PLoS ONE: Telmisartan Hæmmer Cell Proliferation ved Blokering Nuclear translokation af ProHB-EGF C-terminal fragment i Colon Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund Mål

Aktuel target behandling mod avancerede tarmkræft er hovedsageligt fokuseret på den epidermale vækstfaktor receptor (EGFR) signalering, men dens additive virkninger med kemoterapi er stadig begrænsede. A disintegrin og metalloproteinase (Adam) spalter proheparin-bindende epidermal vækstfaktor lignende vækstfaktor (proHB-EGF). Og opløselig HB-EGF aktiverer EGFR. Parallelt hermed det carboxyterminale fragment af proHB-EGF (HB-EGF-CTF) translokerer i den indre nukleare membran, og efterfølgende udøver på regulering af celledelingen ved at binde nukleare promyelocytleukæmi zink finger (PLZF) protein, en transkriptionsrepressor , hvorved dets nukleare eksport. Vi antager, at hæmning af HB-EGF-CTF nuklear translokation kan være en ny strategi i forebyggelsen celleproliferation.

Metoder

12

O-

tetradecanoylphorbor-13- acetat (TPA) blev behandlet for at aktivere ADAM. Ni tusinde kemiske forbindelser blev screenet for deres effektiviteter til at blokere binding af HB-EGF-CTF til promyelocytisk leukæmi zinkfinger (PLZF) med Alphascreen system. De opnåede kandidater blev derefter anvendt til at blokere bindingen af ​​HB EGF–CTF at PLZF i colon cancerceller, HT29 og HCT116. Celleproliferation blev undersøgt med en vækstkurve assay. Den intracellulære lokalisering, og association mellem HB-EGF-CTF og PLZF, blev vurderet med immunfluorescensfarvning, og immunopræcipitation og Western blotting, hhv. Virkningerne af opnåede kandidater på EGFR phosphorylering og om nuklear translokation af HB-EGF-CTF og eksport af PLZF under angiotensin II type1 receptor (AT1R) knockdown blev også undersøgt.

Resultater

Telmisartan og candesartan blev fundet at være potentielle kandidater. Telmisartan hæmmede TPA-induceret celleproliferation stærkere end candesartan. Telmisartan, men ikke candesartan blokeret den nukleare translokation af HB-EGF-CTF, og binding af HB-EGF-CTF til PLZF, under TPA stimulation. Både telmisartan og candesartan ikke hæmmer TPA-induceret EGFR fosforylering, og telmisartan, men ikke candesartan, hæmmede TPA-induceret nukleare translokation af HB-EGF-CTF efter knockdown af AT1R.

Konklusioner

hæmningen af ​​HB-EGF-CTF nuklear translokation med telmisartan kan være en roman strategi i forebyggelsen celledeling

Henvisning:. Ozeki K, Tanida S, Morimoto C, Inoue Y, Mizoshita T, Tsukamoto H, et al . (2013) Telmisartan Hæmmer Cell Proliferation ved Blokering Nuclear translokation af ProHB-EGF C-terminal fragment i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 8 (2): e56770. doi: 10,1371 /journal.pone.0056770

Redaktør: Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kina

Modtaget: August 1, 2012; Accepteret: 15 januar 2013; Publiceret: 22 feb 2013

Copyright: © 2013 Ozeki et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Grant-in Støtte til videnskabelig forskning C (KAKENHI 22.590.704) fra Japan Society for fremme af Science (JSP’er). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende konkurrerende interesse: Yoshimasa Inoue og Eiji Nishiwaki er ansat af kommercielle virksomheden Carna Biosciences stiftelse. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere. Alle forfatterne erklærer, at ingen finansielle interessekonflikt i forhold til indholdet af artiklen.

Introduktion

Tyktarmskræft er den hyppigste dødsårsag fra mave malignitet [1]. Øjeblikket terapeutiske behandlinger mod fremskredne kolorektale cancere er hovedsagelig fokuseret på udformningen af ​​terapeutiske midler, der er målrettet til den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR), det monoklonale blokerende antistoffer, såsom cetuximab og panitumumab [2], [3]. opnås de additive virkninger af disse terapeutiske antistoffer plus kombinationen kemoterapi på avanceret colorectal cancer, men begrænset, fordi KRAS mutation afskaffet disse virkninger [3], [4].

