PLoS ONE: Flavonoid Ampelopsin hæmmer væksten og metastaser af prostatakræft in vitro og i Mice

Abstrakt

Formålet med denne undersøgelse var at evaluere kemoforebyggende effekt af en roman flavonoid, ampelopsin (AMP) på vækst og metastase af prostatacancerceller. AMP viste mere kraftig aktivitet til inhibering af proliferationen af ​​androgen-sensitive LNCaP og i mindre grad, androgen-uafhængige PC-3 human prostatacancer-cellelinier in vitro, primært ved induktion af apoptose i forbindelse med nedregulering af bcl-2. På den anden side viste AMP meget mindre aktivitet til inhibering af proliferation af normale prostata-epitelceller end af prostatacancer-cellelinier. AMP inhiberede også migration og invasion af PC-3-celler in vitro er forbundet med nedregulering af CXCR4 ekspression. I dyret undersøgelse under anvendelse af en ortotopisk prostata tumor model, AMP (150 og 300 mg /kg legemsvægt) hæmmede væksten af ​​PC-3 tumorer og lymfeknude og lungemetastaser på en dosis-afhængig måde. Sammenlignet med kontrolmusene, mus behandlet med AMP ved 300 mg /kg BW havde reduceret endelig tumorvægt med 49,2% (P 0,05), lymfeknudemetastaser med 54,5% (P = 0,3) og lungemetastaser med 93% (P 0,05), men havde tilsyneladende ingen ændring på fødeindtagelse eller kropsvægt. De in vivo anti-vækst og anti-metastase aktiviteter AMP var forbundet med induktion af apoptose og hæmning af spredning af prostata cancer celler, reduktion af prostata tumor angiogenese, og reduktion af CXCR4 udtryk. Vores resultater giver dokumentation til at berettige yderligere undersøgelser for at udvikle AMP som en ny effektiv og sikker kandidat middel mod progression og metastase af prostatakræft

Henvisning:. Ni F, Gong Y, Li L, Abdolmaleky HM, Zhou JR (2012) Flavonoid Ampelopsin hæmmer væksten og metastaser af prostatakræft in vitro og i mus. PLoS ONE 7 (6): e38802. doi: 10,1371 /journal.pone.0038802

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: December 27, 2011; Accepteret: 10 maj 2012; Udgivet: 5 juni 2012

Copyright: © 2012 Ni et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Fonden for kinesiske sundhedsministerium United Fujian Provincial Sundhed og uddannelse (WKJ2008-2-60), Foundation of Fujian Provincial Department of Science Teknologi (2011Y0015) og videnskabelig forskning Foundation of Udnyttelse på Industrial Technology i Fujian Development and Reform Kommissionen (2008-762) til FN, og Department of Defense (PC073988) og NCI /NIH (R21 CA133865) til JRZ. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af menuscript

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

prostatakræft er den mest almindelige invasive malignitet og den anden førende årsag til kræft død hos mænd i USA det anslås, at 241,740 nye tilfælde af prostatakræft vil blive diagnosticeret og omkring 28.170 mænd ville dø af prostatakræft i USA i 2012 [1]. Aktuelle terapeutiske modaliteter for prostatakræft normalt har variabel effektivitet, udvikle metastaser og narkotika-modstand, og har høj toksicitet over for normale væv. Derfor søger efter effektive regimer med moderate bivirkninger for kemoforebyggende indgriben af ​​prostatakræft er fortsat den højeste prioritet i prostatakræft forskning.

Bioaktive komponenter i botaniske og naturlægemidler medicin kan give effektive og sikre kandidater til kemoforebyggelse og /eller terapi af cancer. Klassiske kinesiske medicinske tekster indeholder omfattende empiriske registreringer af botaniske behandlinger anvendes til behandling af patienter med kræft og kræftrelaterede systemer. Men de fleste af disse kandidat botaniske formler anbefales kun baseret på kliniske observationer. Desuden var disse kliniske observationer næsten altid fra ukontrollerede, observationsstudier eller anekdotiske case rapporter. Indtil for ganske nylig har der været begrænset indsats for at udvikle prækliniske, mekanistisk, videnskabelige vurdering af botaniske plantelægemidler som en forudsætning for humane kliniske undersøgelser.

