Abstrakt
Baggrund
Ciglitazon tilhører thiazolidindioner klasse af antidiabetika familie og er en høj-affinitetsligand for peroxisomproliferatoraktiveret receptor γ (PPARy). Bortset fra sin antidiabetisk aktivitet, dette molekyle viser antineoplastisk effekt i mange kræftceller.
Metode /vigtigste resultater
Brug RT4 (afledt fra en brønd differentieret klasse I papillær tumor) og T24 (afledt fra en udifferentieret grad III carcinom) blære cancerceller, undersøgte vi potentialet i ciglitazon at inducere apoptotisk celledød og karakteriseret de molekylære mekanismer, der er involveret. I RT4 celler, stoffet inducerede G2 /M cellecyklusstop karakteriseret ved en overekspression af p53, p21
WAF1 /CIP1 og p27
Kip1 i samtidigheden med et fald på cyklin B1. Tværtimod i T24 celler, det udløste apoptose
via
ydre og indre veje. Cellecyklusstandsning og induktion af apoptose forekom ved høje koncentrationer gennem PPARy aktivering-uafhængige veje. Vi viser, at
in vivo
behandling af nøgne mus ved ciglitazon hæmmer højkvalitets blærekræft xenograft udvikling. Vi identificerede en roman mekanisme, hvormed ciglitazon dræber kræftceller. Ciglitazon opreguleret opløselige og membranbundne TRAIL og lad TRAIL-resistente T24 celler til at reagere på sti gennem caspase aktivering, død receptor signalvejen og Bid spaltning. Vi fremlagde beviser, at TRAIL-induceret apoptose er delvist drevet af ciglitazon-medieret nedregulering af c-FLIP og survivin protein niveauer gennem en proteasom-afhængig nedbrydning mekanisme.
Konklusioner /Betydning
Derfor , ciglitazon kunne være klinisk relevant som kemoforebyggende eller terapeutisk middel til behandling af TRAIL-refraktær høj kvalitet urothelial kræftformer
Henvisning:. Plissonnier ML, Fauconnet S, Bittard H, Lascombe i (2011) det antidiabetiske lægemiddel ciglitazon inducerer High Grade Blære Cancer Cells Apoptose gennem opregulering af TRAIL. PLoS ONE 6 (12): e28354. doi: 10,1371 /journal.pone.0028354
Redaktør: Laszlo Buday, Ungarsk videnskabsakademi, Ungarn
Modtaget: August 16, 2011; Accepteret: November 7, 2011; Udgivet: 12. december, 2011
Copyright: © 2011 Plissonnier et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité du Doubs). M.L. Plissonnier blev støttet af et stipendium fra Cancéropôle du Grand-Est. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
urotelial karcinom i blæren udgør -5% af alle kræftdødsfald i mennesker. De fleste af blæretumorer (75%) er ikke muskel-invasiv ved diagnose og efter lokal kirurgisk terapi, har en høj risiko for tilbagefald og en tilbøjelighed til at gøre fremskridt i lønklasse eller fase [1]. Muskel invasive tumorer (25%) har en dårligere prognose [2] siden 50% af patienterne vil få tilbagefald med metastatisk sygdom inden for 2 års behandling. På trods af de fremskridt med kirurgi og intravesikal immun- og kemoterapi i behandlingen af patienter og selvom nye kemoterapeutiske stoffer (tyrosinkinaseinhibitorer, anti-angiogene midler …) anvendes, er blevet observeret nogen forbedring i overlevelse. Således udvikling af nye effektive kemoterapeutiske regimer med færre bivirkninger er absolut nødvendig for at mindske sygelighed og dødelighed urothelial karcinom.
