sig ikke i aktivitet ved manipulation af PTK6 ekspression. Det er derfor mindre sandsynligt, at disse molekyler spiller en rolle i mediering af virkningen af ​​PTK6 på den cellulære migration /invasion i bugspytkirtelkræft. I stedet ERK1 /2 opstået som et vigtigt nedstrøms mediator af PTK6-associeret signal, som regulerer pancreascancer invasion. ERK1 /2 er et medlem af mitogen-aktiveret proteinkinase (MAPK) familie og er kendt for at påvirke den cellulære migration og invasion i forskellige cancerformer, herunder pancreascancer [26], [27]. De mekanismer, som PTK6 overekspression fremkalder ERK1 /2-aktivering har endnu ikke fastlagt, og det er uvist, om PTK6 direkte interagerer med ERK1 /2. Castro og Lange rapporterede, at PTK6 /ERK5 kompleks i brystcancerceller er kritisk for vækst faktor induceret cellemigration, mens PTK6 stadig øger den cellulære migration af ERK1 /2-aktivering i keratinocytter, når ERK5 væltes [15]. De spekuleret på, at ERK1 /2 kunne tjene som en alternativ vej til PTK6 /ERK5 signaler i nogle typer af celler, som mangler ERK5. Denne model ville være i overensstemmelse med vores observationer, da vi ikke var i stand til at opdage ERK5 aktivitet i bugspytkirtelkræftceller uanset PTK6 udtryk status. Xiang et al demonstrerede dog, at PTK6 binder direkte til Erb B2 og aktiverer ERK1 /2 i brystcancerceller. Erb B2 er godt kendt for at være overudtrykt almindeligt i pancreascancer [28], [29], så dette kan være en mulig mekanisme, som tvang PTK6 overekspression i bugspytkirtelkræftceller kunne aktiverer ERK1 /2 uden ERK5 aktivitet.

det var interessant at bemærke, at mens PTK6 ekspression var ensartet upåviselig i tilstødende histologisk normale pankreatiske duktale epitelceller, PTK6 niveauer varierede betydeligt blandt de pancreascancer vi undersøgt. Abberant overekspression af PTK6 er blevet beskrevet i andre typer af cancere, og det er tidligere blevet foreslået, at PTK6 kan være en nyttig biomarkør til at forudsige resultaterne af patienter med forskellige cancere, herunder bryst-, hoved og hals, ovarie- og lungecancer [6], [12 ], [30] – [33]. Den potentielle prognostiske værdi af variation i PTK6 i bugspytkirtelkræft afventer yderligere undersøgelse.

Sammenfattende vi demonstreret, at PTK6 udtrykkes afvigende i kræft i bugspytkirtlen. Desuden er vores resultater antyder, at PTK6 kan fremme cellulære migration og invasion i bugspytkirtelkræft ved at aktivere ERK1 /2. Yderligere undersøgelse af PTK6-afhængige signalvej, der driver invasion i bugspytkirtelkræft kan fremhæve den potentielle prognostiske og terapeutiske betydning af denne roman signal i bugspytkirtelkræft.

Støtte oplysninger

figur S1.

Virkning af PTK6 gendæmpning på aktiviteten af ​​forskellige molekyler i signalveje; p38, STAT3, og AKT blev testet som de tidligere blev rapporteret at være forbundet med PTK6. Aktiviteten af ​​disse molekyler blev ikke konsekvent påvirket af gendæmpning af PTK6 i 3 bugspytkirtelkræft cellelinjer, BXPC3, Panc1 og MiaPaCa2

doi:. 10,1371 /journal.pone.0096060.s001

(TIF)

Figur S2.

En

, Virkningerne af PTK6 gendæmpning på total ERK1 /2 og phosphoryleret ERK1 /2 ved hjælp af siRNA. Af note, siRNA anvendt i dette forsøg har forskellig sekvens målretter PTK6 fra siRNA anvendt i eksperimentet i Figuer 2 og 4. Det phosphorylerede ERK1 /2 blev reduceret med PTK6 gendæmpning i både Panc1 og MiaPaCa2 celler. Tallene i bunden indikerer den relative båndintensitet for PTK6 og pErk1 /2 til tilsvarende kontroller, henholdsvis (normaliseret ved β-actin for PTK6 og total ERK1 /2 for pErk1 /2).

B

, Effekten af ​​PTK6 gendæmpning på celle migration (til venstre) og invasion (til højre). Gene silencing af PTK6 reducerede cellulære migration i Panc1 og MiaPaCa2 celler (0,65 gange fald i Panc1, 0,72 i MiaPaCa2 henholdsvis *

s

0,05 af t-test). Desuden gen silencing af PTK6 reducerede cellulære invasion i Panc1 og MiaPaCa2 celler (0,48 gange fald i Panc1, 0,78 gange i MiaPaCa2 henholdsvis *

s

0,05 af t-test). Hver assay blev udført i tre eksemplarer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0096060.s002

(TIF)

Tak

Vi takker William S. Spielman, Amy S. Porter, og Kathy A. Joseph til teknisk bistand.

Præsenteret delvis som en plakat på det årlige møde i Society for Kirurgi af fordøjelseskanalen, 18 maj

th-21

th, 2013, Orlando, FL.