Den kinesiske urt

Ampelopsis grossedentata

er vidt udbredt i sydlige Kina og anvendes til behandling af forkølelse og ringorm. Den indeholder en rig ressource af fytokemikalier med ampelopsin (AMP, (2R, 3R) -3,5,7-trihydroxy-2- (3,4,5-trihydroxyphenyl) -2,3-dihydrochromen-4-on) de store flavonoid. AMP kaldes også dihydromyricetin og har en lignende struktur som myricetin (3,5,7-trihydroxy-2- (3,4,5-trihydroxyphenyl) -4-chromenone), et naturligt forekommende flavonoid fundet i druer, bær, frugt, grøntsager, urter og andre planter med visse anti-cancer aktiviteter. Da størstedelen bioaktive bestanddel af

Ampelopsis grossedentata,

AMP viste sig at være hovedansvarlige for de rapporterede biologiske aktiviteter, herunder hypoglykæmisk [2], anti-oxidative [3], [4] og leverbeskyttende [4], [5] aktiviteter. AMP også øget kemokinese og kemotaksisplader virkninger af neutrofile granulocytter og monocytter [6].

AMP blev vist at have visse anti-cancer aktiviteterne. AMP hæmmede væksten [7] og invasion af melanomceller in vitro [8], [9], og inhiberede metastase af melanom tumor in vivo [8], [9]. AMP hæmmede væksten af ​​lungetumorer in vivo ved at hæmme proliferation [10]. AMP havde anti-angiogenese aktivitet ved at inhibere sekretion af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) fra humane hepatocellulære carcinomceller in vitro og inhiberede også væksten af ​​humane hepatocellulært carcinom i mus [11]. AMP vendes også multilægemiddelresistens i leukæmiceller in vitro delvis via formindskelse af ekspressionen af ​​p-glycoprotein [12]. På den anden side har den virkning, AMP på væksten og udviklingen af ​​prostatakræft ikke undersøgt.

Formålet med denne undersøgelse var at systematisk evaluering AMP som en potentiel kemoforebyggende og terapeutisk kandidat mod prostatakræft progression af ved anvendelse af både in vitro og in vivo systemer, og at belyse de underliggende cellulære og molekylære mekanismer i AMP aktioner. Vores resultater er eksperimentelle beviser til støtte den fremtidige udvikling af AMP som en effektiv og sikker kandidat middel til forebyggelse og /eller behandling af prostatakræft.

Resultater

Virkninger af AMP, total flavonoid ekstrakt (TFE) og myricetin på proliferationen af ​​prostatakræft-cellelinier og normale prostataceller epithelceller (Prec) in vitro

Vi sammenlignede første aktiviteten blandt AMP, TFE og myricetin til inhibering af proliferation af prostata cancer-cellelinjer og Prec. AMP renhed analyse ved højydelsesvæskechromatografi (HPLC) viste, at AMP renhed var ca. 95%, og den repræsentative HPLC-kromatogram blev vist i fig. S1. TFE-koncentrationer blev beregnet baseret på dens AMP plan og dermed forskellen i aktivitet mellem TFE og AMP tilskrives andre fytokemikalier i TFE. Som vist i fig. 1 (A, B, C), AMP og TFE viste lignende aktiviteter til inhibering af proliferationen af ​​prostatacancerceller eller normale prostataceller, hvilket antyder, at AMP er den største bioaktive flavonoid i TFE. AMP eller TFE inhiberede proliferationen af ​​LNCaP-cellelinie ved IC

50’erne omkring 25 um (fig. 1A), og af PC-3-cellelinjen på IC

50’erne omkring 60 uM (fig. 1B). På den anden side, AMP eller TFE udviste meget mindre aktivitet til inhibering af proliferation af normale prostata epitelceller end af prostatacancer cellelinjer (fig. 1C), hvilket antyder, at AMP eller TFE kan have moderat /minimal bivirkning.

