PLoS ONE: Curcumin og emodin nedregulere TGF-β signalvejen i Human livmoderhalskræft celler

Abstrakt

Livmoderhalskræft er den største årsag til kræftrelaterede dødsfald blandt kvinder, især i udviklingslandene og Human Papilloma Virus infektion i forbindelse med flere dereguleret signalveje fører til livmoderhalskræft carcinogenese. TGF-β-signalering i senere stadier af cancer vides at inducere epitelial til mesenkymale overgang fremme tumorvækst. Fytokemikalier, curcumin og emodin, er effektive som kemoforebyggende og kemoterapeutiske forbindelser mod flere kræftformer, herunder livmoderhalskræft. Hovedformålet med dette arbejde var at undersøge virkningen af ​​curcumin og emodin på TGF-β-signalvejen og dens funktionelle relevans for vækst, migration og invasion i to cervikale cancercellelinier, SiHa og HeLa. Da TGF-β og Wnt /β-catenin signalveje er kendt for at krydstale har fælles downstream mål, vi analyserede effekten af ​​TGF-β på β-catenin (en vigtig aktør i Wnt /β-catenin signalering) og også studeret, om curcumin og emodin modulere dem. Vi observerede, curcumin og emodin effektivt nedregulerer TGF-β-signalvejen ved at reducere ekspression af TGF-β-receptor II, P-Smad3 og Smad4, og også opveje de tumorgene virkninger af TGF-β ved at hæmme TGF-β-induceret migration og invasion. Angivelse af nedstrømseffektorer af TGF-β-signalvejen, cyclinD1, p21 og PIN1, blev hæmmet sammen med nedregulering af centrale mesenkymale markører (Snail og Slug) efter curcumin og emodin behandling. Curcumin og emodin viste sig også at synergistisk inhibere cellepopulation og migration i SiHa og HeLa-celler. Endvidere fandt vi, at TGF-β aktiveres Wnt /β-catenin-signalvejen i HeLa-celler, og curcumin og emodin nedregulerer reaktionsvejen ved at hæmme β-catenin. Tilsammen vore data giver en mekanistisk basis for anvendelsen af ​​curcumin og emodin ved behandling af livmoderhalskræft

Henvisning:. Thacker PC, Karunagaran D (2015) Curcumin og emodin nedregulere TGF-β-signalvejen i Humane livmoderhalskræft Cells. PLoS ONE 10 (3): e0120045. doi: 10,1371 /journal.pone.0120045

Academic Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec på Trois-Rivieres, CANADA

Modtaget: 30 oktober, 2014 Accepteret: 2 februar 2015; Udgivet: 18 marts, 2015

Copyright: © 2015 Thacker, Karunagaran. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

livmoderhalskræft er den fjerde hyppigste årsag til kræftrelaterede dødsfald blandt kvinder over hele verden og mere end 85% af tilfældene af livmoderhalskræft og dødsfald sker i udviklingslande, hvoraf, er Indien rapporteret at tegne sig for 27% af den samlede livmoderhalskræft kræftdødsfald [1]. Den underliggende mekanisme fremme cervikal tumorigenese er kompleks og omfatter deregulering af centrale signalveje bortset fra den vigtige rolle, som HPV afspilles (humant papillomvirus), infektion [2]. TGF-β-signalvejen er impliceret i komplekse cellulære processer, der regulerer udvikling, differentiering og homeostase [3]. TGF-β ligand binder til TGF-β-receptor II, aktivering TGF-β-receptor I ved transphosphorylering, som igen aktiverer R-Smads (Smad2 og Smad3) via phosphorylering ved deres C-terminale rester. Aktiveret R-Smads danner en heterokompleks med Smad4 og translokere til kernen, hvor de aktiverer TGF-β responsive gener [4]. I de tidlige stadier af tumorigenese, TGF-β-signalvejen virker som en tumorsuppressor forhindre progression af cellecyklus gennem G

1 fase ved nedreguleringen af ​​CyclinD1 og cyclinafhængige kinase (CDK) proteiner og induktion af p15