N-terminale fragmenter af EGFR-ligander, herunder heparin- bindende epidermal vækstfaktor lignende vækstfaktor (HB-EGF), som anses for at være involveret i hovedsagelig celleproliferation i colon cancerceller binder til EGFR og inducere dets phosphorylering [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. G-protein-koblet receptor (GPCR) -agonister (f.eks interleukin-8) og 12-

O

tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) -induceret EGFR transaktivering via en disintegrin og metalloproteinase (ADAM) – spaltet proHB-EGF [10], [11]. Carboxy terminale fragmenter af proHB-EGF (HB-EGF-CTF) produceret af ektodomænet kaste translokere i den indre nukleare membran, efterfølgende lægge om regulering af celledeling ved at binde nukleare promyelocytleukæmi zink finger (PLZF) protein, en transkriptionsrepressor , hvorved dets nukleare eksport [12], [13]. Derfor er hæmning af nukleare translokation signalering af HB-EGF-CTF anses for at være en ny strategi mod udvikling af kolorektal cancer. Men der er ingen tegn på terapeutiske midler, der specifikt blokerer nukleare translokation af HB-EGF-CTF og bindende af den til PLZF

Således målene med nærværende undersøgelse var at:. I) skærm til potent kemisk forbindelser, der er stand til at inhibere vekselvirkningerne mellem HB-EGF-CTF og PLZF via GST-pull down assay overfladeplasmonresonans (SPR) spektroskopi og Alphascreen teknologi, ii) at validere de inhiberende virkninger af disse potente forbindelser på celleproliferation, og iii ) bekræfter betydningen af ​​at hæmme den nukleare translokation af HB-EGF-CTF i tyktarmskræft celleproliferation.

Materialer og metoder

Materialer

TPA blev købt fra Cell Signaling Technology (Berverly, MA, USA). Anti-EGFR polyklonale antistof, anti-phosphotyrosin monoklonalt antistof (4G10) og normal IgG blev indkøbt fra Millipore (Billerica, MA, USA). EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren AG1478 og anti-PLZF antistof blev indkøbt fra Calbiochem (La Jolla, CA, USA). Candesartan blev opnået fra Takeda Pharmaceutical Company Limited (Osaka, Japan) og telmisartan var en slags begavet fra Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Tyskland). Olmesartan og losartan blev købt fra Daiichi Sankyo Company begrænset (Tokyo, Japan) og Merck Sharp Dohme (Whitehouse Station, NJ, USA), hhv. Den anti-HB-EGF-CTF polyklonalt antistof [12] og metalloproteinase-inhibitor, KB-R7785 [14], blev fremstillet. Det monoklonale anti-FLAG-M2-antistoffet og peroxisomproliferatoraktiveret receptor (PPAR) γ antagonist, GW9662 [15], [16], blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

plasmidpræparat

Et plasmid der koder FLAG-mærket PLZF blev genereret ved subkloning FLAG sekvensen og humant PLZF cDNA i pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Plasmider til rekombinant ekspression af FLAG-mærket PLZF derivater, GST-sammensmeltet EGFR-ligander-CTF, og den fælles fiskeripolitik (cyan fluorescein protein) -mærket PLZF udarbejdet [12]. Zink fingre (ZnF) 5-8, og EGFR-CTF blev klonet ind pGEX6P-1 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).

Cell Kultur

menneskelige kolon kræft cellelinjer, HT29 og HCT116 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), blev dyrket med McCoy’s5A (Sigma), Caco2 (American Type Culture Collection) blev dyrket med Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 20% føtalt bovint serum ( FBS). Og SW480 (American Type Culture Collection) blev dyrket DMEM med 10% FBS. HT1080 celler og primære humane keratinocytter blev dyrket [12], [17].

GST Pull-down Assay

GST og GST-sammensmeltet proHB-EGF-CTF, GST transformerende vækstfaktor α (TGF-α) -CTF, GST amphiregulin (AR) -CTF, og GST- epiregulin (EPR) -CTF blev fremstillet [12]. Efter binding GST og GST-EGFR-ligander-CTF til glutathion Sepharose-perler, blev lysater indeholdende forskellige FLAG-mærket PLZF derivater inkuberet med 20 pi perler i 2 timer ved 4 ° C. Efter vask blev bundne proteiner analyseret med immunblotting anvendelse af et anti-FLAG-antistof.

