PLoS ONE: Ændringer i Overflod af Oral mikrobiota forbundet med oral Cancer

Abstrakt

Individuelle bakterier og skift i sammensætningen af ​​microbiome har været forbundet med menneskelige sygdomme, herunder kræft. For at undersøge ændringer i microbiome forbundet med oral cancer, vi profileret cancere og anatomisk matchede kontralateral normalt væv fra den samme patient ved sekventering 16S rDNA hypervariable region ampliconer. I prøver kræft fra både en opdagelse og en efterfølgende bekræftelse kohorte, overflod af

Firmicutes

(især

Streptococcus

) og

aktinobakterier

(især

Rothia

) blev signifikant reduceret i forhold til kontralaterale normale prøver fra den samme patient. Væsentlige fald i overflod af disse phyla blev observeret for pre-kræft, men ikke når man sammenligner prøver fra kontralaterale steder (tunge og gulv i munden) fra raske personer. Vægtet UniFrac principal koordinerer analyse baseret på 12 taxa adskilt fleste kræftformer fra andre prøver med størst adskillelse af node positive tilfælde. Disse undersøgelser begynder at udvikle en ramme for at udnytte den mundtlige microbiome til overvågning oral cancer udvikling, progression og tilbagefald

Henvisning:. Schmidt BL, Kuczynski J, Bhattacharya A, Huey B, Corby PM, Queiroz ELS, et al . Muy-Teck Teh (2014) Ændrer i Overflod af Oral mikrobiota associeret med Oral Cancer. PLoS ONE 9 (6): e98741. doi: 10,1371 /journal.pone.0098741

Modtaget: August 21, 2013; Accepteret: 7 maj 2014; Udgivet: Juni 2, 2014

Copyright: © 2014 Schmidt et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af en tildeling af en GS Junior 454 Sequencing løbe fra Roche, National center for Research Resources, National center for Fremme Translationelle Sciences, og kontoret for direktøren, National Institutes of Health, gennem University of San Francisco ( UCSF) – CTSI tilskud nummer UL1 RR024129, og individuelle investigator priser fra National Cancer Institute tilskud (R01 CA131286, R21 CA 941.186.215) og National Institute of Dental og kraniofaciale Research (R01 DE019796). Dens indhold er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter NIH. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Modtagelsen af ​​en pris for sekventering fra Roche, en kommerciel bidragyder, ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Dr. Justin Kuczynski er ansat i Second genom, Inc. Hans ansættelse ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Årligt, ~ 22.000 amerikanere er diagnosticeret med kræft i mundhulen, hvoraf 90% er pladecellekræft (SCC). De fem-års overlevelse på 40% er ikke blevet bedre i de sidste 40 år, og det er en af ​​de laveste af de store kræft sites, hvilket resulterer i flere mennesker dør af kræft i mundhulen end melanom, livmoderhalskræft eller æggestokkræft i USA. Verdensplan er der 350.000-400.000 nye tilfælde diagnosticeres hvert år. I modsætning til de fleste andre anatomiske steder, der er faldet i kræfttilfælde, er forekomsten af ​​oral cancer stigende, især blandt unge og kvinder [1], [2]. Den største risikofaktorer, tobak og alkohol brug, kan ikke forklare ændringerne i forekomsten, fordi oral cancer også almindeligt opstår hos patienter uden en historie af tobak eller alkohol eksponering [3]. For nylig har humant papillomvirus (HPV) blevet identificeret som en ætiologisk agent for svælg kræft, men HPV-infektion er ikke en væsentlig bidragyder til kræft i mundhulen, som virussen findes sjældent i disse kræftformer (2-4% af tilfældene) [4] . Således bidrag fra andre, eventuelt miljømæssige faktorer mangler at blive fundet.

