PLoS ONE: Selektivitet og Styrken af ​​microcystin Beslægtede stoffer mod OATP1B1 og OATP1B3 Udtrykke Cancer Cells

Abstrakt

Microcystins er potente phosphataseinhibitorer og cellulære toksiner. De kræver aktiv transport af OATP1B1 og OATP1B3 transportører til optagelse i humane celler, og den høje ekspression af disse transportører i leveren tegner sig for deres selektive hepatisk toksicitet. Adskillige humane tumorer har vist sig at have høje niveauer af ekspression af OATP1B3 men ikke OATP1B1, den vigtigste transportør i leverceller. Vi antager, at microcystin varianter kunne isoleres, der transporteres fortrinsvis ved OATP1B3 forhold til OATP1B1 at gå videre som anticancer midler med klinisk acceptabel levertoksicitet. Microcystin varianter er blevet isoleret og testet for cytotoksicitet i kræftceller stabilt transficeret med OATP1B1 og OATP1B3 transportører. Microcystin varianter med cytotoksisk OATP1B1 /OATP1B3 IC

50 forhold, der lå mellem 0,2 og 32 blev fundet, der repræsenterer en 150 ganges område i transporter selektivitet. Som microcystin struktur har en betydelig indvirkning på transporter selektivitet, er det potentielt muligt at udvikle analoger med endnu mere udtalt OATP1B3 selektivitet og dermed gøre det muligt for deres udvikling som anticancer narkotika

Henvisning:. Niedermeyer THJ, daglig A, Swiatecka-Hagenbruch M, Moskva JA (2014) Selektivitet og Styrken af ​​microcystin Beslægtede stoffer mod OATP1B1 og OATP1B3 udtrykke kræftceller. PLoS ONE 9 (3): e91476. doi: 10,1371 /journal.pone.0091476

Redaktør: Matias A. Avila, University of Navarra School of Medicine og Center for Anvendt Medical Research (CIMA), Spanien

Modtaget: 19. december 2013; Accepteret: 13 februar 2014; Udgivet: 10 marts 2014

Copyright: © 2014 Niedermeyer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af DanceBlue, en elev-run indsats, der understøtter den kliniske pleje og forskning i pædiatrisk onkologi ved universitetet i Kentucy, og dels af den tyske Forbundsministeriet for Økonomi og Teknologi (KF2766301SB0). Open Access publicering er støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft og Open Access Publishing Fund af Tübingen Universitet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Timo Niedermeyer og Monika Swiatecka-Hagenbruch er medarbejdere i Cyano Biotech GmbH. Der er ingen markedsførte produkter at erklære. Cyano Biotech GmbH har givet tilladelse til at offentliggøre manuskriptet. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Microcystins (MCS) er cykliske heptapeptider produceret af flere cyanobakteriel slægter såsom

Microcystis

,

Oscillatoria

,

Planktothrix

,

Nostoc

, og

Anabaena

. De kan betragtes at være blandt de bedst undersøgte cyanobakterielle sekundære metabolitter [1] – [4]. Den fælles strukturelt træk ved microcystins er en polyketidsyntase afledte aminosyresekvens med akronymet “Adda”, (2S, 3S, 8S, 9S) -3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca- 4,6-diensyre, som også er en af ​​de to obligatoriske substrukturer for potente protein-serin /threonin-phosphatase (PP) 1 og PP2A inhibering iagttaget for microcystins [5] – [9]. Ikke kun er biosyntesen af ​​disse forbindelser ved polyketidsyntaser og ikke-ribosomale peptid syntetaser bemærkelsesværdigt godt forstået [10] – [12], men også mere end 90 individuelle medlemmer af denne kemisk meget forskellige sammensatte familie er blevet beskrevet i den videnskabelige litteratur til dato (. figur 1) [13] – [56]. Specielt er udsat for variation er de L-aminosyrer, der er beliggende ved positionerne 2 og 4 i MC rygraden. Beslægtede forbindelser er nodularins, der findes i

Nodularia

sp, som også indeholder Adda men er cykliske pentapeptider stedet for heptapeptider (Fig. 1) [57] -.. [60]

Forekomst af rester fundet inden microcystins (til venstre) og nodularins (til højre) er proportional med skriftstørrelsen af ​​den respektive rest. Data, der anvendes til at generere dette tal er deponeret på https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.880756.