Thiazolidinedionerne (TZD), herunder rosiglitazon, troglitazon, pioglitazon og ciglitazon er en klasse af insulin- sensibiliserende stoffer. Desuden, rosiglitazon og pioglitazon for tiden i klinisk anvendelse til behandling af type II-diabetes for millioner af patienter. Disse TZD er høj affinitet kemisk syntetiserede ligander af peroxisomproliferatoraktiveret receptor γ (PPARy) [3], [4]. PPARy er et ligand-aktiverede transkriptionsfaktor af den nukleare hormonreceptor superfamilien. Ud over dets kendte rolle i regulering af metabolisme og inflammation, er PPARy også været impliceret i carcinogenese baseret på undersøgelser, der viser dets evne til at modulere cellulær differentiering, proliferation og apoptose. Bortset fra deres antidiabetisk aktivitet, TZD fremkalde væksthæmmende effekter
in vitro
på kræftceller af forskellige væv oprindelse og
in vivo
[5]. Kun få undersøgelser viser, at pioglitazon eller troglitazon vist antiproliferative eller pro-apoptotiske aktiviteter mod blærekræft cellelinjer [6] – [9] og i rotte urothelium [10]. Kun én undersøgelse rapporterede, at ciglitazon udstillet hæmmende effekt på celle nummer i en serie af cellelinier modellering metastatisk overgangsordning celle karcinom i blæren (TSU-Pr1, TSU-Pr1-B1 og TSU-Pr1-B2) [6].
Apoptose forekommer
via Salg to separate endnu indbyrdes sammenhængende signaling mekanismer: den ydre dødsreceptor-induceret pathway aktiveret af proapoptotiske receptor signaler ved celleoverfladen, og den iboende mitokondrier-medieret vej aktiveres af mitokondrielle signaler inde fra celle [11]. De vigtigste mediatorer af apoptose er caspaser, en familie af cysteinproteaser, der spalter et kritisk sæt af cellulære proteiner nær specifikke asparaginsyrerester.
Blandt potentielle effektive anticancerbehandlinger, TRAIL (TNFa-relateret apoptoseinducerende ligand) er en lovende antineoplastisk middel, fordi det fremkalder apoptose i kræftceller med kun ubetydelig indvirkning på normale celler [12]. TRAIL udløser caspasekaskaden
via
ydre apoptosecyklus gennem interaktion med TRAIL-reagerende død receptorer (DR), såsom DR4 og DR5, hvilket fører til dannelsen af død-fremkaldende signalering kompleks (DISC), rekruttering og hurtig aktivering af caspase 8. i type i celler, TRAIL-R-induceret caspase-8-aktivering resulterer direkte i nedstrøms caspaseaktivering og apoptose, hvorimod II-celler i type caspase-8-aktivering er ineffektiv, og signalet skal forstærkes gennem caspase- 8-spaltning af pro-apoptotisk Bid protein og aktiveringen af mitokondriske apoptosecyklus [13] gennem caspase 9-aktivering. Begge caspaser 8 og 9 aktiverer bøddelen caspase 3, som er den primære aktivator af apoptotisk DNA-fragmentering og fører til cancer celle apoptose [14].
Survivin og cellulær FLICE-inhiberende protein (c-FLIP) er nedstrøms og opstrøms anti-apoptotiske regulatorer af den apoptotiske signaleringskaskade, henholdsvis.
Ligesom andre inhibitorer af apoptose (IAP), survivin virker nedstrøms for mitokondrier at forhindre behandling eller aktivering af initiator caspase-9, hvilket fører til inhibering af aktivitet af effektor-caspaser. Imidlertid er den rolle, survivin ikke begrænset til apoptose hæmning, men involverer også reguleringen af celledeling [15]. C-FLIP er det vigtigste protein, der forhindrer caspase 8 fra aktivering med dødsreceptorer gennem binding til Fas-associeret dødsdomæne og caspase 8 ved DISC. Selvom flere splejsning isoformer af c-FLIP mRNA er blevet beskrevet, kun to af dem, c-FLIP
S og c-flip
L, er blevet betydeligt studeret på proteinniveau. Begge proteiner kan rekrutteres til døden-inducerende signalering kompleks og inhiberer døden receptor-medieret apoptose [16]. Både c-flip
L og c-flip
S er hurtig omsætning proteiner; dermed deres niveauer er underlagt regulering af ubiquitin /proteasom-medieret nedbrydning [17], [18].
