PLoS ONE: antitumorvirkninger af en roman Kromosom Region Vedligeholdelse 1 (CRM1) Inhibitor om ikke-småcellet lungekræft celler in vitro og i Mouse Tumor Xenografts

Abstrakt

Baggrund

Kromosom Region Vedligeholdelse 1 (CRM1) er en nuklear eksportør og dens inhibitor har anti-tumor aktivitet i forskellige kræftformer. Denne undersøgelse vurderede terapeutiske effektivitet af det hidtil ukendte CRM1 inhibitoren KPT-185 om ikke-småcellet lungekræft (NSCLC).

Metoder

NSCLC cellelinier blev behandlet med KPT-185 at vurdere ændringer i cellelevedygtighed, cellecyklus, apoptose, og proteinekspression. NOD-SCID mus, der bærer NSCLC celle xenografter blev oralt behandlet med KPT-276, en klinisk analog af KPT-185, at undersøge effekt og bivirkninger af KPT-276 in vivo.

Resultater

KPT-185 reducerede signifikant levedygtigheden af ​​seks NSCLC cellelinier i en tids- og dosisafhængig måde, herunder epidermal vækstfaktor receptor-tyrosinkinase-inhibitor (EGFR-TKI) resistent H1975 og H1650GR cellelinier. Desuden KPT-185 inducerede disse NSCLC celler til at standse ved G1-fasen af ​​cellecyklussen og forårsagede apoptose på en dosis-afhængig måde. KPT-185 behandling også reduceret CRM1 protein niveauer i seks NSCLC cellelinjer, og reduktionen kan helt afskaffet ved proteasominhibitoren bortezomib. KPT-185 aktiverede caspase 3, 8 og 9, men hæmmet survivin udtryk i NSCLC celler. I en mus H1975 celle xenograftmodel blev tumorvækst markant hæmmet af oral KPT-276 administration, og der var ingen signifikant mus krop vægttab eller andre bivirkninger.

Konklusioner

Den aktuelle undersøgelse demonstrerede antitumorvirkninger af KPT-185 i NSCLC-celler, herunder EGFR-TKI-resistente NSCLC cellelinier. Yderligere undersøgelser vil vurdere anti-tumor aktivitet af KPT-185 i et klinisk forsøg for NSCLC patienter

Henvisning:. Wang S, Han X, Wang J, Yao J, Shi Y (2014) antitumorvirkninger af en roman kromosom Region Vedligeholdelse 1 (CRM1) Inhibitor om ikke-småcellet lungekræft celler in vitro og i Mouse tumorxenoplantater. PLoS ONE 9 (3): e89848. doi: 10,1371 /journal.pone.0089848

Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA

Modtaget: August 18, 2013; Accepteret: 28 Januar 2014; Udgivet: 4 marts 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft død i. verden, der tegner sig for 1,3 millioner på verdensplan kræftrelaterede dødsfald hvert år [1]. Histologisk ca. 85% af patienter med lungekræft er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [2], hvoraf de fleste er diagnosticeret på et fremskredne stadier af sygdommen og ikke kan tåle helbredende kirurgi. Palliativ behandling omfatter kemo- og radioterapi og senere, målretning terapi, såsom epidermal vækstfaktor receptor-tyrosinkinaseinhibitorer (EGFR-TKI) gefitinib, erlotinib, og icotinib. Disse terapier har forbedret overlevelse af patienter med NSCLC [3]; Men de patienter, som i første omgang reagerer på EGFR-TKI behandlinger i sidste ende udvikle erhvervet resistens. Således er et presserende behov for nye terapeutiske midler med lav toksicitet og bedre resultater for patienter med NSCLC.