At være potente protein serin /threonin phosphatase hæmmere, microcystins og nodularins har en dybtgående virkning på cellesignalering og cytoskelet vedligeholdelse, hvilket fører til død af påvirkede celler [61], [62]. Imidlertid er de relativt store og amfifile MC’er er ude af stand til at krydse cellemembraner ved passiv diffusion. I stedet er de afhængige af aktiv optagelse af celler. Tre medlemmer af den organiske anion transporterer polypeptider (OATP) familie er i stand til at mægle denne optagelse af MC’er, nemlig OATP1B1, 1B3 og 1A2 [63], [64]. OATP1B1 og OATP1B3 er de mest effektive microcystin transportører, og som i raske mennesker både transportører udelukkende fundet at blive udtrykt i levervæv [64], [65], microcystins og nodularins er kendt for at forårsage omfattende leverskader [66] – [68 ]. microcystins blev således berygtede som hepatotoxins forårsager skade på mennesker og kvæg, når disse forbindelser akkumuleret i kilder til drikkevand under algernes vand bloom gange [69], [70]. Hæmmere af disse OATP transportører afhjælpe den hepatotoksicitet af microcystins og nodularins [68], [71], [72]. I modsætning til OATP1B1, som udtrykkes i hepatocytter i hele leveren lap udføres OATP1B3 lokalisering begrænset omkring den centrale vene [64]

OATPs øjeblikket i diskussionen som mål for cancerterapi [73] -. [76] . Mest interessant, OATP1B3, men ikke OATP1B1, har vist sig at være funktionelt udtrykt i en række kræftformer væv, især colontumorer, men også brysttumorer, lungetumorer, pancreas og hepatocellulære tumorer [75], [77] – [79] . Som differential toksicitet naturlig microcystin varianter på cellelinjer udtrykker enten OATP1B1 eller OATP1B3 er blevet observeret [78], [80], disse fund rejst spørgsmålet om, hvorvidt microcystins kunne være egnet som fører til lægemiddelstoffer mod disse kræftformer, og hvis der er microcystins blandt de mere end 90 kendte varianter, som selektivt transporteres med OATP1B3 forhold til OATP1B1. Selektivitet der favoriserer OATP1B3 løbet OATP1B1 bør føre til en nedsat hepatisk clearance og øget optagelse af MC’er i OATP1B3-udtrykkende tumorer, hvilket skaber en terapeutisk vindue af den respektive forbindelse ved at nedsætte hepatisk clearance rate og toksicitet. MC’er er interessante som nye bly strukturer, fordi de har en virkningsmekanisme endnu ikke brugt, men i øjeblikket diskuteret for kræftbehandling (fosfatase hæmning) [81] – [83], og i modsætning til de fleste for tiden tilgængelige anticancer narkotika, de har brug for aktive transport i celler og dermed skåne alle væv ikke udtrykker de nævnte OATPs.

Vi har isoleret forskellige microcystin kongenere fra cyanobakterier af slægterne

Microcystis

,

Planktothrix

, og

Nodularia

at teste hypotesen om, hvorvidt forskellige transporter selektiviteter kunne være opnåelige. Som værktøjer til selektivitet testning, cervikal cancer HeLa-celler og tyktarmskræft RKO-celler stabilt transficeret med ekspressionsvektorer til OATP1B1 og 1B3 er blevet anvendt. I den foreliggende manuskript er resultaterne af testningen af ​​isolerede MCS på disse cellelinier beskrevet. De fastlagte IC

50 værdier samt de observerede selektivitet forskelle tydeligt viser, at små strukturelle forskelle i den testede MCs faktisk have en betydelig indvirkning på transportør selektivitet og cytotoksiske styrke.