Resultater fra prækliniske undersøgelser med rekombinant TRAIL har vist sine væsentlige anti-tumor aktiviteter, hvilket indikerer potentialet i at udnytte TRAIL som et anticancermiddel [19]. Trods denne proapoptotiske rolle TRAIL i de transformerede celler, mange cancerceller udvikle resistens overfor TRAIL-induceret apoptose. Således er det blevet rapporteret, at blærekræft cellelinjer, såsom T24 og HT1376, er TRAIL-resistente [20]. Identifikation af lægemidler eller midler, der kan overvinde TRAIL modstand og sensibilisere cancerceller i retning TRAIL-induceret apoptose er således kritisk vigtigt for målretning TRAIL-resistente cancerceller. Kombinationen af TRAIL med stråling og nogle kemoterapeutiske stoffer [21], [22] har givet begrænset succes, fordi denne kombination også medført en stigning i systemisk toksicitet.
Den foreliggende undersøgelse rapporterede effekten af ciglitazon på RT4 (afledt af et godt differentieret klasse I papillær tumor) og T24 (afledt af en udifferentieret klasse III carcinom) blærekræft cellelinjer. Valget af disse især blære kræft cellelinjer er relevant, eftersom i RT4 celler, P53 er vildtype og mesenchymale markør N-cadherin udtrykkes ikke mens der registreres epitel markør E-cadherin. Omvendt i T24-celler, er P53 muteres og E-cadherin er fraværende, og erstattet med N-cadherin [23]. afhængigt af differentieret tilstand af cellerne, viste således, vi, at ciglitazon individuel behandling inducerede G2 /M-fase cellecyklusstop men udløste apoptose kun i T24 høj kvalitet blære cancerceller gennem PPARy aktivering-uafhængige mekanismer. Hertil kommer, for første gang til vores viden, behandling af nøgne mus ved ciglitazon svækker betydeligt væksten af høj kvalitet blære tumorxenoplantater bekræfter vores
in vitro
resultater. Mest interessant, at kombinationen af ciglitazon og TRAIL vist, at ciglitazon lad TRAIL-refraktære T24 celler til at reagere på TRAIL. For første gang i blære cancerceller, afslørede vi, at ciglitazon-medieret opregulering af TRAIL og et markant fald af c-FLIP og survivin medieret dels gennem en proteosomal nedbrydningsproces bidrager til ciglitazon celledød og til den sensibiliserende effekt af denne TZD på TRAIL-induceret apoptose.
Resultater
ciglitazon blokke RT4 (lav kvalitet) og T24 (høj kvalitet) celler i G2 /M-fasen, men inducerer apoptose kun T24 celler gennem caspase aktivering
for at undersøge effekten af ciglitazon på RT4 og T24 blære cancerceller apoptose blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af lægemiddel (5-60 uM) i 24 timer og vurderet for propidiumiodid farves DNA-indhold ved hjælp af flow cytometrisk analyse. Som vist i figur 1A, i RT4 celler, lægemidlet inducerede en dosisafhængig forøgelse af celler i G2 /M-fasen af cellens cyklus i association med en stigning på ekspressionsniveauet for p53, p21
Cip1 /WAF1 og p27
Kip1 og et fald på cyklin B1 proteinniveau (figur 1B). Men der var ingen signifikant forøgelse af sub-G1 population sammenlignet med ubehandlede kontrolceller (figur 1C), hvilket indikerer, at en 24 h-ciglitazon behandling ikke inducerede apoptose af disse celler selv ved en høj koncentration på 60 uM lægemiddel. Desuden havde ciglitazon fremprovokere kløvning af caspase 3 og dets substrat PARP (Figur 1D).
Celler blev behandlet i 24 timer med eller uden ciglitazon i de angivne koncentrationer. (A) Procentdelen af celler, der viser fordelingen cellecyklus. (C) Hypodiploid DNA-indholdet (sub-G1 peak). (B), (D) Efter behandling blev cellerne høstet og totale proteinekstrakter blev underkastet immunoblotting til detektering af procaspase 3, PARP, p53, p21
Cip1 /WAF1, p27
Kip1 og cyclin B1. β-actin blev anvendt som en intern loading kontrol. De viste data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter udført i triplikater.