En rolle for bakteriel infektion i forårsager eller fremme kræft er velkendt med hensyn til foreningen af ​​

Helicobacter pylori

med mavekræft [5], og andre kræftformer, herunder galdeblære, colon, lunge og prostata, er blevet forbundet med bestemte bakterielle infektioner [6], [7], [8]. Det er rimeligt at spørge, derfor hvis ændringer i sammensætningen af ​​den normale mundhulen microbiome, består af mere end 600 forskellige bakteriearter [9] og /eller kronisk bakteriel infektion kunne være promotorer eller årsagerne til oral cancer. Faktisk er ændringer i det mikrobielle miljø ofte forbundet med tandsygdomme, såsom periodontal sygdom, der er mest sandsynligt en polymikrobielle sygdom kendetegnet ved udvækst af visse patologiske organismer [10], og kronisk parodontitis er blevet rapporteret at være en risikofaktor for oral præmaligne læsioner og kræft [11]. Forhøjede niveauer og ændringer i sammensætningen af ​​bakteriel og svampe mikrobiota af mundhulen er blevet rapporteret i forbindelse med orale præ-kræft og kræft [12]. Der er dog ikke enighed blandt rapporter om kræft-associerede ændringer i den mundtlige microbiome. Denne forvirring kan være opstået, fordi tidlige undersøgelser var begrænset til en analyse af de relativt små antal kendte og dyrkbare orale bakteriearter [13], [14], og senere undersøgelser ved hjælp af molekylærbiologiske metoder med fokus på særlige phyla [15] eller klonet og sekventeret lille antal kloner per prøve [16], [17].

kultur uafhængige metoder, især dem, der anvender næste generation sekventering af den hypervariable region 16S ribosomale subunit, et middel til mere omfattende og præcist profilere microbiome i sundhed og sygdom [18]. Sådanne undersøgelser på den mundtlige microbiome [16], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28] afslører på den ene side, at den sunde orale microbiome er kendetegnet ved et relativt lille antal af bakteriel phyla (9-13), den mest almindeligt rapporterede rigelige phyla være

Firmicutes

,

Proteobacteria

,

Bacteroidetes

,

aktinobakterier

, og

Fusobacteria

[16], [19], [20], [21], [22], [23], [24 ], [25], [26], [27], [28]. På den anden side har de fleste af inter-individuel variation blevet tilskrevet mangfoldighed på de arter eller stamme [24].

Streptococcus

oftest observeret at være de dominerende slægt i den sunde orale microbiome, og mindre hyppigt

Prevotella

,

Veillonella

,

Neisseria

, og

Haemophilus

dominere en persons mundtlig microbiome [19], [24]. Variation er også observeret i det mikrobielle samfund sammensætning af biofilm ved hver intraoral habitat (

f.eks

., Tandoverfladen, lateral og dorsale tunge, etc.), sandsynligvis afspejler de forskellige overfladeegenskaber og mikromiljøer [21], [24].

for at kunne undersøge mulige ændringer i sammensætningen af ​​den orale microbiome i oral cancer, er det derfor nødvendigt at kontrollere for forskelle mellem orale underordnede websteder og inter-individuel variation. De høje tilbagefald satser og forekomsten af ​​anden primær oral cancer støtter forslaget om, at disse kræftformer udvikler ud af et felt af genetisk ændrede celler, begrebet “feltet cancerization” [29]. Sådanne felter er blevet rapporteret at forlænge så meget som 7 cm fra en tumor og til at blive vist klinisk normale [30]. Af disse grunde undersøgte vi oral cancer associeret microbiome af ikke-invasivt prøveudtagning kræft læsion og en anatomisk tilpasset kontralaterale region i normalt væv fra hvert individ. Vi udsatte DNA isoleret fra disse prøver til 16S ribosomal underenhed amplifikation og sekventering. Formålet med disse undersøgelser var at begynde at lægge et fundament, der ville tillade udnyttelse af den mundtlige microbiome til behandling og overvågning af oral cancer initiering, progression og tilbagefald.