Resultater og Diskussion

aminosyre (AA) sammensætninger af de testede MCs er opsummeret i tabel 1

strukturerne af microcystin kongenere er fastlagt på grundlag af tandem HRMS [51], [52], [84 ], støttet af

1 H- og COSY-NMR-spektroskopi. Alle MC’er indeholder den karakteristiske Adda del i position 5 og D-Ala i stilling 1 af molekylet. Kun én af de isolerede congenere har en

O

-methylated d-iso-Glu i stedet for d-iso-Glu i position 6 (22). d-iso-β-MeAsp og d-iso-Asp i position 3 er næsten ligeligt fordelt, som er Mdha og Dhb i position 7. l aminosyrer i position 2 omfatter Leu, Tyr, Arg, HTY, Hil (faldende rækkefølge af tæller), i position 4 Arg, Tyr, Trp, Phe, HTY, og har findes. Ud over 22 MC varianter, nodularin (23) som en cyklisk Adda indeholder pentapeptid samt okadainsyre (24) som en strukturelt ikke MC-relaterede PP inhibitor er blevet testet.

De IC50-værdierne af alle isolerede MCs mod OATP1B1- og OATP1B3-udtrykkende HeLa eller RKO cellelinjer er blevet bestemt. Resultaterne er vist i tabel 2.

Interessant markante forskelle for både styrke og selektivitet af individet MC kongenere kunne observeres.

Selektivitet

Mens substitution af d-iso-β-MeAsp

3 for d-iso-Asp

3 (f.eks forbindelser 1/2 og 13/14) synes ikke at have en væsentlig indflydelse på hverken styrken eller selektivitet, påvirkning af tilstedeværelse af enten Mdha

7 eller (

E

) Dhb

7 (fx 3/4, 5/6, 8/9, og 14/15) er tvetydig: Mens der i sagen af 3/4 og 5/6 substitution af Mdha

7 for (

E

) Dhb

7 fører til en dyb stigning i selektivitet for OATP1B3 løbet OATP1B1, denne effekt blev ikke observeret for 8 /9 og 14/15. Da de seks mindst OATP1B3 selektive forbindelser (1, 2, 3, 5, 7, 23) alle har Mdha

7 eller Mdhb

7 while (

E

) Dhb

7 er fundet i 3 af de 6 mest OATP1B3 selektive forbindelser (4, 10, 12, 15, 16, 18), er det sandsynligt, at (

E

) Dhb

7 har indflydelse på selektiviteten men er ikke den eneste strukturelle træk giver selektivitet.

Faktisk især aminosyreresterne i positionerne 2 og 4 i MC kernestrukturen synes at være vigtige for både styrke og selektivitet. Mens 80% af de fleste OATP1B1 selektive forbindelser har Leu i position 2, denne aminosyre er helt fraværende i de fleste OATP1B3 selektive forbindelser. Imidlertid er Leu også fundet i position 2 i flere congenere, der er svagt OATP1B3 selektive (6, 8, 9), således Leu alene gør ikke en forbindelse OATP1B1 selektiv. Arg i position 2 synes at inducere OATP1B3 selektivitet, mens Arg i position 4 ikke har nogen indflydelse på selektiviteten. Dette er indlysende med forbindelser 13 og 16, hvor udveksling af aminosyrerne i positionerne 2 og 4 har en enorm indflydelse på selektivitet. Arg i kombination med de aromatiske aminosyrer Phe, Tyr, og HTY er fremtrædende monomerer fundet i OATP1B3 selektive forbindelser. Især kombinationer af Arg

2 og Phe

4 (12) eller Arg

2 og Tyr

4 (16) synes at give OATP1B3 selektivitet. Men igen, tilstedeværelse af Arg i position 2 synes ikke at være obligatorisk for OATP1B3 selektivitet (4).

Interessant, pentapeptidet nodularin (23) er den mest OATP1B1 selektive blandt Adda indeholdende forbindelser undersøgt.

Potens

Styrken af ​​MC-induceret celledød i testen, der anvendes til denne undersøgelse har to facetter. På den ene side, toksicitet MC kongenere afhænger af omfanget af deres PP hæmning [85]. På den anden side, er styrken afhængigt transportere kapacitet af den respektive OATP. Disse to virkninger er ikke skelnes i den foreliggende undersøgelse. Mens nogle tidligere undersøgelser tyder på, at

in vitro

in vivo

toksicitet er relateret til enzym hæmning snarere end transport [78], [85], andre rapporter viser sammenlignelige PP hæmning af forskellige microcystin kongenere , hvilket indebærer, at forskelle i transport- bidrager til

in vivo

toksicitet [80], [86].