overfladeplasmonresonans (SPR) spektroskopi

En BIA core S51 SPR System® (GE Healthcare) blev anvendt til kvalitativt og kvantitativt analysere samspillet mellem de fire immobiliserede EGFR-ligand-CTFs (dvs. HB-EGF-CTF, TGF-α-CTF, AR-CTF og EPR-CTF) og GST-Zn 5-8 af PLZF, som var målt i resonansenheder (RU). Det rekombinante biotin-EGFR- ligand-CTFs (Peptide Institute, Inc., Osaka, Japan) blev individuelt immobiliseret (~1000 RU) gennem aminogruppen kobling på streptavidin (SA) certificerede chips. Forskellige koncentrationer af GST-Zn5-8 sattes til at køre HEPES-buffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% Surfactant P20) ved en strømningshastighed på 30 pl /min i 2 min. Sensor chips blev dissocieret ved en 30-sec injektion af 10 mM glycin-HCI, pH 1,5. De sensorgrams blev analyseret med BIA evaluering software (version 4.1, BIAcore). De ligevægt dissociationskonstanter ( »bindende konstant« KD) af hver reaktion blev beregnet ved at dividere dissociationshastigheder ( ‘off sats «; kd) af foreningen satser (‘ på rate«; ka) (dvs. Kd = kd /ka) .

Imaging af den fælles fiskeripolitiks Fusion Proteiner og Kvantificering af cellulære fraktioner med Nuclear Lokaliseret CFP-PLZF

forbigående transficerede HT1080 celler, og stabil HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α, HT1080 /AR, og HT1080 /EPR-celler blev dyrket i 24 timer og derefter celler blev forbehandlet med 10 pM KB-R7785 i serum-frit medium i 30 min. Celler blev derefter inkuberet i serumfrit medium med 100 nM TPA i 1 time. Subcellulær lokalisering af FFP fusionsprotein blev undersøgt under et epifluorescensmikroskop (Eclipse TE3000, Nikon, Tokyo, Japan) [12].

Alphascreen Analyser

En Alphascreen System® (PerkinElmer, Shelton, CT , USA) blev anvendt til at screene et bibliotek af 9000 kemiske forbindelser (Carna Bioscience Inc., Kobe, Japan) cyclopaedically for deres virkningsfuldhed til blokering af interaktionen mellem biotinyleret-EGFR-ligander-CTF og GST-Zn5-8 af PLZF. 5 pi af 1,25 ug /ml rekombinant GST-ZnF5-8 blev inkuberet med 2,5 pi 1,25 ug /ml biotin-EGFR-ligander-CTF i 30 minutter, og 2,5 pi anti-GST-antistof (1,8 ug /ml) blev tilsat til løbet af 1 time. Derefter blev 5 pi streptavidin-coatede donor og anti-GST IgG konjugeret acceptor-perler (01:01 blanding) blev inkuberet i 2 timer i mørke. Alphascreen signaler (tællinger pr sekund) blev analyseret med en EnVision mikropladelæser (Perkin-Elmer). Assays blev udført ved 23 ° C i buffer indeholdende 25 mM HEPES, 1 mM MgCl

2, 20 mM NaCl, pH 7,4, 0,1% BSA.

celleproliferationsassay (CCK-8 Kit Assay)

En celletælling Kit8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) blev anvendt til bestemmelse af celleproliferation. Kort fortalt, 2 × 10

5 celler per brønd blev dyrket i 96-brønds dyrkningsplader med 10% FBS i 24 timer. Derefter FBS blev erstattet med serumfrit medium i 72 timer med eller uden 30 pM af de 12 kandidatforbindelser og telmisartan eller candesartan (0,3, 3 og 30 uM), og 30 uM GW9662 under stimulation med 100 nM TPA. 10 pi CCK-8 opløsning blev derefter tilsat til hver brønd, og inkuberet ved 37 ° C i yderligere 2 timer. Optisk densitet (OD) blev undersøgt ved en bølgelængde på 450 nm.

Overvågning enkelt celle vækster

Celler blev podet ved en tæthed på 5 × 10

2 celler pr 10 cm af et fad på dag 0 i 10% FBS normalt vækstmedium. Efter 24 timer (på day1), blev temmelig isolerede og morfologisk sunde celler markeret med fase-kontrast mikroskopi. Mediet blev erstattet med 5% FBS-medium (kontrol) med eller uden 100 nM TPA, 10 uM KB-R7785, 100 nM af AG1478, 30 pM af telmisartan og candesartan, og 50 ng /ml rekombinant HB-EGF ( Sigma). Mediet blev udskiftet hver 48. timer med frisk medium. Cellemorfologi og tællinger blev scoret hver 24. h [18].