Resultater

For at undersøge ændringer i den mundtlige microbiome forbundet med oral cancer, vi fremadrettet indsamlet kræft og anatomisk matchede patient klinisk normale prøver fra fem patienter (tabel 1, Undersøgelse 1 Discovery Kohorte, tabel S1). For at bekræfte og udvide vores indledende observationer, udført vi en anden undersøgelse (Studie 2, tabel S2 – S6, samlede antal prøver = 83), hvor vi fremadrettet indsamlede et uafhængigt sæt læsionale og anatomisk matchede klinisk normale prøver fra oral cancer (tabel 2, Studie 2 Bekræftelse Kohorte, tabel S2), karcinom

in situ

(CIS, tabel S3) og præ-cancer patienter (tabel S4), såvel som fra venstre og højre side af den laterale tungen og gulv i munden af ​​sunde normale individer (tabel S5). I studie 2, vi også medtaget en uafhængig analyse af de første fem kræftpatienter fra Studie 1 og seks par, der udtages (tre kræft og tre pre-cancer patienter, tabel S6). Sidstnævnte blev medtaget for at vurdere reproducerbarheden af ​​prøvetagning og behandling og indgik ikke i nogen af ​​analyserne (se yderligere diskussion i Methods).

Studie 1. Discovery kohorte

Vi pensles den mundtlige kræft læsion og en tilsvarende anatomisk matchet klinisk normale væv område fra Discovery kohorte af fem patienter (tabel 1). Brug af Roche GS Junior instrument til at udføre pyrosekventering, vi opnåede, i en enkelt kørsel, i alt 104,380 sekvenser fra amplikoner der spændte over V4 hypervariable region af bakterielle 16S lille ribosomale underenhed (tabel S7). Antallet af rå sekvens læser varieres ved 10-fold i banen prøver, der spænder fra 1.231 til maksimalt 17.682 rå læser. Kvalitet filtrerede sekvenser blev søgt mod Greengenes henvisning database over 16S sekvenser, grupperet på 97%, og operationelle Taxonomiske enheder (Otus) blev tildelt taksonomisk klassifikation hjælp mothur s Bayesian klassificeringen. Af de 92,987 sekvenser, bestået kvalitet filtrering, 81.308 lignede kendte bakterier og de fleste kunne klassificeres til slægten niveau (65.037) med færre klassificeret på artsniveau (17.115). Sekvens dækning var variabel tværs prøver; antallet af læser per prøve tildelt Otus (undtagen filtreret på grund af dårlig kvalitet eller mangel på et relateret sekvens i Greengenes henvisning databasen) varierede fra 1038 til et maksimum på 14.359, og omfattede 76-85% af rå sekvenser (tabel S7 ). blev identificeret i alt 276 Otus (per prøve interval, 37-161, (tabel S8). fortyndingscyklussen analyse udført i familien viste en temmelig bred vifte af α mangfoldighed med antallet af fundne familier spænder fra ~15-28 (figur .. S1a) Tre patientprøver, normal og cancer fra patient 117 og den normale prøve fra patient 142, plateau på færre familier end de andre prøver, hvilket indikerer noget reduceret mangfoldighed i disse prøver Alle prøver plateaued til en vis grad, men ikke helt, yderligere sekventering ville sandsynligvis afsløre yderligere familier. på den anden side, pyrosekventering støj og PCR fejl kunne fejlagtigt øge otu tal [31]. En lignende virkning blev set på slægten niveau (figur S1b).

mangfoldighed microbiomes forbundet med anatomisk matchede kræft i mundhulen og normale prøver

Otus af kræft og klinisk normale prøver i Discovery kohorten blev klassificeret i 12 phyla (tabel S7). flertallet tilhørte en af ​​fem phyla (99,2%, normal , 98,0% kræft) med mere rigelige phyla være

Firmicutes

,

Bacteroidetes

,

Proteobacteria

,

Fusobacteria

, og

aktinobakterier

(tabel 7, figur 1). Selvom fordelingen i kræft og klinisk normale prøver af disse fem fælles phyla varierede blandt de individer (figur 1), hos alle patienter, vi observeret en signifikant reduktion i den overflod af