Under menneskelig carcinogenese eller cancer progression, maligne celler erhverve evnen til at eksportere vigtigste nukleare proteiner, der kan påvirke behandlingseffekt. Disse proteiner omfatter tumorsuppressorer og regulatorer af celle apoptose, er nukleare lokalisering af som kræves til deres korrekte funktion [4]. Kromosom vedligeholdelse region 1 protein (CRM1 eller kaldet XPO1) er et medlem af importin β superfamilien af ​​nukleare eksport receptorer (karyopherins). Desuden CRM1 er det vigtigste mediator af nuklear eksport, kan interagere med leucin-rige nukleare eksport signaler (Ness) og transport proteiner gennem nukleare pore komplekser til cytoplasmaet [5] – [7], herunder EGFR, p53 og nuklear faktor kappa let polypeptid genenhancer i B-celler inhibitor, alfa (IkB-α) [8] – [10]. Hvis aktiviteten af ​​CRM1-medieret eksport er blokeret, kan protein-funktion ændres. Derfor kunne CRM1 inhibitorer anvendes som en ny klasse af målretning terapi mod human cancer. Faktisk til dato, mange små molekyler CRM1 inhibitorer er blevet udviklet og med høj antitumor-aktivitet, såsom leptomycin B (LMB), ratjadone, goniothalamin, N-azolylacrylates, og CBS9106 [11] – [15]. Disse småmolekylære inhibitorer covalent binde til cysteinresten (Cys528) i NES-bindende fordybning af CRM1 protein [16] – [17]. En fase I klinisk forsøg med LMB blev gennemført, men LMB blev ikke anbefalet til videre klinisk udvikling på grund af den høje toksicitet og manglende effekt [18]. Derefter har en række LMB analoger blevet rapporteret med reduceret toksicitet [19].

For nylig er en anden klasse af CRM1 inhibitor blevet identificeret, herunder KPT-185 og KPT-276 (Karyopharm Therapeutics Inc .; Boston , MA, USA). Disse inhibitorer er selektivt hæmmere af nuklear eksport (SINE), og er blevet vist at være effektive til behandling af visse typer af kræft, herunder kræft i bugspytkirtlen, akut myeloid leukæmi, mantle celle lymfom, hvilket resulterer i en betydelig vækst hæmning og apoptose af tumorceller uden svær toksicitet [20] – [22]. I mellemtiden er niveauerne af CRM1 protein forhøjet i lunge cancervæv sammenlignet med normale lungevæv. Således i denne undersøgelse, vi udforskede den terapeutiske effektivitet af disse nye narkotika-lignende CRM1 hæmmere (dvs. KPT-185 og KPT-276) i NSCLC celler

in vitro

in vivo

forhåbentlig give ny indsigt i disse stoffer til fremtidig target terapi af NSCLC.

Materialer og metoder

cellelinjer og reagenser

Den menneskelige NSCLC cellelinjer A549, H1650, H1975 , H2228, og HCC827 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). The H1650 Gefitinib-resistente (H1650GR) cellelinie blev etableret i vores laboratorium ved at eksponere cellen for stigende koncentrationer af gefitinib i 10 måneder. Den resulterende cellelinie H1650GR var resistent over for gefitinib

in vitro

(IC

50 30 uM). De NSCLC cellelinier blev dyrket i RPMI 1640-medium, suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

KPT-185 og KPT-276 blev leveret af Karyopharm Therapeutics. Bortezomib blev opnået fra Selleck Chemicals LLC (Houston, TX, USA). Det fælleseuropæiske caspaseinhibitor Z-VAD-FMK blev indkøbt fra Calbiochem (San Diego, CA, USA). Antistoffer mod EGFR, GAPDH, spaltes-caspase-3, caspase-8, spaltes-caspase-9, poly- (ADP-ribose) polymerase (PARP), survivin, og sekundære antistoffer konjugeret med peberrodsperoxidase (HRP) mod kanin-IgG og muse-IgG blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Desuden blev antistoffer mod CRM1, nuklear faktor kappa let polypeptid genenhancer af B-celler (NF-KB), og IkB-α opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Alle andre reagenser og kemikalier blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Cellelevedygtighed assay

NSCLC-celler blev udpladet ved en densitet på 6.000 celler per brønd i en plade med 96 brønde og dyrket natten over. På den næste dag blev vækstmediet erstattet med frisk medium indeholdende serielle fortyndinger af KPT-185 (op til 10 uM) eller dimethylsulfoxid (DMSO) som kontrol. I dublerede plader blev NSCLC celler eksponeret for KPT-185, gefitinib eller KPT-185 plus gefitinib. Efter at cellerne voksede i op til tre dage blev cellelevedygtigheden målt under anvendelse af et Cell Titer 96® Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Fitchburg, WI, USA). Reagenset blev tilsat til cellerne, og yderligere inkuberet i 3 timer. Absorbansen blev derefter målt ved 490 nm med en mikropladelæser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Dataene blev opsummeret i procent af ubehandlede (DMSO kontrol) celler.