A: de dosisafhængige virkninger af AMP, TFE og myricetin om spredning af androgen-følsomme LNCaP-cellelinje; B: De dosisafhængige virkninger af AMP, TFE og myricetin på proliferationen af ​​androgen-uafhængig PC-3-cellelinjen; C: De dosisafhængige virkninger af AMP, TFE og myricetin om spredning af Prec. Værdier er middelværdier ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg, der hver tredobbelt.

On derimod myricetin viste mere kraftig aktivitet til inhibering af proliferation af Prec end LNCaP eller PC-3. Selvom myricetin inhiberede væksten af ​​prostatakræft-cellelinier på IC

50s 60 pM (. Figur 1a, 1b), det hæmmede væksten Prec celler ved IC

50 omkring 35 um (Fig 1C). På grund af den potente anti-cancer aktivitet og minimal bivirkning af AMP, blev det brugt til nærmere vurdering.

Effekter af AMP på cellecyklusprogression af prostatakræft-cellelinier in vitro

AMP på 25 og 50 pM signifikant øget den del af LNCaP-celler ved S-fasen fra 20% til 28% (P 0,05) og 74% (P 0,001), (fig 2B.). På den anden side, AMP på 25 og 50 pM steg den del af PC-3-celler ved S-fasen fra 22% til 28% (P 0,05) og 34% (P 0,05), henholdsvis (. Figur 2E), og ved G2 /M faser fra 17% til 23% (p 0,05) og 24% (p 0,05), (fig 2F.)

A, B, og C:. Den dosisafhængige virkning AMP om fordelingen af ​​LNCaP-celler ved G1 (A), S (B) og G2 /M (C) faser; D, E, og F: Den dosisafhængige virkning af AMP på fordelingen af ​​PC-3-celler ved G1 (D), S (E) og G2 /M (F) faser. Værdier er gennemsnit ± SEM af tre uafhængige forsøg, der hver i dubletter. I panelet, værdien med et bogstav er signifikant forskellig fra kontrollen, en, s 0,05; b p 0,01; c, p. 0,001

Flere cellecyklus relaterede biomarkører, såsom celledeling cyklus 2 (CDC2), Cdc25C, cyklin B1 og cyklin-afhængige kinase 2 (CDK2), blev bestemt ved Western blot analyse. AMP betydeligt nedreguleret CDK2 proteinniveau i LNCaP-celler (fig. 3B, 3C) og Cdc2 proteinniveauet i PC-3-celler (fig. 3E, 3F), men ikke andre cellecyklus relaterede biomarkører.

A og D : den dosisafhængige virkning af AMP på andelen af ​​DNA fragmentation (sub-G

0), en markør af apoptose, i LNCaP (a) og PC-3 (D) cellelinier; B og E: De repræsentative Western blot-billeder, der viser virkningerne af AMP på proteinniveauer af cellecyklusprogression og apoptose relaterede biomarkører i LNCaP (B) og PC-3 (E) cellelinier; C og F: Kvantificering af signifikant ændrede proteinniveauer i LNCaP (C) og PC-3 (F) cellelinier ved densitometri efter normalisering til p-actin. Billederne til kvantificering var fra mindst to uafhængige forsøg. Værdier er gennemsnit ± SEM af tre uafhængige forsøg, der hver i dubletter. I panelet, værdien med et bogstav er signifikant forskellig fra kontrollen, en, s 0,05; b p 0,01; c, p. 0,001

Effekter af AMP på apoptose induktion af prostata cancer cellelinjer in vitro

AMP også signifikant forøget prostatakræft celle DNA-fragmentering, et adelsmærke for apoptose. AMP ved 25 og 50 uM signifikant induceret DNA-fragmentering af LNCaP-celler med 15-fold (P 0,001) og 70-fold (P 0,001) henholdsvis (. Figur 3A), og PC-3-celler med 86% (P 0,05 ) og 270% (P . 0,001) (fig 3D), sammenlignet med de tilsvarende kontroller. LNCaP-celler blev yderligere behandlet med AMP på 25 og 50 pM og apoptose relaterede molekylære biomarkører blev bestemt ved Western blot analyse. AMP induceret apoptose af LNCaP og PC-3-celler i forbindelse med nedregulering af Bcl-2 (fig. 3B, 3C, 3E, 3F).