INK4B, p16

INK4a, som hæmmer CDK4 og CDK6; ligeledes p21

Cip1or p27

Kip1appears at opfylde funktionen af ​​p15

INK4B i dens fravær [5, 6]. TGF-β-medieret apoptose er kendt for at øge forholdet af ekspression af proapoptotiske Bax og anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner [7]. Men i fremskredne stadier af cancer, TGF-β-signalering er også vist at fremme invasionsevne og metastase ved at inducere ekspressionen af ​​Sneglen og andre transkriptionsfaktorer derved forårsager differentiering af epitelial til mesenkymale fænotype [8]. Slug og N-cadherin, kendte spillere af EMT, induceret af TGF-β er involveret i migration og invasion [9], og TGF-β-medieret induktion af N-cadherin involverer PIN1 (peptidyl-prolyl-cis /trans isomerase), kendt spiller en vigtig rolle i TGF-β-induceret migration og invasion af cancerceller [10]. TGF-β er også vist at stimulere cyclinD1 ekspression i det mindste delvis gennem aktivering af Wnt /β-catenin signalering [11]. Wnt /β-catenin signalering er kendt for at regulere de essentielle cellulære processer, der regulerer evnen af ​​den multifunktionelle β-catenin-protein for at aktivere transkription af gener involveret i celleadhæsion, proliferation, differentiering og andre signalveje [12]. Deregulering af Wnt /β-catenin signalering er kendt for at påvirke carcinogenese, og ændringer i Wnt /β-catenin-signalvejen er rapporteret i cervikal neoplasi [13]. Wnt ligand binder til de transmembrane Frizzled receptorer, stabiliserende β-catenin ved at hæmme aktiviteten af ​​glycogensyntase-kinase 3 β (GSK-3 β), der er forbundet med et multimert død kompleks bestående af axin, adenomatøs polyposis coli (APC) og casein kinase 1α (CK1α), hvor CK1α og GSK-3β phosphorylere β-catenin sekventielt, mærkning det for ubiquitinering og proteasomalaktivitet nedbrydning. Som reaktion på aktiveret Wnt /β-catenin signalering, er GSK-3 β inhiberet af pjusket proteiner, hvorved β-catenin akkumuleres i cytoplasmaet og translokeres ind i kernen. I kernen, β-catenin i association med T-celle-faktor /lymfocyt enhancer faktor (Tcf /LEF) familie og andre transkriptionelle cofaktorer, aktiverer en række af målgener, herunder c-myc og cyclin D1 [14]. Konvergens af TGF-β og Wnt /β-catenin signalering fremmer epithelial til mesenkymale overgang ved at inducere ekspression af Sneglen og Slug [15]. Der er en markant stigning i ekspressionen af ​​TGF-β-mRNA og protein i humane cancere og høj ekspression af TGF-β korrelerer med mere fremskreden malignitet og nedsat overlevelse [16]. Livmoderhalskræft celler vides at udskille TGF-β [17], som er i stand til at forøge intratumoral stroma og faldende tumor infiltrat, øge tumorvækst og metastase mens omgå værtens immunsystem [18]. Den centrale rolle af TGF-β til at fremme tumorudvikling antyder, at signalvejen kan være et godt mål for terapi af cancer [16]. De nuværende terapeutiske muligheder for livmoderhalskræft såsom strålebehandling, kirurgi og kemoterapi, især i udviklingslandene, har deres begrænsninger primært på grund af manglende adgang til behandling modalitet, omkostningerne, sværhedsgraden af ​​bivirkninger, høj systemisk toksicitet og resistens over for lægemidler, og hyppige udvikling af infertilitet efter behandling [19]. Desuden øger resistens mod kemoterapi opstå ud af deregulering af signaleringskaskader er en stor udfordring for en effektiv behandling, og TGF-β-signalering er en af ​​de signalveje, der vides at forårsage kemo-resistens via induktion af EMT [20]. Kemopræventive fytokemikalier målrette forskellige intracellulær signalering kaskader at hæmme tumorpromotion, spredning og progression [21]. Curcumin, en polyphenol stammer fra

Curcuma longa

og emodin, en anthraquinon stede i rødder og bark af flere lægeplanter menes at virke ved at modulere de deregulerede signalveje i neoplastiske celler [22, 23]. Curcumin er kendt for at inducere apoptose og blokere udviklingen af ​​livmoderhalskræft [24-26] og emodin er også vist at inducere apoptose i cervicale cancerceller [27, 28]. Curcumin er kendt for at hæmme TGF-β-signalering i bryst- og pancreascancer [29, 30], mens emodin vides at differentielt regulerer TGF-β-signalering i en kontekst-afhængig måde [31, 32], men virkningen af ​​disse fytokemikalier på TGF -β signalering i livmoderhalskræft celler mangler at blive undersøgt.