immunfluorescensmikroskopi

Celler, som dannede en koloni blev skiftet til serum-frit medium i 48 timer og derefter inkuberet i 60 min i 5 % FBS konditionerede medier med eller uden 10 uM KB-R7785, 100 nM af AG1478, 50 ng /ml rekombinant HB-EGF, 30 um af telmisartan, og 30 uM af candesartan. Efterfølgende blev celler behandlet med 100 nM af TPA i 90 minutter, og derefter fikseret med ethanol og acetone. Den subcellulære lokalisering af HB-EGF-CTF og PLZF blev analyseret med immunofluorescens. Primære antistoffer mod HB-EGF-CTF eller PLZF blev anvendt. De sekundære antistoffer var Alexa Fluor 594 anti-kanin IgG eller Alexa Fluor anti-mus IgG (Invitrogen). Billeder blev opnået på en Eclipse 80i fluorescensmikroskop (Nikon).

Immunfældning og western blotting

Celler i en subkonfluent tilstand blev skiftet til serum-frit medium i 48 timer og behandlet med TPA på angivne tidspunkter. Telmisartan og candesartan blev tilsat til cellerne i 60 minutter, før de stimuli. Cellerne blev lyseret med lyseringsbuffer, og supernatanter blev opsamlet og inkuberet med 1 ug af humane anti-EGFR eller anti-HB-EGF-CTF polyklonale antistoffer i 2 timer ved 4 ° C med ende-over-ende rotation. Immunopræcipitation og western blotting blev udført [11]. De primære antistoffer blev anvendt, var 4G10 eller anti-PLZF, og anti-HB-EGF-CTF. De sekundære antistoffer blev anvendt, var anti-muse-IgG HRP-koblet eller anti-kanin IgG HRP-koblede antistoffer (Cell Signaling Technology). Membranerne blev udviklet på en ECL Western blotting påvisning systemet (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England).

Silencing angiotensin II type 1 receptor (AT1R) og ADAM12

Celler blev transficeret med 30 uM af AT1R og kapløbet siRNA’er (Santa Cruz, Delaware, CA, USA), og med 10 uM af ADAM12 og kapløbet siRNA’er (Invitrogen) under anvendelse af lipofectamin-reagens (Invitrogen). 72 timer efter celler blev transficeret, blev ekspressionen af ​​AT1R og ADAM12 (Santa Cruz Biotechnology) analyseret ved Western blotting.

Statistik

Data er udtrykt som middelværdi ± SEM. Den envejs ANOVA og Tyrkiet-Kramers multiple procedure sammenligning test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikante forskelle (P 0,05)

Resultater

Dual signalveje af EGFR phosphorylering og HB-EGF C. terminal Fragment Nuclear Translokation under Cell Proliferation (Citeret fra ref No. [19] og Modified.)

12-

O

-tetradecanoylphorbor-13-acetat (TPA) induceret epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) transaktivering via en disintegrin og metalloproteinase (ADAM) – spaltede proheparin-bindende EGF-lignende vækstfaktor (proHB-EGF) og regulerer celleproliferation [10]. Parallelt hermed de carboxyterminale fragmenter (CTF) i proHB-EGF (HB-EGF-CTF) translokerer i den indre nukleare membran, efterfølgende lægge om regulering af celledeling ved at binde nukleare promyelocytleukæmi zink finger (PLZF) protein, en transskriptionsrepressor, hvorved dets nukleare eksport (fig. 1) [19].

Citeret fra [19], og ændret. TPA inducerer en ADAM-medieret spaltning af proHB-EGF, og resulterer i ektodomænet udgydelse af dets N-terminalt fragment og generering af et intracellulært C-terminale fragment (CTF). Det opløselige HB-EGF binder til EGFR og inducerer en hurtig transient phosphorylering af EGFR. Denne phosphorylering resulterer i transkription af forskellige gener. Imens HB-EGF-CTF translokeres til kernen, hvor det efterfølgende inducerer nuklear eksport af PLZF. Dette resulterer i fremadskriden af ​​cellecyklus. De potent hæmmer blokerer nukleare translokation af HB-EGF-CTF. P angiver phosphorylering. Forkortelser: EGFR; epidermal vækstfaktor receptor, TPA; 12-

O

tetradecanoylphorbol-13-acetat, PKCδ; proteinkinase Cδ, ADAM; en disintegrin og metalloproteinase, HB-EGF; heparinbindende EGF-lignende vækstfaktor, CTF; C-terminalt fragment, MAPK; mitogenaktiveret proteinkinase, PLZF; promyelocytleukæmi zink finger.