Ikke overraskende, 22, og byder på

O

-methylated d-iso- Glu

6, er en af ​​de mindst potente forbindelser. Modifikationer af den frie carboxylsyre med Glu vil sandsynligvis føre til et tab af effektivitet på grund af tab af interaktion med en positivt ladet arginin i det aktive center af proteinphosphataser [7], og Glu (OMe) indeholdende congener har vist sig at hæmme PP1 i langt mindre grad end analoge Glu indeholder MCs [87] og har lavere

in vivo

toksicitet [26]. Interessant, også 10, 11 og 21 viste svagere toksicitet end de fleste andre kongenere. Mens 10 inhiberer PP2A omkring tyve gange svagere sammenlignet med 1 [78], [80], [85], [86], dets toksicitet i det foreliggende assay er omkring 500 gange lavere. Dette indikerer, at i tilfældet med 10 (og også dets analog 11), er det sandsynligt, at toksiciteten er ikke kun et spørgsmål om PP-inhibering effektivitet, men også af OATP transport kapacitet, som MC-RR er en indikation under fysiologiske betingelser og dermed mindre tilbøjelige til at blive transporteret gennem cellemembraner ved aniontransporter. Generelt indeholder cytotoksicitet i vores assay ikke korrelerer med proteinphosphatase hæmning styrkekontrol som beskrevet i litteraturen for forbindelserne 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 18, 19, 20, 23 [56], [ ,,,0],78], [80], [85], [86]. Vores data indikerer således, at forskellige transport effektivitet har en større indvirkning på

in vivo

toksicitet end forskellige protein fosfatase hæmning potens.

Interessant, de mest potente MCS med IC

50 værdier i sub-nanomolære område (5, 6, 7, 8, 17, 18, 19), alle har en kombination af enten Leu

2 og Tyr /Phe /Trp

4 eller Tyr /HTY

2 og Tyr /HTY

4. Arg er fraværende fra de mest potente congenere. De mindst potente congenere med IC

50 værdier 100 nM (10, 11, 21, 22) har alle enten Tyr

2 og Arg /Har

4 eller Arg

2 og Arg

4. Tilstedeværelse af Arg generelt sænker styrken, igen støtter hypotesen om, at den positivt ladede Arg rester hæmmer transport effektivitet ud over at reducere PP2A hæmning, og dermed lavere

in vivo

toksicitet.

Opsummering og Konklusioner

i vores screening af 23 naturlige MC-varianter, vi har fundet flere MC’er med en IC

50 i det lave nanomolære område og med transportør selektivitet, der favoriserer OATP1B3 løbet OATP1B1 med en faktor på op til tredive. Mens tilstedeværelsen af ​​Arg generelt sænker styrken af ​​MC cytotoksicitet, dets tilstedeværelse i position 2 i MC kernestrukturen synes også at være vigtig for OATP1B3 selektivitet, hvilket indebærer, at denne transporter kan være mere tolerante over for den kationiske karakter af Arg under fysiologiske betingelser end OATP1B1. Tilstedeværelsen af ​​de svagt sure aromatiske aminosyrer Tyr eller garn med høj styrke i position 4 i tillæg til Arg i position 2 synes gavnligt for OATP1B3 selektivitet. Der er behov Salg

Yderligere undersøgelser at skelne, om de observerede forskelle i styrken skyldes til forskellige PP-inhibering eller forskellige transport evne af OATP. Men tidligere resultater tyder på, at

in vivo

toksicitet er primært afhængig af OATP transport kinetik end på forskelle i PP hæmning [80], [86].

Selvom udledte struktur aktivitet relationer er tvetydige i dele, kan de strukturelle træk observeret for OATP1B3 selektivitet kondenseres til på nuværende tidspunkt mest sandsynligt selektiv generelle struktur cyclo (-d-Ala

1-l-Arg

2-d- (Me) Asp

3-l-aromatisk aminosyre

4-Adda

5-d-Glu

6 – (

E

) Dhb

7). Denne generelle struktur kan anvendes som udgangspunkt til generering hidtil ukendte forbindelser fx ved forløber fodring eller biocombinatorial strategier

En udfordring at bruge MCs som lægemiddel fører stadig:. Selv med selektive MC varianter, levertoksicitet stadig kan være en stor udfordring, hvilket gør det nødvendigt at generere MC varianter, der kunne være metabolisk afgiftet af sunde leverceller og /eller effektivt effluxed i galden, og dermed drage fordel af hepatiske afgiftning og clearance mekanismer, der ikke ville findes i tumorer.