Firmicutes

aktinobakterier

i kræft sammenlignet med den anatomisk matchede kontralaterale klinisk normale patientprøve, (p = 0,004, FDR justeret p = 0,02 og p = 0,028, FDR justeret p = 0,07, henholdsvis). Vi bemærkede også, at andelen af ​​

Fusobacteria

blev øget i alle patienter, men ændringen i overflod nåede ikke statistisk signifikans (p = 0,074, figur 2). Vi bemærker dog, at for at observere konsekvente ændringer i overflod af de tre phyla i denne lille kohorte er stærkt signifikant. Ignorerer samspil mellem de relative mængder af forskellige phyla, en binomialtest udbytter p = 0,0022 som sandsynligheden (under nulhypotesen) for at have tre eller flere phyla hvor (alle fem patienter deler en stigning) eller (alle fem deler et fald).

den relative fordeling af phyla (procent af sekvenser) er vist for hver patientprøve med klinisk normale prøver vist sammen på top og kræft prøver på bunden

(a – e. ) relative forekomst af hver af de fem mere rigelige phyla i cancere sammenlignet med klinisk normale prøver fra hver af fem patienter. Bemærk, at data er vist på forskellige skalaer, hvilket afspejler den overflod af phyla. Størrelserne af ændringer i overflod er klart større end den statistiske optælling støj, som angivet ved fejllinje skøn, som er baseret på kvadratroden af ​​det faktiske antal læser. (F) Ændring i relativ forekomst vist som forskellen i overflod af phyla forbundet med kræft i forhold til anatomisk matchede kontralaterale klinisk normale prøver. I kræft, falder i den relative overflod af

Firmicutes

aktinobakterier

blev set hos alle patienter, mens den relative forekomst af

Fusobacteria

blev forhøjet i kræft fra alle patienter.

Studie 2. bekræftelse kohorte

for at bekræfte disse første observationer, vi udførte Studie 2. Som før, vi pensles både læsionen (kræft eller præ-kræft) og en kontralateral anatomisk klinisk normale matchet site. Vi pensles de venstre og højre side af den laterale tungen og mundbunden af ​​de sunde individer. Brug af Illumina MiSeq instrument, vi sekventeret ampliconer, der spænder over 16S rDNA V4 hypervariable region. Vi opnåede 4.486.196 rå sekvens læser med en række 31.109 til 125.847 læser pr prøve efter udelukke to prøver, der mislykkedes i sekventering (tabel S9 – S13). Vi tildelt taksonomiske klassifikation til Otus som før. Af de sekvenser, der passerede kvalitet filtrering, 4.444.432 lignede kendte bakterier og de fleste kunne klassificeres til slægten niveau (4.148.785) med færre klassificeret på artsniveau (1.650.037). Vi identificerede i alt 2107 Otus (per prøve interval, 90-482, Borde S9 – S13). Fortyndingscyklussen analyse viste en temmelig bred vifte af α mangfoldighed med næsten alle prøver plateau i nogen grad (figur S2). Som diskuteret ovenfor kan sekventering støj og PCR-fejl øges otu numre [32].

mangfoldighed microbiomes forbundet med anatomisk matchede prøver fra oral cancer, præ-cancer og raske normale individer i studie 2

Vi bestemmes først, at data indsamles på ni af de 10 Discovery Kohorte prøver, der lykkedes profileret i Studie 2 (tabel S9) var stærkt korreleret med de oprindelige data er opnået ved 454 pyrosekventering (Figur S3). Vi overvejede derefter Bekræftelse Kohorte bestod kun af prøver fra kræftpatienter ikke er omfattet af Discovery Kohorte,

dvs.