Flowcytometrisk cellecyklus og apoptose-assay

Efter behandling NSCLC-celler med KPT-185 i 48 timer, de blev farvet med propidium iodid (PI) farvning puffer (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) i 30 minutter ved stuetemperatur og derefter målt ved FACS cytometri (BD Biosciences, NJ, USA). DNA-histogrammer blev analyseret ved anvendelse ModFit LT cellecyklusanalyse software (Verify Software House).

Cell apoptose blev påvist med en Alexa Fluor 488 annexin V /Dead Cell Apoptose Kit (Invitrogen) i overensstemmelse med kittets instruktioner. Kort fortalt, efter behandling med KPT-185 i 48 timer, cellerne fra både suspension og adhærens blev opsamlet og co-inkuberet med Annexin V-fluorescein isothiocynate (FITC) og PI, derefter målt ved FACS cytometri (BD Biosciences). Den procentdel af Annexin V og PI negative celler blev bestemt på basis af dot plots af FITC og PI.

RNA isolering og QRT-PCR

Totalt cellulært RNA blev isoleret ved hjælp af RNeasy Mini Kit ( Qiagen, Hilden, NRW, Tyskland) og derefter revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af superscript III første-streng syntese system til RT-PCR (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. CDNA-prøver blev yderligere amplificeret ved Real-time PCR med de følgende syntetiske primere (Invitrogen): CRM1, 5′-GCCTCACTGAGATTGCTGGT-3 ‘og 5′-TGAAGGGCCTCCATAAGAGT-3′; og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ‘og 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’. PCR-betingelserne var sat i en reaktionsblanding 20 pi indeholdende cDNA (2 pi), primere (400 nM hver, 1 pi), og SYBR green mester mix (2 ×, 10 pi) (Invitrogen). cDNA blev amplificeret i en Lightcycler480 Real-time PCR-system (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) med følgende cyklusser: 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 s. Alle prøver blev analyseret i tre eksemplarer og gentaget tre gange. De relative ekspressionsniveauer af CRM1 blev normaliseret til GAPDH ved anvendelse af 2-ΔΔCT metode.

Protein ekstraktion og Western blot-

Efter behandling af celler med KPT-185 i 48 timer, blev cellerne vasket to gange med kold phosphatpuffer saltvand (PBS) og lyseret med NE-PER buffer (Pierce Biotechnology, Waltham, MA, USA) ifølge producentens anvisninger. Supernatanten (helcellelysat) blev kvantificeret og derefter elektroforeret ved anvendelse af natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Proteinerne blev herefter overført til en PVDF-membran (Millipore, Billerica, MA, USA) under anvendelse elektroblotting. Derefter blev membranerne blokeret med 5% tørret skummetmælk i Tris-pufret saltvand plus Tween 20 (TBS-T) i 1 time ved stuetemperatur og derefter inkuberet med et primært antistof ved 4 ° C natten over. Den næste dag blev membranerne vasket med TBS-T tre gange og yderligere inkuberet med et sekundært antistof-HRP-konjugat ved stuetemperatur i 1 time. Efter vask med TBS-T igen, blev påvist proteinerne bands med Immobilon Western HRP detektionssubstrat (Millipore). Positive billeder blev optaget med et chemiluminescens instrument (ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA).

immunfluorescensmikroskopi

lokalisering og udtryk CRM1, EGFR, IKB-α, NF-KB og p53 blev påvist i nærvær og fravær af KPT-185 ved immunfluorescens mikroskopi. NSCLC-celler blev behandlet med KPT-185 i 48 timer og fikseret i 30 minutter med 4% paraformaldehyd. Dernæst cellemembraner var permeabilisering ved behandling med Triton X-100 (0,1% vægt /volumen) i PBS i 15 min. Efter blokering med blokerende buffer sammensat af 5% normalt gedeserum i 1 time blev celler behandlet med primært antistof i 1 time. Efter vask med PBS blev cellerne behandlet i 1 time med et sekundært FITC-konjugeret antistof og DAPI. Fotomikrografi billederne blev optaget ved hjælp af en fluorescens mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