Materialer og Metoder

Cyanobakterielle Materiale

Flere

Microcystis aeruginosa

Planktothrix rubescens

stammer samt en

Nodularia

stammen er blevet brugt til at producere de undersøgte microcystin kongenere: 2 og 3,

Microcystis aeruginosa

CBT 265; 4 og 15,

Planktothrix rubescens

CBT 310; 5, 16 og 17,

Microcystis aeruginosa

CBT 850, 6, 9, 18, 19, og 20,

Planktothrix rubescens

CBT 862, 11,

Planktothrix rubescens

CBT 329, 12,

Microcystis aeruginosa

CBT 861, 14, 21, og 22,

Microcystis aeruginosa

CBT 480, 23,

Nodularia

sp. CBT 786. Stammerne blev klassificeret på basis af PCR-analyse og sekventering af forskellige markørgener samt deres morfologi, og er deponeret i samlingen Cyano Biotech (CBT) kultur under deponeringsnumrene anført ovenfor (Cyano Biotech, Berlin, Tyskland). Stammerne blev dyrket i BG11 medium [88] ved 20 ° C under konstant lys (60-80 pmol m

-2 s

-1) i 20 L skala fotobioreaktorer og høstet semi-kontinuerligt over en periode på flere uge.

Isolering af microcystins

Cyanobakterieceller stammer blev screenet ved HPLC-DAD /IT-TOF-MS (Kinetex C

18, 2,6 um, 100 × 3 mm søjle, Phenomenex, Torrance, USA) under anvendelse af en lineær kontrolgradienten vandig CH

3CN (5 til 80% inden for 25 minutter ved 0,6 ml /min; 0,025% vol /vol TFA) for at bekræfte MC tilstedeværelse ved deres karakteristiske UV-spektrum samt karakteristisk tandem MS fragment ion ved

m /z

375 [52], [89]. Udvalgte positive stammer er blevet dyrket i BG11 medium [88] ved 20 ° C under konstant lys (60-80 pmol m

-2 s

-1) i 20 L skala foto bioreaktorer. Efter biomasse høst og frysetørring blev biomasser resuspenderet i 50% MeOH (v /v), behandlet med en ultralydbehandling stang (Bandelin, Berlin, Tyskland) og ekstraheret på et rysteapparat i 30 minutter. Efter centrifugering blev biomassen blev efterfølgende ekstraheret under anvendelse af 80% MeOH (v /v). De 50% MeOH og 80% MeOH ekstrakter af de respektive biomasser blev kombineret og tørret

i vakuum

. De rå ekstrakter blev fraktioneret under anvendelse af vand-methanol tringradienter på C

18 patroner på et VersaFlash-system (Supelco, Bellefonte, USA), og fraktionerne indeholdende MC’er (overvåget ved HPLC) blev tørret

i vakuum

. Efter opløsning blev disse fraktioner underkastet semipræparativ HPLC. For en detaljeret beskrivelse af isolation procedurer se File S1. Microcystins RR, LB, og LF og okadainsyre blev opnået fra Axxora, LLC (San Diego, CA), og microcystins LR og YR blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Strukturopklaring

strukturerne i de isolerede MCs er bestemt af høj opløsning tandem massespektrometri [51], [52], [84], og bekræftet af en- og to-dimensionel NMR-spektroskopi. Prøver til NMR-spektroskopi blev opløst i 600 pi d

6-DMSO. NMR-spektre blev optaget ved 600 MHz (

1H frekvens) på et Bruker AV-III spektrometer under anvendelse af kryogent afkølet 5 mm TCI-tredobbelt resonans prober udstyret med en-aksede selvstændige afskærmet gradienter. DQF-COSY spektre [90] blev registreret ved hjælp af 2048 × 512 komplekse datapunkter hjælp 8 scanninger. Spektre blev refereret indirekte til tetramethylsilan via restsignalerne af d