Som observeret for RT4 celler, der var en dosisafhængig forøgelse af G2 /M brøkdel af T24 celler (data ikke vist), men i modsætning RT4 celler, analyse af kerne-DNA fordeling i T24-celler viste en dosisafhængig forøgelse af sub-G1 population med ~ 40% celledød fra 40 uM koncentration (figur 2A). At karakterisere celledød pathway udløst af ciglitazon, spaltningen af caspaser 9, 8, 3, blev bestemt ved western blotting-analyse. Fra en 40 uM koncentration af lægemiddel, en betydelig forbedret behandling af både caspase 9 og caspase 8 til deres aktive fragmenter blev detekteret (figur 2B). Caspase 3, som repræsenterer den klassiske nedstrøms udførelse enzym af caspase 8 og 9 blev spaltet til dets aktive form (20/18 kDa). Aktivering af caspase 3 blev bekræftet ved spaltning af pro-formen PARP (116 kDa) til den inaktive form (85 kDa) (figur 2B). Som vist i figur 2C, mens p53 og Bax ekspressionsniveauer var uændrede, blev Bcl-2 drastisk reduceret og Bid blev afkortet. Disse resultater indikerede, at T24-celler kunne forstærke den apoptotiske signal gennem mitokondrier og opfører sig som type II celler efter ciglitazon eksponering.
Celler blev eksponeret i 24 timer til køretøjet eller ciglitazon ved de angivne koncentrationer. (A) Procentdelen af celler, der viser hypodiploid DNA-indhold (sub-G1 peak) blev evalueret ved flowcytometrianalyse. (B), (C) Spaltningen af caspaser 9, 8, 3 og PARP samt ekspressionen af pro- og anti-apoptotiske proteiner blev bestemt ved western blotting-analyse. (D,
venstre
) Celler blev præinkuberet 1 time med 50 pM caspase 8 (Z-IETD-FMK) eller 9 (Z-LEHD-FMK) specifik inhibitor før behandling med 40 pM ciglitazon i 12 timer og vurdering af caspaser 8, 9, 3 og Bid behandling blev analyseret ved western-blotting. β-actin blev anvendt som en intern kontrol loading; (D,
højre
) Efter angivne behandlinger blev celler farvet med PI for DNA-fragmentering analyse ved flowcytometri. Data er middelværdier ± SD af 3 uafhængige eksperimenter udført i triplikater. *
P
0,05, betydelige forskelle i forhold til ubehandlede celler; **
P
. 0,05, betydelige forskelle sammenlignet med ciglitazon-behandlede celler med brug af to-sidede uparrede Students
t
test
caspase kaskade aktivering er en vigtig begivenhed for apoptotisk proces. Som forventet inkubationen med caspase 8 (Z-IETD-FMK) eller 9 (Z-LEHD-FMK) specifikke inhibitorer blokerede caspaser 8 eller 9 forarbejdning (figur 2D, venstre panel) og reducerede ciglitazon apoptose som påvist ved en signifikant fald af sub-G1 population (figur 2D, højre panel) er forbundet med en mindre caspase 3 spaltning (figur 2D, venstre panel). Disse data indikerer, at RT4 og T24-celler ikke havde en lignende reaktion til ciglitazon behandling. Faktisk var ciglitazon apoptose begrænset til T24-celler, selv om det blokerede T24 og RT4 celler ved G2 /M-fasen af cellens cyklus. Desuden er de to vigtigste apoptotiske veje, død receptoren og mitokondrie veje, synes at være aktiveret i T24-celler.
Ciglitazon ikke handle via PPARy transkriptionel aktivering
For at bestemme om PPARy transaktivering var kræves til ciglitazon-fremmet cellecyklusstop eller apoptose, blev RT4 og T24-celler behandlet i 24 timer med 40 uM lægemiddel alene eller i kombination med 80 uM af GW9662, en irreversibel potent hæmmer af PPARy. Virkningen af ciglitazon på G2 /M cellecyklusstop i RT4 celler ikke hæmmet (figur 3A, venstre panel). Som forventet forøgede ekspressionsniveauet af p27
Kip1, observeret med ciglitazon, blev ikke påvirket af GW9662 var forbundet med lægemidlet (figur 3A, højre panel). Virkningen af ciglitazon på T24 celledød (figur 3B, venstre panel) og caspase 3 spaltning (figur 3B, højre panel) blev ikke tilbageført i nærvær af PPARy-antagonist. Således GW9662 havde ingen inhibitorisk virkning, men dog var gyldig i T24-celler, det blokerede overekspression af A-FABP PPARy mål ved ciglitazon behandling (figur 3C) som tidligere rapporteret [24]. Tilsammen har dette sæt eksperimenter fast, at i T24-blære cancerceller, ciglitazon apoptose gennem PPARy aktivering-uafhængige signalveje.