. Vi udelukkede de ni Discovery kohorte prøver (Tabel 2, Tabel S9). Vi igen fundet, at størstedelen af ​​Otus (61-100%) tilhørte en af ​​de fem mere rigelige phyla (

Firmicutes

,

Bacteroidetes

,

Proteobacteria

,

Fusobacteria

, og

aktinobakterier

) (figur 3a, tabel S14). Vi spurgte, om der var betydelige reduktioner i den overflod af

Firmicutes

aktinobakterier

i kræft sammenlignet med den anatomisk matchede kontralaterale klinisk normale patientprøve. Således som vi havde observeret i Discovery kohorten (forsøg 1), var der en signifikant reduktion i overflod af disse to phyla i cancere sammenlignet med de anatomisk matchede kontralaterale klinisk normale patientprøver (p = 0,042 og p = 0,004, henholdsvis), bekræfter vores indledende observationer (figur 3b, figur S4).

(a) Vist er den relative fordeling af phyla (procent af sekvenser). For kræft, vi inkluderede kun patienter, for hvilke både kræft og kontralaterale klinisk normale prøver var til rådighed. (B) Ændringer i relativ overflod af phyla vist som forskellen i overflod af phyla forbundet med kræft eller præ-kræft sammenlignet med anatomisk matchede kontralaterale klinisk normale prøver. For sunde normale prøver, sammenlignede vi venstre og højre side af den laterale tungen eller gulvet i munden.

I studie 2, vi også observeret, at størstedelen af ​​Otus i prøver fra patienter pre-cancer og sundt normals (figur 3a) tilhørte en af ​​de fem phyla

Firmicutes

,

Bacteroidetes

,

Proteobacteria

,

Fusobacteria

, og

aktinobakterier

(pre-kræft = 99-100%, sund normal = 87-100%). Vi spurgte igen, om betydelige reduktioner i overflod af

Firmicutes

aktinobakterier

kan også være til stede, når man sammenligner pre-kræft og anatomisk matchede kontralateral klinisk normale patientprøver. Vi fandt, at overflod af

Firmicutes

aktinobakterier

blev reduceret (p = 0,048 og p = 0,037, henholdsvis), hvilket tyder på, at ændringer i overflod af disse to phyla kan forekomme tidligt (figur 3b ). Derimod fandt vi ikke signifikante forskelle i overflod af disse to phyla eller nogen af ​​de fem mere rigelige phyla når man sammenligner de venstre og højre side af den laterale tungen og gulv i munden af ​​sunde normale individer (figur 3b).

for at undersøge ændringer i overflod på slægten niveauet for de fem mere rigelige phyla, vi overvejet patient matchede prøver fra Bekræftelse Kohorte og omfattede også fire af de fem Discovery Kohorte sager, der blev analyseret med succes i Studie 2 (14 kræftformer fra 13 patienter, tabel S9). Vi normaliseret antallet af Otus til en million tæller, (tabel S15) og for hver række og bestemte vi ændringer i overflod af slægterne, der repræsenterede 10% af Otus i mere end 20% af prøverne (figur S5 og S6). blev observeret signifikant reduktion i overflod for

Streptococcus Hotel (p = 0,003) og

Rothia

(p = 0,021) i kræft i forhold til anatomisk matchede klinisk normale prøver (tabel S16). Derimod observerede vi øget overflod af

Fusobacterium

(p = 0,044) i forhold til matchede klinisk normale prøver fra kræftpatienter. I præ-kræft, observerede vi væsentligt reduceret overflod af

Streptococcus Hotel (p = 0,042) (tabel S16). Vi fandt ingen signifikante forskelle i overflod af disse mere almindelige slægter, når man sammenligner overflod i prøver taget fra venstre og højre side af den laterale tungen og gulvet i munden på raske individer (tabel S16).

Vi bemærkede også, at selvom vi fandt ingen konsistente ændringer i overflod af

Bacteroidetes

når man sammenligner inden for individer (figur 3b), prøver fra cancer og pre-cancer patienter (både læsion og anatomisk matchede kontralaterale klinisk normale væv) var forbundet med øget overflod af

Bacteroidetes

sammenlignet med prøver fra raske normale individer (figur 3a).