Vi hypotese, at hæmning af nuklear translokation af HB-EGF-CTF kan føre til en ny strategi for forebyggelse celledeling under udvikling tyktarmskræft.

Men der er i øjeblikket ingen tegn på potente kandidater, der specifikt blokerer nukleare translokation signalering af HB-EGF-CTF.

CTF af EGFR-ligander interageret med den specifikke del af PLZF (ZnF5-8) Vi brugte HT1080 celle linjer, fordi HT1080 celler udtrykker lidt endogene HB-EGF forstadier, og de er nyttige til at analysere de bindingssteder mellem HB-EGF-CTF og PLZF, og nuklear eksport af PLZF efter overekspression HB-EGF prækursorer og PLZF derivater [12]. Vi først certificeret samspillet mellem de cytoplasmatiske domæner af EGFR-ligander og PLZF i HT1080 celler, der udtrykker de fire proEGFR-ligander og PLZF før screening af de potente kandidater. Eftersom PLZF coimmunoprecipitates med et antistof mod CTF af proHB-EGF i HT1080 celler overudtrykker proHB-EGF og FLAG-mærket PLZF [12], en co-immunpræcipitationseksperimenter af PLZF blev udført med antistoffer mod CTF af de fire EGFR-ligander (HB-EGF , TGF-α, AR, EPR), i HT1080 celler. FLAG-mærket fuldlængde PLZF genet blev forbigående transficeret ind i celler, der stabilt udtrykker proHB-EGF, proTGF-α, proAR eller proEPR (fig. 2A). PLZF blev udtrykt i disse celler (fig. 2B, bane 1). Efter TPA-stimulering i 1 time, FLAG-mærket PLZF protein, som immunpræcipiteret med hvert antistof blev påvist ved immunoblotting med et anti-FLAG-antistof (Fig.2B, bane 2).

(A) Skematisk af FLAG-mærket fuld længde PLZF bestående af FLAG, BTB, center, og ni ZnFs. (B) HT1080 celler, der stabilt udtrykker pro-HB-EGF, pro-TGF-α, pro-AR og pro-EPR blev transient transficeret med en ekspressionsvektor, der koder for FLAG-mærket PLZF. PLZF protein ekspression af cellelysater (bane 1), såvel som, celler behandlet med 100 nM TPA i 1 time og undersøgt med anti-FLAG-antistoffer efter immunfældning med anti-EGFR-ligander-CTF antistoffer (bane 2) og et anti-normal kanin IgG (lane3). (C) GST pull-down assay. Cellelysater indeholdende FLAG-mærket PLZF derivater blev inkuberet med GST (bane 2), GST-HB-EGF-CTF (bane 3), GST-TGF-α-CTF (Lane4), GST-AR-CTF (bane 5), og GST-EPR-CTF (bane 6) perler i 2 timer, og bundne proteiner blev detekteret ved immunoblotting med et anti-FLAG-antistof. (D) Schema af FLAG-mærket PLZF derivater. De bindende egenskaber PLZF derivater til GST-fused- HB-EGF-CTF, TGF-α-CTF, AR-CTF og EPR-CTF GST i en pull-down assay, som er sammenfattet i de rette baner af hver struktur. Bindende egenskaber er baseret på estimeringen af ​​bandet intensitet med, er i forhold til kontrol-båndet og angivet med ++ ( 50%), + (50-10%), og – ( 10%)

.

Næste, vi bestemt de bindende regioner PLZF til de cytoplasmatiske domæner af pro-EGFR-ligander i HT1080 i GST pull-down assay. En GST pull-down assay viste samspillet mellem EGFR ligand-CTFs og ZnF 5-8 af PLZF. Hver rekombinant GST-fusioneret CTF (GST-CTF) trukket ned FLAG-mærket PLZF ligeligt i cellelysater fremstillet ud fra HT1080-celler, der udtrykker FLAG-mærket PLZF (fig. 2C, panel 1). Vi yderligere undersøgt de bindende regioner i CTFs i PLZF. Forskellige FLAG-mærket PLZF derivater (fig. 2D) blev fremstillet og inkuberet med rekombinant GST-EGFR ligand-CTFs. Hele zink finger region (ZnF1-9) og ZnF5-8 blev trukket ned ligeligt af GST-TGF-α-CTF, GST-AR-CTF og GST-EPJ-CTF samt HB-EGF-CTF, men ikke GST alene (fig. 2C, paneler 3 og 4). Ingen af ​​de fire GST-CTFs trukket ned deletionsmutanten mangler en zinkfinger region (BTB + Center) (fig. 2C, panel 2). Vi derefter testet, om deletionsmutanter af ZnF6-7 (PLZF /ΔZnF6-7) og ZnF5-8 (PLZF /ΔZnF5-8) binde GST-CTFs. Udeladelsen af ​​ZnF6-7 ophævet bindingen af ​​PLZF til GST-TGF-α-CTF og GST-HB-EGF-CTF, tyder på, at TGF-α-CTF og HB-EGF-CTF interagere med PLZF via ZnF6-7. I modsætning hertil PLZF /ΔZF6-7 bundet svagt til GST-AR-CTF og GST-EPR-CTF (fig. 2C, panel 5). Endelig testede vi, om ZF5-8 er en kritisk region for at interagere med AR-CTF eller EPR-CTF. PLZF /ΔZnF5-8 bundet ingen af ​​GST-CTFs (fig. 2C, panel 6). Disse data tyder på, at ZnF5-8 regionen er kritisk for interaktionerne mellem PLZF og CTFs.