Mus NSCLC celle xenograft assay

Fire uger gammel kvinde ikke-overvægtige diabetiske-svær kombineret immundefekt (NOD -SCID) mus blev indkøbt fra Institut for Zoologi, kinesiske Academy of Sciences, og subkutant podet i flanken region med en suspension af H1975 celler (5,0 x 10

6 celler). Tumorvolumener blev målt tre gange ugentligt og blev beregnet ved hjælp af følgende formel: volumen (mm

3) = (bredde (mm))

2 × længde (mm) /2. Når tumorvæksten var stabil (gennemsnitlig størrelse på 100 mm

3), blev mus randomiseret i 3 grupper og oralt behandlet med vehikel (Pluronic F-68 /PVP-K29 /32), gefitinib (100 mg /kg qd i 3 uger) eller KPT-276 (100 mg /kg 3 gange om ugen i 3 uger) [22]. Vækstkurver af tumorcellelinier xenotransplantater blev frembragt ved at plotte de gennemsnitlige relative tumorstørrelser +/- SE. Ændringer i legemsvægt (målt tre gange ugentligt) blev udtrykt som et forhold i forhold til vægten lige før den første behandling. Mus blev aflivet, når den endimensionale tumordiameter nåede 15 mm eller efter tab af 10% af deres kropsvægt. Betydningen af ​​disse forskelle blandt forskellige grupper blev evalueret ved anvendelse af en ANOVA-test. Protein- niveauerne af CRM1, EGFR og survivin i xenotransplantattumorer blev påvist ved immunhistokemi. Denne undersøgelse blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg af Cancer Institute /Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences.

Resultater

Hæmning af NSCLC cellelevedygtighed af KPT-185

for at vurdere antitumoraktiviteten af ​​CRM1 inhibitoren KPT-185, udførte vi cellelevedygtigheden assays i seks humane NSCLC cellelinier. Celler blev behandlet med serielle fortyndinger af KPT-185 fra 1 nM til 10 uM i 2 og 3 dage. Dataene viste, at KPT-185 reducerede NSCLC cellelevedygtighed på en dosis- og tidsafhængig måde med en IC

50 fra 1,3 nM til 46 pM (figur 1A-F). I denne undersøgelse hver NSCLC cellelinie repræsenterede en forskellig molekylær undertype af NSCLC. Interessant, KPT-185 hæmmede ligeledes levedygtigheden af ​​EGFR-TKI-resistente H1975 og H1650GR celler og EGFR-TKI-sensitive HCC827 celler, hvilket indikerer, at KPT-185 kan være en god kandidat til en effektiv kontrol af EGFR-TKI-resistente lungekræft . Desuden viste vores data, at der ikke var nogen synergistisk effekt mellem KPT-185 og EGFR-TKI (gefitinib) behandling på tumorceller levedygtighed hæmning (figur 1G H).

Seks NSCLC cellelinjer blev behandlet med KPT-185 i 48 timer eller 72 timer. Cellelevedygtighed blev undertrykt af KPT-185 på en dosis- og tidsafhængig måde (A~F). KPT-185 inhiberede cellelevedygtighed i H1975 (G) og HCC827 (H) celler sammenlignet med effekten af ​​EGFR-TKI gefitinib behandling. (N = 3).

Induktion af NSCLC cellecyklusstop af KPT-185

For at afgøre, om reduktionen af ​​cellernes levedygtighed efter KPT-185 behandlingen var forbundet med ændringer i celle cyklus distribution i NSCLC celler, vi analyserede cellecyklus i NSCLC celler efter 24 timer behandling med KPT-185. Sammenlignet med kontrolcellerne, KPT-185 behandling standset NSCLC celler i G1-fasen af ​​cellecyklussen. Men denne konklusion ikke forekomme i H2228 celle, der ikke var følsom over for KPT-185 behandling (figur 2).

Cellerne blev arresteret i G1 fasen af ​​cellecyklus i KPT-185 sensitive celler. (N = 3).