Prevotella

arter, i særdeleshed, adskilte og omfattede f.eks Otus svarende til

P. intermedia

,

P. melaninogenica

,

P. nanceiensis

,

P. Oris

,

P. tannerae

og uklassificerede arter (figur S5, tabel S15). Forhøjede niveauer af

P. melaninogenica

tidligere er blevet rapporteret som en potentiel spyt biomarkør for oral cancer [33] og

P. intermedia

er en periodontal patogen [34]. Yderligere undersøgelser vil være forpligtet til at forstå bidrag generelt (

Bacteroidetes

) og læsion-specifikke ændringer (

aktinobakterier

,

Firmicutes

) i microbiome af oral cancer og pre -cancer patienter.

Otus skelne kræft fra anatomisk matchede kontralaterale normale patientprøver

for at imødekomme behovet for biomarkører til at forudsige adfærd af oral cancer, der kunne analyseres med ikke-invasive tests, spurgte vi om kræft prøver kunne skelnes ved bakteriel sammensætning. I betragtning af cancer /normale parrede prøver, identificerede vi 11 Otus fra phyla

aktinobakterier Hotel (

Actinomyces

og

Rothia

, 2 Otus fra hver slægt) og

Firmicutes

(

Streptococcus

, 7 Otus), der blev nedsat betydeligt i kræft og en OTU fra phylum

Fusobacteria Hotel (

Fusobacterium

), der blev øget i kræft sammenlignet med anatomisk matchede kontralaterale normale patientprøver (tabel S17). Vægtet UniFrac principal koordinater analyse (PCoA) baseret på dette sæt af Otus adskilt fleste kræftformer fra normale og præ-kræft prøver med fem af de syv lymfeknude positive tilfælde danner en stram klynge i nederste højre hjørne af plottet (figur 4). Metastase til de cervikale (hals) lymfeknuder er en vigtig faktor for kræft i mundhulen patient overlevelse [35]. Den nuværende mangel på pålidelige metoder til at vurdere risikoen for metastase resultater hos patienter, der rutinemæssigt udsat for yderligere operation for at fjerne lymfeknuder, selv om de fleste ikke vil drage fordel af proceduren. Den stramme gruppering af prøver fra node positive patienter i figur 4 viser, at ændringer i sammensætningen af ​​oral cancer microbiome også kan holde lovende som en tumor associeret biomarkør for risiko for metastaser.

PCoA baseret på Vægtet UniFrac afstanden mellem prøver givet overflod af 12 Otus. Akse 1 (PCoA1): 54% af variationen forklaret. Akse 2 (PCoA2): 24% af variationen forklaret. N0 og N + angiver nodal status kræftpatient, N0 = node negativ, N + = knude positiv. Kræft kontrol og pre-cancer kontrol er kontralaterale klinisk normale patientprøver. Andre identificerer prøver fra raske normale individer

Hele micrbiome -. Ø mangfoldighed

For at undersøge prøve-til-prøve forskellighed, subsampled vi dataene ved tilfældigt at udvælge 31,109 sekvenser fra hvert samfund til justere for variation i sekventering dybde (tabel S18). Når man overvejer de tre prøve grupper (Kræft, Sund Normals og Pre-kræft), vi observerede signifikante microbiome forskelle for patient identitet baseret på både vægtede UniFrac (overflod) og vejet UniFrac (tilstedeværelse /fravær) målinger (tabel S19, figur S7 og S8). Ingen andre sammenligninger, såsom venstre vs højre, antal sekvenser eller læsion (kræft eller præ-kræft) vs. kontrol normale steder afslørede væsentlige forskelle. Disse observationer er i overensstemmelse med andre undersøgelser, der har fremhævet de inter-individuelle forskelle i den mundtlige microbiome [24]. Endvidere de støtter vores undersøgelse design, der måler ændringer i microbiome inden individer,

dvs

., Ved hjælp af hver patient som hans eller hendes egen kontrol.