således hovedformålet med dette arbejde var at undersøge effekten af ​​curcumin og emodin på TGF-β signalvejen og dets funktionelle relevans for vækst og migration i to livmoderhalskræft cellelinjer, SiHa og HeLa. Endvidere var det af interesse at undersøge, om den kombinerede virkning af disse forbindelser havde nogen synergistiske eller additive effekter. Vi observerede, curcumin og emodin nedregulerer TGF-β-signalvejen i SiHa og HeLa-celler, og også opveje de tumorgene virkninger af TGF-β ved at hæmme TGF-β-induceret migration og invasion af disse celler. Også kombinationen af ​​curcumin og emodin synergistisk hæmmede cellelevedygtighed i SiHa og HeLa-celler.

Materialer og metoder

Reagenser

curcumin, emodin, 5, 5′, 6 , 6′-tetrachlor-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazol-carbocyanin iodid (JC-1) blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). En 10 mM opløsning af hver forbindelse (curcumin eller emodin) blev fremstillet i dimethylsulfoxid (DMSO), lagret som små prøver ved -20 ° C, og derefter fortyndet yderligere i celledyrkningsmedium efter behov. DMSO (0,4%) blev anvendt som vehikelkontrol for alle eksperimenterne. Humane TGF-β1was købt hos Peprotech (USA). Geltrex, Propidiumiodid, Lipofectamine 2000 Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS Sydamerikansk oprindelse) blev købt fra GIBCO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Polyethylenimin (PEI) blev indkøbt fra Polysciences (Warrington, PA, USA). Polyvinylidenfluoridmembran og Udvidet kemiluminescenskittet blev opnået fra BIORAD (Hercules, CA, USA). Protease og phosphatase inhibitor cocktail blev købt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). β-Actin-antistof blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) og antistoffer mod TGF-β-receptor I, TGF-β-receptor II, Smad4, N-cadherin, PIN1, β-catenin, GSK3p og P- GSK3p (Ser9) blev opnået fra Santa Cruz (CA; USA). Antistoffer mod P-Smad2, Smad2, P-Smad3, Smad3, sneglen, CyclinD1, Slug, Bax, Bcl-2 og p15, p16, p21, p27 var fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA) og peberrodsperoxidasekonjugeret sekundært antistof blev opnået fra Jackson ImmunoResearch Inc. (USA).

Cell kultur

Humane livmoderhalskræft cellelinjer, HeLa og SiHa blev opnået fra National Center for Cell Sciences (NCC’erne) Pune, Indien . De blev dyrket i komplet Dulbeccos modificerede Eagle-medium (cDMEM) bestående af DMEM suppleret med streptomycin (100 ug /ml), penicillin (100 U /ml) og 10% FBS. Celler blev holdt i en fugtig inkubator ved 37

0C med 5% CO

2.

Resazurin reduktion assay

Analyse af cytotoksicitet blev bestemt ved resazurin reduktion assay [33]. Celler blev podet i en 96 brønd plade med en tæthed på 5000 pr brønd og dyrket natten over. Celler blev derefter behandlet med forskellige koncentrationer af curcumin og emodin med eller uden 5 ng /ml TGF-β i cDMEM i 48 timer. Resazurinfarvestof blev føjet til mediet i en slutkoncentration på 0,1 mg /ml, inkuberet i 3 timer til reduktion af det blå farvestof resazurin til pink resorufin og absorbansen blev målt ved 570 og 595 nm. Dataene blev analyseret som procent af kontrol, hvor kontrolbrøndene blev behandlet med ækvivalente mængder af DMSO alene. De analyserede data, der repræsenterer procentdelen population af celler, blev plottet som gennemsnit ± standardfejl på middelværdien (S.E.M.). IC

50 blev opnået ved at bestemme koncentrationen af ​​forbindelserne resulterer i 50% inhibering af cellepopulationen efter 48 af behandling ved anvendelse af GraphPad PRISM software (GraphPad Software, Inc.).