RT4 og T24-celler blev behandlet i 24 timer med 40 pM af ciglitazon alene eller i kombination med 80 pM af GW9662, en irreversibel potent hæmmer af PPARy. (A,
venstre
) Akkumulering af RT4 celler i G2 /M-fasen af cellens cyklus blev analyseret ved flowcytometri analyse; (A,
højre
) Efter behandling blev helcellelysater fremstillet og 20 ug totalt proteinekstrakt blev underkastet immunoblotting til detektering af p27
Kip1. (B,
venstre
) Procentdelen af celler, der viser hypodiploid DNA-indhold (sub-G1 peak) blev evalueret ved flowcytometrianalyse; (B,
højre
) Efter behandling blev helcellelysater fremstillet og 15 ug totalt proteinekstrakt blev underkastet immunoblotting til detektering af procaspase 3. (C) Vurdering af PPARy-antagonist GW9662 effektivitet på adipocyt-Fatty acid-bindende protein (a-FABP), en kendt PPARy mål i T24-celler ved Western-blotting-analyse. β-actin blev anvendt som en intern loading kontrol. Data er middelværdier ± SD af 3 uafhængige eksperimenter udført i triplikater. *
P
. 0,05, betydelige forskelle i forhold til ubehandlede celler med brug af to-sidede uparrede Students
t
test
Ciglitazon opregulerer opløselig og membranbundne TRAIL i T24 celler
Vi undersøgte, om ciglitazon kan modulere ekspression af TRAIL i T24 og RT4 celler. Efter 40 uM ciglitazon eksponering, observerede vi en stigning på TRAIL-ligand niveau i T24 helcelleekstrakter som bedømt ved western-blotting, en stigning på membranbundet TRAIL som påvist ved flowcytometri-analyse med specifikke PE-konjugeret TRAIL-antistof, samt en stigning på TRAIL niveau i T24-celle konditionerede medier bestemt ved ELISA (figur 4A). På den anden side, ciglitazon, som ikke inducerede apoptose i RT4 celler, ikke gav anledning TRAIL i helcelleekstrakter samt på celleoverfladen og i konditioneret medium (figur 4B). Vi tror derfor, at ciglitzone kan forårsage apoptose af høj kvalitet T24 blære cancerceller ved at øge TRAIL-ekspression.
RT4 og T24-celler blev behandlet i 24 timer med ciglitazon ved 40 og /eller 60 uM. I RT4 (A) og T24 (B) celler blev helcellelysater analyseret for TRAIL-ekspression ved western-blotting-analyse. β-actin blev anvendt som en intern loading kontrol. Celler blev farvet med anti-TRAIL-PE og analyseret ved flowcytometri. Efter 40 pM ciglitazon behandling i 24 timer blev konditionerede medier opsamlet, og koncentrationen af TRAIL blev målt ved ELISA. Dataene er middel ± SD af 2 uafhængige forsøg udført i firdobbelte. *
P
0,05, betydelige forskelle i forhold til ubehandlede celler med brug af to-sidede uparrede Students
t
test. (C) Cellulære proteiner blev isoleret fra T24-celler og underkastet immunoblotting til detektering af DR4 og DR5. β-actin blev anvendt som en intern loading kontrol. (D) T24 celler blev udsat for 40 uM ciglitazon i 12 timer, farvet med anti-DR4-PE eller anti-DR5-PE og analyseret ved flowcytometri. (E) T24-celler blev præinkuberet med eller uden monoklonale antistoffer blokerer DR4 og DR5 receptorer (5 mg /ml) i 1 time og stimuleret i 12 timer med 40 pM ciglitazon eller 50 ng /ml TRAIL for RT4 celler (
insert
). Procentdelen af celler, der viser hypodiploid DNA-indhold (sub-G1 peak) blev evalueret ved flowcytometrianalyse. Data er middelværdier ± SD af 3 uafhængige eksperimenter udført i triplikater. *
P