apoptoseinduktion effekt af AMP på PC-3-cellelinjen blev yderligere bekræftet under anvendelse af Annexin V-PI flowcytometriassayet. AMP viste dosis- og tidsafhængige virkninger på at inducere PC-3-celle apoptose (fig. S2).

Effekter af AMP om migration og invasion af PC-3 celler og nedregulering af CXCR4 proteinniveau in vitro

PC-3-cellelinjen blev anvendt til at vurdere virkningen af ​​AMP på prostatacancer cellemigration og invasion. AMP ved 25 og 50 uM signifikant inhiberede PC-3 cellemigration med 26% (P 0,05) og 63% (P 0,01), (fig 4A.), Og invasion med 27% (P 0,05) og 45% (P 0,01), (fig 4B.). Den inhiberende virkning af AMP på PC-3 cellemigration og invasion var forbundet med nedregulering af CXCR4 proteinniveau (fig. 4C, 4D), en vigtig biomarkør for cancercelleinvasion og metastase. Under den eksperimentelle betingelse (16-hr behandling), havde AMP ikke forårsage PC-3 cellecytotoksicitet, som målt ved trypan blue-assay (fig. S3). Det tyder på, at de observerede anti-migration og anti-invasion aktiviteter AMP er ikke sekundært på grund af sin cytotixicity

A:. Den dosisafhængige effekt af AMP om migration af PC-3 celler; B: Den dosisafhængige virkning af AMP på invasion af PC-3-celler; C: Den dosisafhængige virkning af AMP på CXCR4 proteinniveauer i PC-3-celler; D: Kvantificering af CXCR4 proteinniveauer i PC-3-celler ved densitometri efter normalisering til p-actin. Værdier er gennemsnit ± SEM af tre uafhængige forsøg, der hver i to eksemplarer. I panelet, værdien med et bogstav er signifikant forskellig fra kontrollen, en, s 0,05; b p 0,01; c, p. 0,001

Effekter af AMP på væksten og metastaser af androgen-uafhængige PC-3 prostata tumorer og modulering af tumorcelleproliferation, apoptose og CXCR4 udtryk og tumor angiogenese i mus

En ortotopisk PC-3 tumor dyremodel blev anvendt til at vurdere virkningen af ​​AMP på forebyggelse af væksten og metastaser af prostata tumor. AMP hæmmede både tumorvækst og metastase in vivo i en dosis-afhængig måde. AMP ved 150 og 300 mg /kg BW reducerede den endelige tumorvægt med 28% (P 0,05) og 52% (P 0,05) henholdsvis (. Figur 5A), inhiberede lymfeknuder metastaser med 27% (P 0,05) og 43% (P 0,05) og 86% (P 0,05) (fig 5C.). De repræsentative billeder af lungemetastaser er vist i fig. S4. På den anden side, havde AMP behandlinger ikke signifikant total fødeindtagelse (fig. 5D) eller endelig kropsvægt (fig. 5E).

Værdier er gruppen middel ± SEM (n = 8 /gruppe). I panelet, værdien med et bogstav er signifikant forskellig fra kontrollen, en, s. 0,05

Analyser af cellulære markører viste, at AMP behandling signifikant induceret prostatacancer-apoptose med 200% (. figur 6A, P 0,001), reduceret prostatacancer celleproliferation med 60% (fig 6B, P. 0,001) hæmmede prostata tumor angiogenese med 58% (. figur 6C, P 0,05). Disse resultater bekræftede, at AMP hæmmede væksten af ​​prostatatumorer ved at inducere apoptose, hvilket reducerer proliferation og inhibering prostata tumor angiogenese in vivo. De repræsentative billeder af cellulære biomarkører er vist i fig. S5. AMP behandling også reduceret CXCR4 proteinekspression med 30% i prostata tumorer (Fig 6D, P. 0,05).