JC-1-farvning

JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodid) er en lipofil fluorescerende kationisk farvestof anvendes til at vurdere det mitokondrielle membranpotentiale (a ^ m) i celler [34]. Intakt A ^ m udviser negativ ladning, hvilket tillader JC-1 farvestof til at indtaste den mitokondrielle matrix, hvor det ophobes danner aggregater, fluorescerer rødt, mens mitokondriemembranen kollapser i de apoptotiske celler, og således JC-1 kan ikke samle sig i mitokondrier af disse celler, hvor det forbliver i cytoplasmaet i den monomere form, der fluorescerer grønt. Faldet i forholdet rød til grøn fluorescens af farvestoffet er en indikation af den formindskede A ^ m af celler. Efter behandling af curcumin og emodin i nærvær eller fravær af TGF-β i 48 timer, blev JC-1 indeholdende medium (endelig JC-1-koncentration -5 ug /ml) tilsat til cellerne, efterfulgt af inkubation i 20 minutter ved 37 ° C. Efterfølgende blev cellerne vasket en gang med PBS og fluorescensen blev målt ved excitation: 485; emission: 535 for monomer (grøn fluorescens) og excitation 550; emission 600 for aggregaterne (rød fluorescens), ved hjælp af Perkin Elmer Enspire multi-pladelæser. Forholdet mellem rød til grøn fluorescens blev analyseret og plottet mod passende behandling betingelser.

sårheling assay

Ændringer i migration af celler efter behandling blev undersøgt ved hjælp af sårheling assay. Celler blev dyrket som et monolag i en 48 brønds plade og ved 100% konfluens; en ridse blev foretaget på monolag. Cellerne blev forsigtigt vasket og behandlet med curcumin og emodin i nærvær eller fravær af TGF-β og opretholdt i serumfrit medium. Cellemigrering ind i såret overflade blev overvåget ved mikroskopi. Billeder af bunden blev taget ved 4X forstørrelse umiddelbart efter tilsætning af emodin og efter 48 timer. Omfanget af migration i hver prøve blev målt som det område, som cellerne i 48 timer ved hjælp Tscratch analyse software [35] og udtrykt som procent af kontrol.

Matrigel Invasion assay

Livmoderhalskræft celle invasion blev vurderet ved Boyden assay ved anvendelse transwell kamre (8 um porestørrelse; Costar, MA, USA). Chambers blev overtrukket med 100 pi Matrigel og inkuberet natten over. Serum-udsultet SiHa (25.000) og HeLa (50.000) -celler blev podet i de øvre kamre i Matrigel-coatede brønde (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) indeholdende 100 pi DMEM plus den ønskede behandling. Curcumin eller emodin indeholdende DMEM med eller uden TGF-β, suppleret med 10% FBS blev anbragt i de nedre kamre, og cellerne fik lov til at migrere gennem filteret i 48 timer. Celler, som undlod at migrere blev fjernet fra den øvre overflade af kamrene ved skrabning med en vatpind. Celler, som med held migrerede gennem matrigel og membranen barrieren til den nedre membran blev fikseret i 100% methanol og farvet med 2% krystalviolet. Billeder af de farvede celler blev fanget ved 10X forstørrelse. Omfanget af invasion blev udtrykt som procent af kontrol udledes fra absorbansen af ​​krystalviolet frigives ved lysering af cellerne med 10% eddikesyre ved 595 nm.

Cellecyklusanalyse

propidiumiodidfarvning og flow cytometri blev anvendt til at vurdere cellecyklusfordeling profil. De behandlede celler blev vasket med PBS EDTA og derefter høstet under anvendelse af 0,25% trypsin EDTA og suspenderet i cDMEM. Celler blev derefter vasket med PBS og centrifugeret ved 1200 rpm ved 4 ° C i 5 min og resuspenderes i 300 pi PBS, fikseret med 0,7 ml 70% ethanol natten over. Fikserede celler blev spundet ned, vasket med 0,1% FBS indeholdende PBS og derefter suspenderet i 300 pi propidiumiodid (2 pg /ml) farvningsopløsning med RNase A (200 ug /ml) i mørke, inkuberet ved 37 ° C i 1 time. Data fra 10.000 celler blev opsamlet for hver prøve. Dataindsamling og -analyse blev udført på et flowcytometer (Beckman Coulter cell lab Quanta).