0,05, betydelige forskelle i forhold til ubehandlede celler; **
P
. 0,05, betydelige forskelle sammenlignet med ciglitazon-behandlede celler med brug af to-sidede uparrede Students
t
test
Ciglitazon gjorde ikke påvirke DR4 og DR5 udtryk i T24 celler
i T24 celler, har vi vist en caspase 8 spaltning og forøgelsen af TRAIL ved ciglitazon. At analysere, om ciglitazon-induceret celledød er afhængig af modifikationen af dødsfald receptorekspression blev celler behandlet med 40 eller 60 uM lægemiddel i 24 timer. Vi påviste, at ciglitazon ikke ændre DR4 og DR5 ekspressionsniveauet som vurderet i helcellelysater ved western-blotting (figur 4C) samt deres celleoverfladeekspression som påvist ved flowcytometri-analyse med specifikke PE-konjugerede antistoffer (figur 4D). For at undersøge om ciglitazon-udløst apoptose var en funktion af dødsreceptor signalering amplifikation blev DR4 og DR5 stimulation blokeret af præinkubation af celler med blokerende anti-DR4 eller anti-DR5-antistoffer før lægemiddelbehandling. Inaktivering af både DR4 og DR5 nedsatte signifikant ciglitazon-fremmet apoptose (fig 4E). For at validere død receptorblokerende antistoffer effektivitet ved de anvendte koncentrationer, vi udsat TRAIL-følsomme RT4 celler til TRAIL som en positiv kontrol (fig 4E, insert). Som forventet inaktivere hver af receptorerne fuldstændig hæmmet TRAIL-induceret apoptose. Disse data viser, at ciglitazon aktiverer ydre apoptosecyklus gennem DR4 og DR5.
Ciglitazon hæmmer blære tumor xenograft udvikling i nøgne mus
For at undersøge antitumorvirkningen af ciglitazon
in vivo
(figur 5), T24 og RT4 celler såvel blev subkutant injiceret i 6 uger gamle-female athymiske nøgne mus. Når tydelige tumorer blev dannet, blev mus behandlet af køretøj eller ciglitazon (15 mg /kg) med en sats på én injektion om ugen i tre uger. Tumorvolumen blev målt to gange om ugen, indtil musene blev aflivet. Tumoren Forekomsten var 100% i alle dyr. Volumenet af tumorerne i T24-celler-transplanterede mus steg ikke i ciglitazon-behandlede dyr sammenlignet med vehikelbehandlede kontroldyr. Der var en signifikant forskel fra den tredje injektion af ciglitazon (
P
0,05) (Figur 5A, venstre panel). I RT4 celler-podede mus, tumorvolumen syntes at udvikle mindre end i kontrolmus efter ciglitazon behandling, men dette var ikke statistisk signifikant (figur 5A, højre panel). For at bestemme hvorvidt inhibering af tumorudvikling ved ciglitazon skyldes hæmning af proliferation, apoptose eller begge evalueret vi Ki67-ekspression og caspase 3-aktivering på tumor vævssnit ved immunohistokemisk analyse. Antallet af Ki67-positive celler var lavere i T24 og RT4 celler-xenotransplanterede tumorsnit fra ciglitazon-behandlede dyr sammenlignet med tumorsnit fra ubehandlede dyr. Tværtimod var der ingen påviselig aktiveret caspase 3 i RT4 celler-xenotransplanterede tumorsektioner og en stærk aktiveret caspase 3-farvning i T24-celler-xenotransplanteret tumorsnit fra ciglitazon behandlede dyr sammenlignet med tumorsnit fra ubehandlede dyr (figur 5B). Disse resultater indikerer, for første gang til vores viden, at den reduktion af tumorvolumen observeret i ciglitazon-behandlede mus (xenotransplanterede med T24 blære cancerceller) kræver inhibering af proliferation samt induktion af apoptose.