6-DMSO (2,5 ppm for

1H). Tandem MS-data er erhvervet ved hjælp af en HPLC koblet til en it-TOF massespektrometer (Shimadzu Europe GmbH, Duisburg, Tyskland) med elektrosprayionisering i positiv mode og blev evalueret ved brug af leverandørens software LCMSSolution udgave 3.60.361 med Formula Predictor-version 1.13. Til beregning af sum formler, den monoisotopisk masse gennemsnit fra mindst tre scanninger har været brugt. Forbindelserne blev separeret på en Kinetex C

18-søjle (2,6 um, 100 x 3 mm, Phenomenex, Torrance, USA) under anvendelse af en gradient i området fra 5 til 80% CH

3CN i vand over 25 min (0,1% myresyre tilsat som modifikator). Prækursor-ioner svarende til [M + H]

+ blev isoleret i ionfælde, fragmenteres ved kollision induceret dissociation (CID) med argon som kollision gas (kollisionsenergi sat til 150%, kollision gas til 100%, og q ( Frequency) til 45,0 kHz), og separeret i TOF-analysatoren. MS /MS-scanninger blev midlet og konverteret til den mzXML format ved hjælp af sælgers software og evalueret ved brug af software mMass (beregnet fragment-ioner: M, a, b, c og z; modifikationer: H

2O, -NH

3, + CO, defineret, kombinationer; matcher med en tolerance på 0,01 Da) [91]. Kommenterede tandem HRMS og

1 H-NMR-spektre af alle isolerede forbindelser kan findes i File S2.

Cellelinier og cytotoksicitet assays Salg

Primære hepatocytter er ikke egnede til at studere microcystin toksicitet og transport , som OATP transportører er nedreguleres inden for få timer efter at placere celler i kultur [92]. Således opnåedes HeLa og RKO cellelinier fra ATCC og transficeret med ekspressionsvektorer til OATP1B1 og OATP1B3. Individuelle kloner blev isoleret ved en begrænsende fortynding, og isolerede kloner viser høje niveauer af ekspression ved PCR blev yderligere karakteriseret som beskrevet tidligere [72], [93]. Individuelle HeLa og RKO kloner blev udvalgt til yderligere undersøgelse ved demonstration af øget optagelse [

3H] -BQ123, et substrat for begge transportører. Endvidere de OATP1B3 kloner viste øget optagelse af [

3H] -CCK-8, et specifikt substrat for OATP1B3 men ikke OATP1B1, mens OATP1B1- kloner ikke viser optagelsen af ​​[

3H] -CCK-8. Derudover blev RKO og HeLa-celler stabilt transficeret med en tom ekspressionsvektor anvendt som kontroller. For cytotoksicitet assays blev cellerne udpladet in triplo i 96-brønds mikrotiterplader i et medium indeholdende 5% føtalt bovint serum ved densiteter på 1000 celler /brønd. Efter 24 timer blev medium indeholdende MC strukturelle varianter tilsat til cellerne. Efter yderligere 3 dage blev celleoverlevelse bestemt med et sulforhodamin-baseret assay som vi tidligere har beskrevet [93] – [95]. Som dosisresponskurverne for apoptose forårsager microcystins er stejle og gå ned til 0 inden for 72 timer, sulforhodamin assayet er indikativ for celledød [72], [93]. IC

50 blev beregnet ud fra dosisresponskurven som koncentrationen af ​​lægemiddel, der frembragte en 50% fald i den gennemsnitlige absorbans sammenlignet med de ubehandlede brønde og rapporteres som gennemsnittet af mindst tre uafhængige bestemmelser udført tredobbelt under anvendelse af Prism software .

Støtte Information

File S1.

Detaljer om Isolering af Microcystin Beslægtede

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091476.s001

(PDF)

File S2.

annoteret tandem HRMS og

1 H-NMR-spektre af alle isolerede forbindelser. Raw NMR og MS-data på disse forbindelser er gratis tilgængelige via internettet på https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.880755.

doi:10.1371/journal.pone.0091476.s002

(PDF)

Acknowledgments

TN og MSH tak Cyano Biotech GmbH for støtte og tilladelse til at offentliggøre dette manuskript. Vi takker R. Lethaus-Weiß for hendes hjælp i at dyrke de cyanobakterier stammer og udvinding af biomassen, og P. Schmieder og B. Schlegel (FMP Berlin-Buch) til optagelse af NMR-spektre.