SBE og TOPFlash luciferase reporter assay

Celler (30.000 /brønd) blev podet i plader med 96 brønde og co transficerede med SBE4-Luc reporter konstrukt, indeholdende fire kopier af Smad bindingsstedet (GTCTAGAC) klonet i PBV-Luc indikerer den nedstrøms transkriptionelle aktivering af TGF-β-signalvejen (Addgene plasmid 16495) [36] eller TOPFlash, et luciferase reporter af β-catenin-medieret transkriptionel aktivering, med 7 TCF /LEF binding sites opstrøms for luciferase (Addgene plasmid 12456) [37] og pRL-TK (Renilla luciferase) plasmid under anvendelse af PEI (for SBE luciferase konstrukt) og lipofectamin 2000 (for TOPFlash luciferase-konstruktion) ifølge producentens instruktioner, i serum og antibiotikum frit DMEM. Seks timer efter transfektion blev mediet ændret, og cellerne blev behandlet med curcumin og emodin i nærvær eller fravær af TGF-β i cDMEM. Efter 24, blev cellerne lyseret og ildflue og Renilla luciferaseaktiviteter blev analyseret [38].

Protein isolation og western blotting

Celler blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) 48 timer efter behandling , og samlet protein blev ekstraheret efter skrabning og opsamling celler i radio immuno udfældning assay (RIPA) lysepuffer [20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM natriumchlorid, 1 mM ethylendiamin tetra eddikesyre, 1 mM β-glycerophosphat, 1% Triton X 100 , 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM natriumorthovanadat, 0,5% natriumdeoxycholat, 1 mM phenyl- methansulfonyl fluorid, 20 mM natriumfluorid, 1% protease inhibitor], inkuberet i 1 time og centrifugeret. Totalt celleprotein i supernatanten blev estimeret under anvendelse Bradford assay og 30 ug protein blev underkastet SDS-PAGE separation efterfulgt af overførsel på polyvinylidenedifluoride membran. Membranen blev inkuberet med primære antistoffer mod TGF-β-receptor I, TGF-β-receptor II, P-Smad2, Smad2, P-Smad3, Smad3, Smad4, β-catenin, GSK3p, P-GSK3p (Ser9), N-cadherin , pIN1, snail, CyclinD1, Slug, Bax, Bcl-2, p15, p16, p21, p27, CDK6 (1: 1000 fortynding), eller β-Actin (1: 10.000 fortynding) natten over, efterfulgt af inkubation med et HRP konjugeret sekundært antistof. Proteinbånd blev påvist ved anvendelse af et forøget kemiluminescens afsløring kit og visualiseret ved hjælp af Versa Doc billedanalysesystem (Bio-Rad).

Statistisk analyse

To halet uparret t-test eller to- variansanalyse blev anvendt til statistisk analyse af de ubehandlede og behandlede prøver eller som angivet. P-værdier 0,05, 0.01and 0,001 er angivet med ‘*’ ‘** “og” *** “, henholdsvis.

Resultater

Curcumin og emodin inducere cytotoksicitet i nærvær eller fravær af TGF β i humane livmoderhalskræft celler

Vi har testet effekten af ​​forskellige koncentrationer af curcumin og emodin på levedygtighed af humane livmoderhalskræft celler og IC

50 værdier beregnet ud fra disse data er anført i tabel 1. curcumin var relativt mere cytotoksiske for humane cervikale cancerceller analyseret i denne undersøgelse (tabel 1) og den blev brugt på 15 um i SiHa og 25 pM i HeLa-celler, mens emodin blev anvendt ved 40 uM i SiHa og HeLa celler til yderligere forsøg. Eftersom ofte observeres sekretion af TGF-β i stroma i de fremskredne stadier af livmoderhalskræft [18], ønskede vi at undersøge virkningen af ​​disse forbindelser i nærvær af TGF-β. I overensstemmelse med vores tidligere rapport, 5 ng /ml TGF-β faldt cellepopulationen [39] hæmmede mitrokondriemembranen i SiHa-celler (fig. 1A og C), mens HeLa-celler forblev upåvirket (fig. 1B og D). Curcumin og emodin fandtes signifikant at hæmme cellevækst (fig. 1A og B) som observeret ved resazurin reduktion assay i nærvær såvel som fravær af TGF-β i disse celler. Faldet i mitokondriemembranen potentiale (fig. 1C og D) som følge af curcumin eller emodin, som analyseres af JC-1 farvestof fluorimetri var signifikant i SiHa og HeLa-celler. Denne virkning var uafhængig af TGF-β i HeLa men var ikke signifikant i nærvær af TGF-β i SiHa-celler (fig. 1C og D). Disse resultater viser, at selv om TGF-β reducerede cellevækst og mitrokondriemembranen i SiHa men ikke i HeLa-celler, havde det ikke påvirke curcumin eller emodin-medieret hæmning af vækst og mitochondriemembranpotential i disse celler.