Diskussion

Til studere orale malignitet-associeret microbiome ændringer, udførte vi en Discovery skærm (forsøg 1), hvor vi ikke-invasivt samplede cancere og kontralaterale klinisk normale vævsprøver fra hver enkelt. Sammenligning af sammensætningen af ​​de mikrobielle samfund i patienter identificeret ændringer i overflod af

aktinobakterier

Firmicutes

. Vi bekræftede disse observationer i en anden Bekræftelse Kohorte (Studie 2) og yderligere fundet væsentlige ændringer i overflod af

aktinobakterier

slægt

Rothia

og

Firmicutes

slægten

Streptococcus

når man overvejer alle kræftformer i Studie 2 (tabel S16). Selvom vi ikke kunne se en betydelig ændring i overflod af phylum

Fusobacteria

i enten Discovery eller bekræftelse Kohorter, fandt vi en signifikant stigning i overflod af

Fusobacteria

slægt,

Fusobacterium

når de overvejer alle kræftpatienter i Studie 2. Vi bemærker, at mens kohorter af patienter studeret her er små og heterogene, vores resultater vedrørende overflod af phyla ligner publicerede undersøgelser, der fokuserede på omfattende analyse af den mundtlige microbiome. Endvidere at anvendelsen af ​​forskellige sekventering teknologier måle overflod af 16S rDNA amplikoner i forsøg 1 og 2 understøtter robustheden af ​​vores observationer. Ikke desto mindre, yderligere større undersøgelser skal bidrage til bedre at definere de orale cancer associerede ændringer i overflod af disse phyla og slægter. Desuden har vi observeret ændringer i overflod af

Firmicutes

(

Streptococcus

) i forbindelse med orale pre-kræft, hvilket tyder på, at oral læsion forbundet forskydninger i sammensætningen af ​​det mikrobielle samfund kan forekomme tidligt i mundtlig cancer udvikling og /eller herold kræft progression.

Rygning er en risikofaktor for orale sygdomme, herunder kræft og parodontitis. Undersøgelser har påvist, at rygning påvirker sammensætningen af ​​den bakterielle samfund i mundhulen, herunder for eksempel spyt microbiome af raske rygere og ikke-rygere [36], og de subgingivale microbiomes af patienter med paradentose [37], samt dannelsen af ​​plak biofilm [38]. I vores undersøgelse fandt vi ingen tegn på generelle forskelle i microbiomes der kunne tilskrives rygning, men med kun tre nuværende rygere og fire ikke-rygere i vores kræftpatienter kohorter for eksempel, kan vi ikke drage nogen konklusioner på dette tidspunkt. På den ene side, fordi vi brugte hver patient som hans /hendes egen kontrol, ville vi ikke forvente at se rygning tilknyttede forskelle i overflod af mikrobiota forbundet med kræft, da rygning ville påvirke både kontrolstedet og kræft. På den anden side, i rygere, celler ved de klinisk normale steder og de kræftformer min reagerer forskelligt på rygning inducerede ændringer i biofilmdannelse, f.eks, øge muligheden at mens cancer associerede ændringer i overflod af mikrobiota i rygere og ikke-rygere synes ens, kan dannelse og funktionelle konsekvenser af de ændrede microbiomes forskellige i disse patientgrupper. Lignende betragtninger kunne gælde for immunsupprimerede individer.

Tilstedeværelsen af ​​bakterier i oral cancer og /eller forskelle i de bakterielle samfund er forbundet med oral cancer er tidligere blevet rapporteret ved hjælp af enten afhængige kultur [13], [14] eller molekylær metoder [15], [16], [17], endnu ingen konsistente iagttagelser er blevet rapporteret på tværs af disse undersøgelser. Det er imidlertid vanskeligt at sammenligne selv blandt to nylige undersøgelser rapporterer overflod af bakterier [16], [17] og denne undersøgelse på grund af forskelle i (a) prøvetype (podepind, denne undersøgelse vs. vævsprøve [16] [17]), (b) mundhulen site, (c) kilde til patient matchede normale kontrolprøver (anatomisk matchede kontralateral klinisk normale, denne undersøgelse, øvre aerodigestive tarmkanalen slimhinder [16], der støder normal [17]), (d ) opformerede region af 16S ribosomale gen (V4, denne undersøgelse, V4-V5 [16] eller V1-V4 [17]), (e) metoden (Sanger [16], [17] vs. pyrosekventering eller MiSeq, denne undersøgelse ), og (f) antal kloner eller sekvens læser tildelt Otus per prøve (gennemsnit 8000 og 55.000 læser per prøve, undersøgelse 1 og 2, henholdsvis i forhold til -90 eller -250 kloner per prøve [16], [17] ). For eksempel Pushalkar og kolleger [16] rapportering om 10 patienter viste, at 75 og 80% af kloner (normale og cancer, henholdsvis), blev tildelt til phylum