Mus blev inokuleret subkutant med eksponentielt voksende T24 og RT4 blære cancerceller (5 x 10
6 celler). Når tumorstørrelsen nåede 40 mm
3 volumen, blev musene tilfældigt inddelt i kontrol og behandlede grupper (n = 10). Intraperitoneale injektioner af ciglitazon blev ugentligt indgives i en dosis på 15 mg /kg i løbet af tre uger. Kontroldyr modtog kun saltvand køretøjet efter en identisk tidsplan. (A) tumorvæksten kurver blev bestemt ved at måle tumorvolumen. *
P
0,05, betydelige forskelle sammenlignet med ubehandlede dyr med brug af to-vejs ANOVA test (vurdering af udviklingen tumor volumen over tid); **
P
0,05, signifikante forskelle mellem kontrol og behandlede mus på hver post-transplantat tid med brug af to-sidede uparrede Students
t
test. (B) immunhistokemisk farvning af repræsentative paraffinindlejrede sektioner af tumorer fra ubehandlede eller ciglitazon-behandlede mus. Snit blev fikseret og farvet for Ki-67 og aktiv caspase 3. Hvert panel repræsenterer 5 sektioner for hver af ti tumorer fra kontrol- og ciglitazon-behandlede mus. Original forstørrelse, × 20.
Ciglitazon og TRAIL kombineret behandling inducerer synergistisk apoptose gennem døden receptor signalvejen, caspase aktivering og Bud spaltning
T24 celler er kendt for at være meget modstandsdygtige over for TRAIL efter udsættelse for stigende koncentrationer af exogent opløseligt rekombinant humant TRAIL i området fra 10 til 200 ng /ml [25]. Ifølge vores resultater, som viser, at ciglitazon opregulerer TRAIL udtryk, vi postulerede, at ciglitazon dræber T24 celler ved at genoprette deres følsomhed over for TRAIL-induceret apoptose. For at validere denne hypotese blev celler behandlet med vehikel eller 40 uM ciglitazon i 24 timer eller 50 ng /ml rekombinant TRAIL for de sidste 12 timer alene eller i kombination. Som tidligere rapporteret, viste vi også, at T24 celler var refraktære over for TRAIL-induceret apoptose. Mere interessant, var der en signifikant stigning i celledød i ciglitazon og TRAIL-cotreated celler sammenlignet med ciglitazon alene-behandlede celler (figur 6A, øverst). Den TRAIL-sensibiliserende virkning af ciglitazon resulterede i pro-caspase 8 og 3 behandling og PARP proteolyse men inddrages også mitokondrier forstærkning loop som angivet af caspase 9 og Bid spaltning (figur 6A, nederst). I nærvær af caspase 8 (Z-IETD-FMK) eller caspase 9 (Z-LEHD-FMK) specifikke inhibitorer, observerede vi en inhibering af enten caspase 8 eller caspase 9 forarbejdning og fraværet af Bid spaltning samt, i ciglitazon og TRAIL cotreated celler (figur 6B, nederst). Dette var forbundet med et fald på celledød i nærvær af caspaseinhibitorer som påvist ved et signifikant fald i DNA-fragmentering (figur 6B, øverst). For at bekræfte involveringen af død receptoraktivering blev DR4 og DR5 stimulering inhiberes ved præ-inkubering af celler med blokerende anti-DR4 eller anti-DR5-antistoffer før behandling (figur 6C). Inaktivering hver af receptorerne ved TRAIL og ciglitazon samtidig behandling effektivt blokeret celledød bekræfter, at apoptose var medieret via specifikke interaktioner mellem TRAIL og dets receptorer.