SiHa (A) og HeLa (B) celler blev behandlet med 15 og 25 pM curcumin henholdsvis eller 40 uM emodin i nærvær (TGF-β) eller fravær (UT), i 5 ng /ml TGF-β i 48 timer og analyseret for celleviabilitet ved resazurin reduktionsmetode. levedygtighed procentvise celle blev beregnet ved at normalisere absorbansen af ​​behandlede prøver mod DMSO-kontrol (n = 3, gennemsnit ± S.E.M.). Curcumin eller emodin behandlede SiHa (C) og HeLa (D) celler i nærvær (TGF-p) og fravær (UT) af TGF-β blev analyseret for JC-1-aktivitet ved anvendelse af en fluorimetrisk metode som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultaterne blev plottet som fold ændring af den gennemsnitlige fluorescerende intensitet (MFI) i forhold til DMSO-kontrol (n = 3, gennemsnit ± SEM).

Siden 5 ng /ml TGF-β ikke havde nogen signifikant virkning på cellelevedygtigheden eller mitrokondriemembranen i HeLa-celler, uanset om en anden koncentration af TGF-β vil have lignende eller anden reaktion blev undersøgt. I denne forbindelse blev HeLa-celler behandlet med forskellige koncentrationer af TGF-β og dets virkning på dens signalering blev vurderet ved at analysere aktiviteten af ​​TGF-β-responsiv SBE-Luc reporter konstrukt, i en udlæsning assay. Det blev observeret, at 2,5 ng /ml TGF-β signifikant inducerede SBE luciferaseaktivitet men der var ingen signifikant forskel i omfanget af induktion med stigningen i dens koncentration (fig. 2A). Desuden blev HeLa-celler behandlet med forskellige koncentrationer af TGF-β i nærvær eller fravær af curcumin eller emodin vurderet for ændringer i cellelevedygtighed og mitochondriemembranpotential. Forskellige koncentrationer af TGF-β har ingen signifikant virkning på cellelevedygtighed (fig. 2B) eller mitochondriemembranpotential (fig. 2C), og det havde ingen indflydelse på inhiberingen af ​​cellernes levedygtighed (fig. 2B) eller mitokondrisk membranpotentiale (Fig. 2C) ved curcumin og emodin i disse celler. Disse resultater indikerer, at mangel på reaktionsevne HeLa-celler til TGF-β i retning cellelevedygtighed og mitochondriemembranpotential var koncentrationsuafhængig, og også TGF-β påvirkede ikke vækstinhiberende aktivitet af curcumin eller emodin.

HeLa-celler (A) transficeret med SBE ildflueluciferase og TK-Renilla luciferase konstruktioner blev behandlet (6h efter transfektion) med 2,5, 5, 10 og 20 ng /ml TGF-β og analyseret for luciferaseaktivitet 24 timer efter behandling. Transfektionseffektiviteten blev normaliseret ved at beregne det relative forhold af ildflue at Renilla luciferaseaktiviteter og resultaterne blev afbildet som fold ændring i forhold til den ubehandlede kontrol. HeLa-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af TGF-β i nærvær og fravær af curcumin eller emodin og analyseret for celleviabilitet ved resazurin reduktion metode (B), og mitochondriemembranpotential ved at analysere JC-1-aktivitet (C) under anvendelse af en fluorimetrisk metode efter 48h som beskrevet i Materialer og metoder (n = 3, gennemsnit ± SEM).