Værdier er gruppe middel ± SEM (n = 8 /gruppe). I panelet, værdien med et bogstav er signifikant forskellig fra kontrollen, en, s 0,05; c, p. 0,001

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at AMP hæmmede markant spredning af prostata cancer cellelinjer via apoptose induktion forbundet med nedregulering af Bcl2 udtryk, og undertrykt prostatacancer cellemigration og invasion forbundet med nedregulering af CXCR4-ekspression in vitro. Dyret Undersøgelsen bekræftede endvidere, at AMP reducerede signifikant endelige tumorvægt forbundet med induktion af prostatacancer celle apoptose, inhibering prostatacancer celleproliferation og reducere prostata tumor angiogenese, og betydeligt inhiberet lungemetastaser. På den anden side, har AMP ved effektive doser ikke signifikant negativ effekt på fødeindtagelse eller kropsvægt. Dette er den første undersøgelse, der efter vor bedste viden, som viste den inhiberende virkning af AMP på væksten og metastase af prostatacancer in vitro og i en klinisk relevant ortotopisk tumormodel.

cellulære mekanisme undersøgelser viste, at AMP inhiberede proliferationen af ​​prostatacancerceller. Interessant, AMP anholdt LNCaP celler ved S-fasen (fig. 2B) delvist via nedregulering af CDK2 (fig. 3B, 3C), en biomarkør afgørende for G1 /S overgang, mens den arresterede PC-3 celler på S og G2 /M-faser (fig. 2E, 2F) forbundet med nedregulering af Cdc2 (fig. 3E, 3F). CDC2, også kendt som CDK1 (cyclin-afhængig kinase 1), spiller en vigtig rolle under forløbet cellecyklussen. CDC2 normalt kombineres med cyclin B og regulerer S og G2 /M-fase progression. CDC2 er blevet betragtet som en væsentlig molekylært mål for design af terapeutiske anticancerlægemidler [13]. Nedregulering af Cdc2 kan tilvejebringe en vigtig molekylær mekanisme, AMP anholdelser cellecyklusprogression af PC-3-celler ved S og G2 /M-faser. Analyse af in vivo tumorprøver bekræftede også, at AMP inhiberede PC-3 tumor vækst er forbundet med inhibering af tumorcelleproliferation (fig. 6B).

Induktion af prostatacancer celle apoptose er også en vigtig mekanisme, ved hvilken AMP hæmmer væksten af ​​prostatacancer. AMP induceret apoptose af prostatacancerceller in vitro (fig. 3A, 3D) og in vivo (fig. 6A). Yderligere undersøgelser viste, at induktion af apoptose var forbundet med nedregulering af bcl-2 protein niveauer (fig. 3C, 3F). Bcl-2 er en vigtig regulator af apoptose. Angivelse af bcl-2 er hyppigere i high-grade tumorer og metastaser end i lavere kvalitet og nonnmetastatisk tumorer [14], [15]. Apoptose modstand er forbundet med højere niveauer af bcl-2 [15], [16], og nedregulering af bcl-2 sensibiliserer prostatacancerceller til at undergå apoptose [17]. Derfor nedregulering af bcl-2 kunne udgøre en vigtig molekylær mekanisme, ved hvilken AMP inducerer prostatakræft apoptose.

Angiogenese er et kritisk trin i tumorvækst [18]. Væksten af ​​alle faste tumorer afhænger angiogenese og undertrykkelse af tumor blodkar tilbyder en ny mulighed for forebyggelse og behandling af cancer [19]. Tidligere undersøgelser har vist, at AMP havde anti-angiogenese aktivitet ved at inhibere sekretion af pro-angiogene faktor VEGF og bFGF fra humane hepatocellulære carcinomceller in vitro [11]. I denne undersøgelse har vi vist, at AMP hæmmede væksten af ​​PC-3 prostate tumor associeret med inhibering af tumorangiogenese (fig. 6C). Selvom vi ikke måle VEGF og bFGF niveauer in vivo, vores resultater forudsat tankevækkende eksperimentelle beviser for, at en af ​​de mekanismer, som AMP hæmmer tumorvækst via hæmme angiogenese. Foretages yderligere undersøgelser for at bestemme de underliggende molekylære mekanismer, som AMP hæmmer tumor angiogenese.