Svag bindingsaffinitet HB-EGF-CTF og PLZF var Vigtigt for Nuclear Eksport af PLZF

for yderligere at afklare, om de fire CTFs direkte interagere med PLZF, vi analyserede bindingen mellem CTFs og rekombinant GST-mærket ZnF5-8 (GST-ZnF5-8) med en SPR system. GST-ZnF5-8 bundet med immobiliseret biotin-AR-CTF og biotin-EPR-CTF (fig. 3A) ved en koncentration på 0,03-1,0 uM.

K

D for samspillet mellem GST-ZnF5-8 og biotin-AR-CTF var 76,5 nM, og for GST-ZnF5-8 og biotin-EPJ-CTF var 146 nM (tabel 1 ). I modsætning hertil

K

D-værdi for interaktionen mellem GST-ZnF5-8 og biotin-HB-EGF-CTF ikke beregnet på grund af deres hurtige dissociation. Bindingen signal af GST-ZnF5-8 til immobiliseret biotin-TGF-α-CTF blev observeret, men det var lavere end den for biotin-AR-CTF eller biotin-EPR-CTF. Således kunne dissociationskonstanten ikke beregnet, på grund af fraværet af dosis-afhængig binding af GST-ZF5-8 ved en koncentration på ≤0.5 uM og interferens med de frie SH rester af de syv cysteiner på TGF-α-CTF (Fig . 3A).

(A) Direkte interaktion mellem EGFR-ligand-CTF og PLZF (GST-mærkede ZnF5-8) med SPR-systemet. Det rekombinante biotin-EGFR- ligand-CTFs blev individuelt immobiliseret ved SA sensor chips. GST-Zn5-8 med koncentrationer i området fra 0,03 til 1,0 uM blev derefter injiceret med rindende puffer ved 25 ° C og en gennemstrømningshastighed på 30 pl /min i 2 min. (B) Ekspressionsvektoren, der koder CFP-PLZF blev cotransficeret ind i vildtype-HT1080-celler og HT1080-celler, der stabilt udtrykker enten proHB-EGF, proTGF-α, proAR eller proEPR. Cellerne blev dyrket i 24 timer og derefter forbehandlet i serum-frit medium med KB-R7785. Celler blev derefter behandlet i serumfrit konditioneret medium med TPA, og blev observeret den subcellulære lokalisering af FFP fusionsprotein. For at bestemme procentdelen af ​​celler (middel ± SD) demonstrerer kernelokalisering FFP-PLZF blev celler talt i mindst to transfektioner, og mindst 200 celler, der udtrykker CFP-PLZF blev undersøgt i hvert eksperiment. * P 0,05 for stimulus virkning under TPA behandling vs. ingen behandling, og ** P 0,05 for den inhiberende virkning under KB-R7785 behandling vs. TPA-behandling. (C) En skematisk af high-throughput Alphascreen system. Ved excitation ved 680 nm, er omgivende ilt omdannes til singlet oxygen (

1O

2) ved en fotosensibilisator til stede i donor- perler. Hvis acceptor perler er i tæt nærhed ( 200 nm), til