Curcumin og emodin inhibere cellevækst, migrering og invasion i nærvær eller fravær af TGF-β i SiHa og HeLa-celler

TGF-β er kendt for at påvirke proliferation og migration under carcinogenese [40]. Vi fandt, at TGF-β induceret G

0 /G

1 arrest i SiHa, men ikke i HeLa-celler (fig. 3A) og virkningen af ​​curcumin og emodin på cellecyklus profil under disse betingelser blev yderligere analyseret. Curcumin induceret G

2 /M anholdelse i SiHa celler betydeligt, mens emodin effekt på G

2 /M fase var ikke statistisk signifikant, selvom anholdelsen var synlig (P-0,08). Tilstedeværelsen af ​​TGF-β påvirkede ikke signifikant curcumin effekt; mens emodin-medieret delvis G

2 /M arrest viste sig at blive ophævet af TGF-β. Men både curcumin og emodin forøgede sub G

0 /G

1 populationen (betegnende for apoptose), i nærvær såvel som fravær af TGF-β betydeligt i HeLa-celler (fig. 3A). Endvidere, som observeret af sårheling assay, TGF-β inducerede migration i både SiHa og HeLa-celler og curcumin og emodin fandtes at inhibere migrationen selv i nærvær af TGF-β (Fig. 3B og C). Endvidere invasion assay under anvendelse af Matrigel coated transwell inserts angivet, at TGF-β induceret invasion i både SiHa og HeLa-celler, og curcumin og emodin hæmmede både den basale og af TGF-β induceret invasion i disse celler (fig. 4). Disse resultater antyder, at curcumin og emodin inducere G

2 /M arrest i SiHa og apoptose i HeLa-celler, hhv. De hæmmer signifikant migration og invasion af SiHa og HeLa-celler og er også i stand til at opveje TGF-β induceret migration og invasion i disse celler.

SiHa og HeLa (A) celler blev behandlet med curcumin eller emodin i nærvær eller fravær af TGF-β i 48 timer og underkastet cellecyklus-analyse under anvendelse af flowcytometri. Procentvis fordeling af forskellige faser af cellecyklussen blev plottet på Y-aksen mod de angivne behandlingsbetingelser på X-aksen. SiHa (B) og HeLa (C) -celler blev podet i et konfluent monolag. 16h efter podning, blev en ridse foretaget af en mikro spids, og passende behandling blev givet i serumfrit medium. Ridset overflade blev afbildet ved 0h og 48 timer efter behandling. Omfanget af migration i hver prøve blev målt som det område, som celler i 48h ved hjælp TScratch software og repræsenteret som procentvise ændring i forhold til DMSO-kontrol (B) (n = 3, gennemsnit ± SEM).

SiHa (25.000) og HeLa (50.000) celler podedes på Boyden kammer overtrukket med matrigel, blev behandlet med curcumin, emodin og /eller TGF-β i 48 timer. Efterbehandling blev celler farvet som beskrevet i Materialer og Metoder, og filmede med mikroskop (A). Kvantificering af invaderede celler (B og C) blev gjort ved aflæsning af absorbansen af ​​krystalviolet ved 595 nm. Procent invasion blev beregnet som fold ændring i forhold til ubehandlet kontrol (n = 3, gennemsnit ± SEM)