Tidligere undersøgelser har vist, at AMP hæmmede in vitro invasionen og in vivo metastaser evne B16 melanom [8]. Det er imidlertid ikke blevet undersøgt, hvis AMP havde anti-metastase-aktivitet i prostatacancer. Vores resultater viste, at AMP havde potente aktiviteter til inhibering migration og invasion af prostata cancer celler in vitro og prostatacancer metastaser i ortotopisk prostatatumor dyremodel forbundet med nedregulering af CXCR4 ekspression. CXCR4 er involveret i adskillige sygdomme, såsom angiogenese, metaboliske og neurologiske lidelser, rheumatoid arthritis og i forskellige former for metastatisk cancer. CXCR4 er en kritisk faktor i invasivitet og proliferation af brystcancerceller [20], [21], [22] og spiller en central rolle for væksten af ​​maligne neuronal og glia tumorer [23]. CXCR4-hæmmere er foreslået til behandling af forskellige former for metastatisk cancer [24], [25], [26]. AMP er vist at være et lille molekyle CXCR4-antagonist [27], [28]. Selvom vi ikke undersøge om CXCR4 var en direkte molekylært mål for AMP, vore undersøgelser antyder, at en af ​​de molekylære mekanismer, som AMP hæmmer prostatacancer metastaser kan være via nedregulering af CXCR4 ekspression og funktion. Yderligere undersøgelser i forbindelse med anvendelsen AMP og /eller dets derivater som nye anti-metastase midler til at forsinke og /eller forebyggelse af cancer metastaser kan have betydelige konsekvenser for forebyggelse og behandling af kræft.

Som konklusion, at resultaterne fra denne undersøgelse forudsat kritisk vigtigt eksperimentelle beviser for, at AMP kan være en roman effektiv og sikker kandidat middel til at hæmme væksten og metastaser af prostatakræft.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle procedurer med dyr blev revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Beth Israel Deaconess Medical center med vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

TFE, AMP og myricetin

En navnebeskyttet udvinding procedure blev anvendt til at udtrække TFE fra

Ampelopsis grossedentata

med AMP-indhold på ca. 80%. AMP blev oprenset fra TFE ved præparativ HPLC; og renheden blev bekræftet ved analytisk revers fase-HPLC. Myricetin blev indkøbt fra LKT Laboratories (St. Paul, MN). HPLC-analyse blev anvendt til at kontrollere kvaliteten af ​​materialerne. Alle materialer blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) for studier af cellekulturer.

Kultur af prostatacancerceller, normale prostata-epitelceller og endotelceller

To humane prostatacancer-cellelinier, androgen-sensitive LNCaP og androgen-uafhængige PC-3 (American Type Culture Collection, Bethesda, MD) blev anvendt til in vitro forsøg. Human prostatacancer-cellelinier blev opretholdt som monolagskulturer i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 pmol L-glutamin /ml, 100 U penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml i en 95% luft, 5% CO

2, og vandmættet atmosfære. Prec celler blev indkøbt fra Lonza (Walkersville, MD) og dyrket i PrEGM plus EGM-2 singlequotes (Lonza, Walkersville, MD) i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2.

cellevækst

virkningen af ​​AMP, TFE og myricetin på cytotoksiciteten af ​​prostatacancerceller eller Prec blev bestemt under anvendelse af celle Titer 96 Aqueous celleproliferationsassay (Promega, Madison, WI), som vi tidligere beskrevet [29] . Assayet bestemmer antallet af levedygtige celler i proliferation, cytotoksicitet og kemosensitivitet. Alle assays blev uafhængigt gentages mindst tre gange, hver i tre eksemplarer, og resultater blev bekræftet ved direkte celletælling under anvendelse af et hæmocytometer.