1O

2 overfører sin energi thioxene derivater stede i acceptor perler fører til emission af lys ved 520-620 nm. En kompleks består af streptavidinovertrukne donor perler og biotinyleret EGFR-ligander-CTF. Et andet består af anti-GST antistof-konjugerede acceptor-perler og GST-ZF5-8. Hvis der opstår associationen mellem EGFR-ligand-CTF og ZnF5-8, perlerne er tæt nok til at tillade detektion af et signal. Eventuelle inhibitorer af denne interaktion vil øge afstanden mellem perlerne, og signalet vil gå tabt. (D) Alphascreen signaler af GST eller GST-Zn5-8 inkuberet med forskellige koncentrationer af biotin-HB-EGF-CTF. (E) Alphascreen signaler af biotin-HB-EGF-CTF inkuberet med forskellige koncentrationer af GST eller GST-Zn5-8. (E) De bindende evner HB-EGF, TGF-α, amphiregulin (AR), og epiregulin (EPR), at PLZF med Alphascreen system.

Næste, for at afklare nukleare eksport af PLZF udløst af TPA-inducerbare udgydelse af EGFR-ligander, blev den subcellulære lokalisering af PLZF protein undersøgt under den intracellulære translokation af de fire CTFs. Ekspressionsvektoren, der koder CFP-PLZF blev transficeret i HT1080-celler og stabilt transficerede HT1080-celler udtrykker enten proHB-EGF, proTGF-α, proAR eller proEPR. Det er kendt, at vildtype HT1080 celler konstitutivt udtrykker mindre HB-EGF og dermed er den nukleare translokation af HB-EGF-CTF ikke observeret [14]. CFP-PLZF blev overvejende lokaliseret i kernen af ​​HT1080 celler og i de fire transfektanter. TPA behandling i 1 time inducerede en fordeling af FFP-PLZF hele cytoplasmaet i HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α, og HT1080 /EPR-celler. Desværre fik TPA ikke ændre subcellulære lokalisering af FFP-PLZF i HT1080 og HT1080 /AR celler. Forholdene af FFP-PLZF lokalisering i kernen efter TPA-inducerbare udgydelse var signifikant lav i HT 1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α og HT1080 /EPR celler (fig. 3B). Forbehandling med 10 uM af KB-R7785, en metalloproteinase-inhibitor, effektivt ophævet frekvensen af ​​FFP-PLZF nuklear eksport efter TPA-stimulering i HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α og HT1080 /EPR-celler (fig. 3B) . Interessant nok er frekvensen af ​​den nukleare eksport af PLZF omvendt korreleret med dens affinitet. Disse resultater indikerer, at affiniteten af ​​CTF-PLZF interaktionen påvirker intracellulær lokalisering og funktion af PLZF.

high-throughput screening Assay System for Inhibitors, der blokerer interaktionen mellem ZnF5-8 af PLZF og AR- eller HB -EGF-CTF Indsnævret 12 Kandidater og fire ARB’er

en high-throughput screening assay blev udviklet på en Alphascreen® at screene for inhibitor, som blokerer interaktionen mellem ZnF5-8 og CTFs. Den Alphascreen assay design bygger på den kendsgerning, der kan detekteres kun et signal, når streptavidinovertrukket donor og anti-GST antistof-konjugeret acceptor-perler er lukket inden for en afstand på 200 nm. Perlerne bringes i tæt nærhed til denne reaktion via specifikke interaktioner mellem ZnF5-8 og CTFs komplekser koblet til dem (fig. 3C). Stigende koncentrationer af biotin-HB-EGF-CTF dosisafhængigt forøgede Alphascreen signal, når det inkuberes med GST-ZnF5-8 (fig. 3D). Stigende koncentrationer af GST-ZnF5-8 også dosisafhængigt forøgede signalet, når inkuberet med biotin-HB-EGF-CTF (fig. 3E). De Alphascreen signaler for interaktionen mellem biotin-AR-CTF, biotin-EPR-CTF, biotin-TGF-α-CTF, og biotin-HB-EGF-CTF med GST-ZnF5-8 var sammenlignelige med bindingsaffiniteterne bestemt med SPR (fig. 3F).

En analyse med biotin-AR-CTF og GST-Zn5-8 af PLZF kunne klart fremgå hæmmende effekter af opnåede kandidater på interaktion af biotin-AR-CTF med GST-Zn5- 8 af PLZF fordi Alphascreen signal af biotin-AR-CTF var højere end biotin-HB-EGF-CTF. Baseret på deres effektivitet til at blokere bindingen af ​​AR-CTF samt HB-EGF-CTF og Zn5-8 af PLZF blev tolv kandidater, herunder no.8016, 7701 og 7804 opnås ved screening 9000 kemiske forbindelser (fig. 4A ). Den% inhibering af 10 uM af NO. 8016, 7701 og 7804 på samspillet mellem biotin-AR-CTF og GST-Zn5-8 af PLZF var 30,4, 60,5 og 49,9 hhv. Den inhiberende virkning af forbindelse no.8016 på interaktionen var ikke den højeste (tabel 2). Imidlertid No.8016 inhiberede celleproliferation stærkeste blandt tolv kandidater i celleproliferationsassay (fig. 4B). Baseret på resultaterne af celleproliferation, valgte vi ikke. 8016 som kandidat. Den halve maksimale hæmmende koncentration (IC

50) opnået med forbindelse nr. 8016 var 29,9 pM (fig. 4C).