T24-celler blev behandlet eller ikke med 40 pM ciglitazon i 24 timer eller human rekombinant TRAIL (50 ng /ml) i 12 timer eller cotreated med ciglitazon og TRAIL (tilføjet her for sidste 12 timer). (A,
top
) Procentdelen af celler, der viser hypodiploid DNA-indhold (sub-G1 peak) blev evalueret ved flowcytometrianalyse. Data er middelværdier ± SD af 3 uafhængige eksperimenter udført i triplikater. *
P
0,05, betydelige forskelle i forhold til ubehandlede celler; **
P
0,05, betydelige forskelle sammenlignet med individuelle behandling-eksponerede celler med brug af to-sidede uparrede Students
t
test; (A,
bund
) Immunoblotting påvisning af caspaser 8, 9 og 3, PARP og Bid. (B) Celler blev præinkuberet 1 time med 50 pM caspase 8 (Z-IETD-FMK) eller 9 (Z-LEHD-FMK) specifik inhibitor før indikeret behandling;
top
, procentdelen af celler, der viser hypodiploid DNA-indhold blev vurderet ved flowcytometri analyse;
bund
, caspaser 8, 9, 3 og Bid spaltning blev analyseret ved western-blotting analyse. (C) Celler blev præinkuberet med eller uden monoklonale antistoffer blokerer DR4 og DR5 receptorer for 1 time og stimuleret som angivet. Procentdelen af celler, der viser hypodiploid DNA-indhold blev vurderet ved flowcytometri analyse. (D) Immunblotting detektion af c-FLIP og survivin fra T24 helcellelysater. (E) Celler blev forbehandlet med 25 pM proteasominhibitor MG132 i 30 minutter og stimuleret med 40 pM ciglitazon i 12 timer;
top
, procentdelen af celler, der viser hypodiploid DNA-indhold blev vurderet ved flowcytometri analyse;
bund
, immunoblotting påvisning af c-FLIP og survivin. β-actin blev anvendt som en intern loading kontrol. (B, C, E) Data middel ± SD af 2 uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer. *
P
0,05, betydelige forskelle i forhold til ubehandlede celler; **,
P
. 0,05, betydelige forskelle sammenlignet med ciglitazon og TRAIL cotreated celler med brug af to-sidede uparrede Students
t
test
ciglitazon nedregulerer c-FLIP og survivin gennem en proteasom-afhængig nedbrydning
Vi undersøgte effekten af ciglitazon og sammenslutningen af ciglitazon med TRAIL på ekspressionen af apoptose hæmmere såsom survivin og c-FLIP kendt for yderligere være involveret i reguleringen af både interne og eksterne apoptotiske veje. Som beskrevet i figur 6D, ciglitazon, som individuel behandling eller i kombination med TRAIL, reducerede både c-FLIP
S og survivin proteinniveauer i samme omfang og dramatisk nedreguleret c-FLIP
L. Tværtimod gjorde TRAIL enkelt behandling påvirker ikke væsentligt c-FLIP og survivin protein niveauer. Disse resultater viser, at nedregulering af c-FLIP og survivin sandsynligvis bidrager til ciglitazon-udløst apoptose og at ciglitazon-medieret overfølsomhed til TRAIL-induceret apoptose.
ubiquitin-proteasom vej spiller en central rolle i reguleringen af cellecyklus kontrol og apoptose [26]. Adskillige anti-apoptotiske proteiner, såsom c-FLIP og survivin repræsenterer fremtrædende mål for proteasomet. For at bestemme hvorvidt ciglitazon-induceret nedregulering af sådan apoptose negative regulatorer medieres gennem denne proces, undersøgte vi virkningerne af proteasominhibitor MG132. MG132 restaureret niveauerne af survivin og c-FLIP (figur 6E, nederst) indikerer, at nedregulering af både apoptoseinhibitorer var proteasom afhængig. Som vist i figur 6E (øverst) sub-G1 cellepopulation niveau i cotreated celler blev signifikant reduceret i nærvær af MG132. Således blev inddrivelse af c-FLIP og survivin, der væsentligt svækket ciglitazon og TRAIL kombination-induceret apoptose, nødvendige, men ikke tilstrækkelige til at overvinde samtidig behandling-forfremmet apoptose i T24-celler.
Diskussion
denne rapport viste, at ciglitazon induceret cellevækstinhiberingen gennem cellecyklussen naturligvis kontrol eller induktion af apoptose ifølge tumorklassificering af blærecancer-afledte urothelial celler. Apoptotiske virkninger forekom ved høje koncentrationer (40-60 uM) uafhængigt af PPARy aktivering som allerede rapporteret i andre cellulære modeller [27]. Adskillige potentielle PPARy-aktivering uafhængige mekanismer, der kan inducere apoptose er blevet foreslået. De omfatter generering af reaktive ilt arter [28], induktion af cellulære acidose [29], inddragelse af tidlig vækst respons-1 og NSAID-aktiverede-gen 1 i tyktarmskræft [30].
For første gang i maligne urothelial celler, præsenterer vi beviser for, at ciglitazon inducerede G2 /M cellecyklusstop og ændringer i cellecyklus regulatorer.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.