Analyse af prostatacancer cellecyklusprogression og DNA-fragmentering

Virkningen af AMP behandling på cellecyklusfordeling af prostatacancer-cellelinier blev bestemt ved flowcytometri følge de beskrevne procedurer [30]. Celler behandlet med forskellige koncentrationer af AMP blev høstet, farvet med propidiumiodid (ved en slutkoncentration på 50 ug /ml) og RNase (ved en slutkoncentration på 50 ug /ml) og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Farvede celler blev derefter analyseret ved FACScan (Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, Mountview, CA) i cellecyklusfordeling og fragmenteret DNA. Forsøgene blev uafhængigt gentages mindst tre gange, hver i to eksemplarer.

Annexin V og PI farvning for apoptose detektion

Virkningen af ​​AMP på apoptose af PC-3-celler blev yderligere bestemt ved Annexin V-PI apoptose afsløring kit (Chemicon International Inc., Billerica, MA) efter instruktion af kit. Kort fortalt blev behandlet PC-3-celler resuspenderet i Annexin V-opløsning og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter, PI blev derefter tilsat i yderligere 5-minutters inkubation i mørke. Apoptotiske celler blev analyseret ved flowcytometri (Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, Mountview, CA). Forsøgene blev uafhængigt udført mindst to gange, hver i dubletter.

Analyser

Kræft celle migration og invasion

En suspension af PC3 celler (6000 celler for migration og 30000 celler for invasion) i 250 uL serumfrit DMEM med AMP eller vehikel (DMSO) blev fyldt i en fibronectin-coatet indsats til migration assay eller et Matrigelcoatede indsats til invasion assay (BIOCOAT, plade med 24 brønde, 8 um, Becton Dickinson). Hver kultur insert blev sat ind i en brønd indeholdende 750 uL DMEM med 5% FBS. Efter inkubation i 16 timer ved 37 ° C blev celler på toppen af ​​inserter fjernes forsigtigt med en vatpind, og cellerne på undersiden af ​​indsatsen membranen blev farvet med Diff-Quick Stain løsninger (Dade Behring Inc., Newark, dE) og billederne blev indfanget. Celler blev talt under et mikroskop. Alle analyser blev uafhængigt udført mindst tre gange, hver i tre eksemplarer.

For at bekræfte, at den anti-migration og anti-invasion aktiviteter AMP var ikke sekundært på grund af sin cytotoksicitet til PC-3 celler, PC-3 celler blev behandlet med AMP (0, 25, og 50 uM) i 16 timer, og celletallet blev målt ved trypan-blå-udelukkelse assay. Eksperimentet blev uafhængigt udført mindst tre gange, hver i to eksemplarer.

Western blot-analyse

I undersøgelsen in vitro, celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af AMP blev cellelysater fremstillet og protein niveauer blev bestemt ved Western blot-analyse ved at følge fremgangsmåderne vi beskrev tidligere [31]. De primære antistoffer anvendt i Western blot mod humane antigener var som følger: cyclin B1 (1:200), cdc2 (1:500) og Bax (1:500) (Oncogene Research Products, Boston, MA), bcl-2 (1 :100), p21 (1:200) og p53 (1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), CDK2 (1:1,000) (Selleck Chemicals, Houston, TX), CXCR4 (1:200) ( R (Ii) AMP ved 150 mg /kg legemsvægt (BW); og (iii) AMP ved 300 mg /kg BW. Hver mus blev derefter implanteret orthotopisk med PC-3-celler (2 x 10

6 celler /50 pi) og fortsatte på de tilsvarende behandlinger under hele forsøget. Fødeindtagelse og kropsvægt blev målt ugentligt. Ved slutningen af ​​forsøget (8 uger efter PC-3 cell implantation) blev musene aflivet; primære tumorer blev udskåret og vejet. En tumor skive fra hver primær tumor væv blev omhyggeligt dissekeret og fikseret i 10% buffer-neutraliseret formalin, paraffin-indlejret, og snit på 4 um tykkelse for immunhistokemi. Alle procedurer med dyr blev revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Beth Israel Deaconess Medical Center med vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr [32]. Dyret Undersøgelsen blev gentaget.