Curcumin og emodin inhibere TGF-β-signalvejen i SiHa og HeLa-celler

for at undersøge om disse forbindelser vil inhibere TGF-β-signalering, TGF-β inducerede SBE luciferaseaktivitet i SiHa og HeLa-celler blev analyseret og viste sig at blive inhiberet af både curcumin og emodin (fig. 5A og B). At forstå, hvis TGF-β-signalering inhiberes ved at påvirke ekspression af dens receptorer, undersøgte vi virkningen af ​​disse forbindelser på ekspressionen af ​​TGF-β-receptorproteiner. Som observeret ved western blotting, både i SiHa og HeLa-celler, curcumin og emodin betydeligt nedreguleret ekspression af TGF-β-receptor II, mens TGF-β-receptor jeg blev nedreguleret kun i HeLa-celler, og i mindre grad (fig. 5C og D). Selv om både SiHa og HeLa-celler opførte sig på lignende måde, var virkningerne mere dybtgående i HeLa-celler og så de blev valgt til yderligere undersøgelser. I denne forbindelse blev ekspressionen af ​​Smad proteiner efter behandling med disse forbindelser i nærvær og fravær af TGF-β analyseret ved western blotting. TGF-β vides at signifikant inducerer phosphorylering af Smad2 og Smad3 fra 15 min til en time af behandling [41, 42], og således phosphorylering af Smad2 og Smad3 proteiner blev analyseret i HeLa-celler forbehandlet med curcumin og emodin i 48 timer, og derefter behandlet med TGF-β i 30 min. TGF-β inducerede phosphorylering af Smad2 og Smad3 signifikant (fig. 6A). Curcumin og emodin inhiberede signifikant induktion af phosphorylering af Smad2 og Smad3 i HeLa-celler (fig. 6A). Eftersom ændringer i ekspression af nedstrøms mål for TGF-β og effektorer i forbindelse med EMT generelt overholdes ved 24 til 72h [42], var det af interesse at undersøge virkningen af ​​co behandling af curcumin eller emodin med TGF-β efter 48h af TGF-β behandling på centrale aktører, downstream mål og effektorer af TGF-β-signalvejen. Ved 48h inkubation også blev TGF-β sig at inducere phosphorylering af Smad2 /Smad3, og ekspressionen af ​​Smad4 protein og deres basale samt TGF-β-induceret ekspression blev nedreguleret ved curcumin og emodin, mens den samlede Smad2 og Smad3 ekspression forblev upåvirket (fig. 6B). Det blev således konstateret, at curcumin og emodin nedregulerer TGF-β-signalvejen ved nedregulering TGF-β-receptor II, P-Smad2, P-Smad3 og Smad4.

SiHa (A) og HeLa (B) celler transficeret med SBE ildflueluciferase og TK-Renilla luciferase konstruktioner og behandlet med curcumin og emodin i nærvær eller fravær af TGF-β, blev analyseret for luciferaseaktivitet. Transfektionseffektiviteten blev normaliseret ved at beregne det relative forhold af ildflue at Renilla luciferaseaktiviteter og resultaterne blev afbildet som fold ændring i forhold til den ubehandlede kontrol. Repræsentativt forsøg er vist, andet uafhængigt forsøg gav tilsvarende resultater. Totale cellelysater af SiHa (C) og HeLa (D) celler behandlet med curcumin eller emodin i nærvær eller fravær af TGF-β i 48 timer og blev underkastet immunblotting med TGF-β-receptor I (TGFRI), TGF-β-receptor II ( TGFRII) eller β-actin-(lastning kontrol) antistoffer. En repræsentativ-blot er vist, og de viste værdier repræsenterer densitometrisk analyse af proteinet båndet i forhold til p-actin og lignende resultater blev bekræftet i en anden uafhængigt forsøg.

Totale cellelysater af HeLa-celler forbehandlet med curcumin og emodin i 48 timer, og behandles med TGF-β i 30 min blev underkastet immunoblotting med P-Smad2 og P-Smad3 proteiner (A). Samlede cellelysat af HeLa celler behandlet med curcumin eller emodin, i nærvær eller fravær af TGF-β i 48 timer blev underkastet immunoblotting med P-Smad2, P-Smad3, Smad2, Smad3, Smad4 og β-actin (loading control) antistoffer ( B). En repræsentativ blot er vist, og de viste værdier repræsenterer densitometrisk analyse af proteinet band med hensyn til p-Actin og lignende resultater blev bekræftet i en anden uafhængig eksperiment.

Curcumin og emodin påvirke downstream spillere og effektorer af TGF-β-signalvejen

Smad-transkriptionsfaktor-komplekser er kendt for at regulere CDK6 inhibitor p21 [5]. Vi observerede, at ekspressionen af ​​p21 og CyclinD1 viste sig at blive induceret af TGF-β, men blev nedreguleret ved curcumin og emodin behandling (fig. 7A). TGF-β-induceret migration fremmes af PIN1 [10] og som forventet, curcumin og emodin ned reguleret PIN1 signifikant (fig. 7A). Vi fandt, at curcumin og emodin betydeligt nedreguleret ekspression af p15, p16, CDK6, p27 selvom curcumin ikke kunne inhibere p16 i nærvær af TGF-β (Fig. 7B). Bax til Bcl-2-forhold antyder modtageligheden af ​​celler til celledød [43], og det er op reguleret ved curcumin og emodin behandling (fig. 7C).