(A) Tolv kandidat forbindelsen strukturelle formel baseret på effektivitet til at blokere binding af HB-EGF-CTF eller AR-CTF til Zn5-8 af PLZF med Alphascreen system. (B) Inhiberende virkninger af tolv kandidatforbindelser på TPA-induceret celleproliferation i keratinocytter med et celleproliferationsassay. 2 × 10

4-celler blev behandlet i de konditionerede medier med eller uden de tolv kandidatforbindelser under TPA-stimulering, og absorbansen ved 450 nm blev bestemt hver 12 timer indtil 60 timer. ** P 0,05 for de hæmmende virkninger under 12 kandidater behandling vs. TPA behandling. (C, D) De hæmmende virkninger af kandidaterne, specielt sammensatte no.8016 og telmisartan, om bindingen af ​​AR-CTF til PLZF. Plots med procent inhibition mod forskellige koncentrationer af forbindelse no.8016 og telmisartan præsenteret med IC

50 værdier observeret af Alphascreen systemet. (E) hæmmende virkninger af tre ARB kandidater på bindingen af ​​AR-CTF til PLZF. Plots med procent inhibition mod forskellige koncentrationer af hver hæmmer og hæmning præsenteret med IC

50 værdier.

Vi fokuserede derefter på den specifikke strukturformel af biphenyl tetrazolen i kandidatforbindelsen og yderligere screenet kemiske forbindelser, herunder ARB’er (dvs. telmisartan, candesartan, olmesartan, og losartan). Baseret på effekten af ​​at blokere bindingen af ​​AR-CTF til PLZF, IC

50 af telmisartan, candesartan, olmesartan, og losartan blev 27,8, 21,9, 87,7 og 28,4 uM, og deres kemiske strukturformel er vist ( fig. 4D og E). Disse resultater tyder på, at telmisartan og candesartan er tilfredsstillende kandidater i at blokere både HB-EGF-CTF og AR-CTF fra at interagere med PLZF.

No.8016 af Tolv Kandidat pasta og Telmisartan Hæmmet Cell Proliferation

keratinocytceller har en masse af endogene HB-EGF forstadier, og de er nyttige til at analysere celleproliferation gennem HB-EGF-CTF signalering. Vi brugte HT1080 cellelinjer når hæmmere blev screenet [17]. For at undersøge, om de kandidater forbindelser, der blokerede interaktionen mellem CTFs og PLZF også hæmmede celleproliferation, vi testede hæmmende virkninger af disse tolv kandidater og fire angiotensin II type 1 receptor (AT1R) (ARB’er) på TPA-induceret celle spredning af keratinocyt med en celleproliferationsassay. Cellerne blev behandlet i konditioneret medium med eller uden 30 pM af de tolv kandidatforbindelser og 30 uM af ARB’er i op til 60 timer i nærvær af TPA, og absorbansen blev målt hver 12 timer. Forbindelse no.8016 og telmisartan viste sig at inhibere celleproliferation (fig. 4B, 5B og D). Endvidere absorbansværdier gradvist genvundet dem af TPA-inducerede niveauer (dvs. uden forbindelse no.8016 og telmisartan), når celler blev vasket 12 timer efter inkubation med forbindelse no.8016 og telmisartan (fig. 5A og C).

(AD) Inhiberende virkninger af forbindelse no.8016 (a) og fire ARB’er (B) på TPA-induceret celleproliferation i keratinocytter med et celleproliferationsassay. 2 × 10

4-celler blev behandlet i konditioneret medium med eller uden no.8016 eller fire ARB’er under TPA-stimulering, og absorbansen ved 450 nm blev bestemt hver 12 timer indtil 60 timer. (A, C) Inhibering af celleproliferation med no.8016 og telmisartan blev kontrolleret efter en vask ved 12 timer. (D) Cellerne blev også observeret med mikroskopi.