In situ påvisning af apoptotiske indeks Salg

apoptotiske celler blev bestemt ved en terminal deoxynukleotidyltransferase-medieret deoxyuridintriphosphat-biotin nick endemærkning (TUNEL) assay (Chemicon International Inc. , Billerica, MA) efter vores beskrevne protokoller [30], [33], [34]. Seks repræsentative områder af hver sektion uden nekrose blev udvalgt og begge apoptotiske celler og totale kerner celler blev talt under et lysmikroskop ved 400 x forstørrelse. Den apoptotiske indeks blev udtrykt som procentdelen af ​​positive apoptotiske tumorceller til totale tumorceller, og virkningen af ​​behandling på apoptose blev udtrykt som procentdelen med kontrollen.

Immunhistokemisk bestemmelse af tumorcelleproliferation

proliferationsindeks blev evalueret ved at beregne andelen af ​​celler med Ki-67-farvning efter procedurerne i laboratoriet [31]. Både Ki-67-positive prolifererende celler og totale tumorceller blev talt i seks ikke-nekrotiske områder af hver sektion ved hjælp af lysmikroskop ved 400 x forstørrelse. Proliferationsindekset blev beregnet som procentdelen af ​​Ki-67-positive tumorceller til totale tumorceller, og virkningen af ​​behandling på proliferation blev udtrykt som procentdelen med kontrollen.

Immunhistokemisk påvisning af mikrokardannelse densitet (MVD )

MVD blev anvendt som en markør for tumorangiogenese og kvantificeres ved immunhistokemisk farvning af faktor VIII efter vores tidligere beskrevne fremgangsmåde [30], [33], [34]. MVD blev beregnet ved at tælle mikrokar på 200 × felter under lysmikroskopi på seks repræsentative steder uden nekrose af hvert afsnit, og effekten af ​​behandling på angiogenese blev udtrykt som procentdelen til kontrollen.

Statistisk analyse

Resultater blev udtrykt som gruppe betyder ± SEM og analyseret for statistisk signifikans ved variansanalyse [35] efterfulgt af Fishers protected least-signifikant forskel baseret på to-side sammenligninger mellem forsøgsgrupper vha Statview 5.0 program (SAS Institute, Inc. , Cary, NC). En

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Støtte oplysninger

figur S1..

repræsentative kromatogram, som viser renheden af ​​AMP ved analytisk omvendt fase-HPLC. HPLC forsøgsbetingelser var: Instrument: Waters 2695 med autosampler og foto diode array (PDA) detektor; HPLC-søjle: Phenomenox C-18 (5 um i indre diameter, 10 × 250 mm); Mobile faser: A (H

2O med 0,1% eddikesyre) og B (acetonitril); Gradient stand: 0-30 min, 5% B til 35% B; 30-35 min, 35% B til 95% B; 35-40 min, 95% B til 5% B; 40-45 min, 5% B; Flow rate:. 1 ml /min

doi: 10,1371 /journal.pone.0038802.s001

(TIF)

Figur S2.

repræsentant FACS histogrammer viser den tidsafhængige virkning af AMP behandlinger (0, 20 og 50 uM) på apoptose af PC-3-celler, som målt ved Annexin-PI flowcytometriassayet.

doi: 10,1371 /journal.pone.0038802.s002

(TIF)

Figur S3.

Virkningen af ​​AMP på PC-3 cellecytotoksicitet, som målt ved trypan-blå-udelukkelse assay. Cellerne blev behandlet med AMP ved forskellige koncentrationer i 16 timer, på samme tid anvendes til migration og invasion-assays. Værdier er gennemsnit ± SEM af tre uafhængige forsøg, der hver i dubletter. Værdierne er statistisk insignifikant blandt grupper

doi:. 10,1371 /journal.pone.0038802.s003

(TIF)

Figur S4.