Firmicutes

. Denne andel er ikke kun højere end 40-0% målt i andre studier af mundhule raske eller cancerpatienter, men da der kun -90 kloner blev sekventeret per prøve, der er for få kloner til pålideligt bestemme relative forekomst af andre phyla til sammenligninger. En phylum niveau analyse af kun 16 tungen, gulvet i munden og mundhulen kræft rapporteret af Bebek og kolleger [17], men afslørede cancer associeret stigning i overflod af phylum

Fusobacteria

, i overensstemmelse med vores observationer, men faldt overflod af

Streptococcus

kunne ikke ses, så få kloner blev tildelt denne slægt.

Vi kan ikke skelne, om de observerede skift i mikrobielle samfund afspejle, at visse bakterier er mere velegnet til at klæbe og vokse i kræft mikromiljø, eller om de er kræft fremme. Endvidere er det uklart, hvordan at afveje de potentielle bidrag fra ændringer i rigelige slægter som

Streptococcus

i forhold til den mindre rigelige

aktinobakterier

slægter. Potentielle roller for bakterier og svampe i kræft fremme omfatter generation af kræftfremkaldende stoffer, såsom nitrosaminer eller andre pro-kræftfremkaldende kemikalier, kronisk inflammation og direkte virkninger på signalering i epitelceller resulterer i forøget proliferation eller undertrykkelse af apoptose [6], [7] [12], [39]. Kun et mindretal af den orale mikrobielle samfund kan klæbe til hårde og bløde orale væv, og samling af komplekset orale biofilm opnås ved efterfølgende vedhæftning af sekundære kolonisatorer.

Streptococcus

er en tidlig kolonisator og

Fusobacterium Hotel (

f.eks

.,

F. Nucleatum

) har en tilbøjelighed til co-aggregation med mange slægter, danner en bro mellem tidlige og sene kolonisatorer i den mundtlige biofilm [40]. Således på den ene side, den observerede fald i forekomsten af ​​

Streptococcus

og øget overflod af

Fusobacterium

slægter i præ-kræft kunne afspejle de ændrede overfladeegenskaber kræftcellerne og stroma, som måske ikke længere støtte vedhæftning af

streptokokker

. På den anden side, kan vi hypotesen, at skift i overflod af disse to slægter kunne resultere i en forbedret pro-inflammatorisk miljø, da

Streptococcus

arter er blevet rapporteret til at dæmpe

Fusobacterium nucleatum

Induced pro -inflammatory reaktioner af orale epitelceller [41], [42]. Vi bemærker også, at

Fusobacterium nucleatum

dyrkes som en biofilm er i stand til at invadere organotypiske kulturer [43], og for det andet, at organismen nylig er blevet rapporteret i tyktarmskræft [44], [45], yderligere støtte et potentielle rolle i kræft i mundhulen.

mundhulen tilbyder en relativt unik mulighed for at screene udsatte enkeltpersoner for (oral) kræft, fordi de læsioner kan ses, og som vi rapporterer her, skiftet i microbiome af kan detekteres kræft og præ-cancer-læsioner sammenlignet med anatomisk matchede klinisk normalt væv fra det samme individ i ikke-invasivt opsamlede prøver podning. Spyt er en anden ikke-invasivt indsamlet oral prøve bestående hovedsagelig af bakterieceller, men også kaste epiteliale og immunceller.