Induktion af NSCLC celle apoptose af KPT-185

Siden KPT-185 behandling induceret NSCLC cellecyklusstop i G1 fasen af ​​cellecyklus, vi besluttet, om KPT-185 induceret NSCLC celle apoptose. Faktisk viste vores data, at KPT-185 behandling i 48 timer øgede niveauer af Annexin V-farvning på en dosis-afhængig måde, hvilket indikerer celle apoptose (figur 3A). Desuden KPT-185 behandling induceret H1975 celler til at undergå apoptose, men gefitinib ikke have en effekt. I mellemtiden, både KPT-185 og gefitinib induceret apoptose i HCC827 celler (figur 3B, 3C 3D). Desuden behandler celler med KPT-185 og gefitinib resulterede ikke i en synergistisk virkning på celle apoptose.

De seks NSCLC cellelinier blev behandlet med KPT-185 og derefter tumorcelle apoptose blev vurderet med flowcytometri assay . Data indikerer en dosisafhængig induktion af celleapoptose efter 48 timers behandling (A). KPT-185 inducerede apoptose i H1975 (B) og HCC827 (C) -celler sammenlignet med EGFR-TKI gefitinib behandling. En repræsentative data for apoptose assay i H1975 celler blev vist (D). (N = 3).

nedregulering af CRM1 og andre proteiner i NSCLC celler ved KPT-185

Dernæst analyserede vi effekten af ​​KPT-185 om reguleringen af ​​CRM1expression i NSCLC celler. Niveauet af CRM1 protein blev tydeligt reduceret efter behandling med KPT-185 i alle seks NSCLC cellelinjer sammenlignet med kontrolceller (figur 4A). Men niveauet af CRM1 mRNA var højere i H1975, HCC827 og H1650GR celler efter behandling med KPT-185 end kontrolcellerne (figur 4B), hvilket indikerer, at reduktionen af ​​CRM1 protein ved KPT-185 var ikke på det transskriptionelle niveau. Vi undersøgte derefter, om KPT-185-reducerede CRM1 proteinekspression skyldtes aktiveringen af ​​ubiquitin /proteasom-vejen. H1975, HCC827, og H1650GR celler blev behandlet med KPT-185 i nærvær eller fravær af bortezomib (10 nM; proteasominhibitor) i 48 timer. I nærvær af bortezomib blev reduktionen af ​​CRM1 protein ved KPT-185 næsten blokeret (figur 4C), hvilket antyder, at KPT-185-induceret CRM1 udtømning kræver aktivering af ubiquitin /proteasom-vejen. Vi vurderede derefter niveauerne af forskellige proteiner, der er vist til at blive eksporteret af CRM1, såsom EGFR, p53, og IKB-α. KPT-185 behandling også reduceret EGFR i alle seks NSCLC cellelinier (figur 4D Figur S1). Der var imidlertid ingen signifikant ændring i niveauerne af NF-KB og IKB-α i disse celler, men IKB-α og NF-KB blev akkumuleret i kernen i KPT-185 behandlingsgruppen sammenlignet med kontrolgruppen (figur 4D, 4E fig S1). Interessant efter behandling med KPT-185 blev niveauet af p53 opreguleret i A549-celler, som har en vildtype p53, hvorimod p53-protein blev nedreguleret og begrænses til Nucleus i H1975-celler, som har et muteret p53-protein (figur 4D 4E). I mellemtiden var der ingen ændring i p53-protein-niveauer i både HCC827 og H2228-celler og p53-protein kunne ikke påvises i H1650 og H1650GR celler (figur 4D).

De seks NSCLC cellelinier blev behandlet med KPT- 185 i 48 timer. Ekspressionen af ​​CRM1 protein blev nedreguleret (A 0,05, figur 6A). Musene tolererede den oralt administrerede KPT-276 (100 mg /kg) behandlinger, som angivet ved en gennemsnitlig 6,64% vægttab (figur 6B). Desuden kemoterapi-lignende bivirkninger, såsom diarré, blev ikke observeret. Protein- niveauerne af CRM1, EGFR og survivin i xenotransplantattumorer blev påvist ved immunhistokemi. Ekspressionen af ​​CRM1 blev nedreguleret, og CRM1 var begrænset til kernen på KPT-276 behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollen og gefitinib behandlingsgruppe (figur 6C). Ekspressionen af ​​EGFR og survivin blev nedreguleret i KPT-276 behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollen og gefitinib behandlingsgruppe (figur S2).

NSCLC H1975-celler blev transplanteret ind i NOD-SCID-mus. Mus med en etableret NSCLC celle xenograft blev oralt administreret med køretøj, gefitinib eller KPT-276. Tumorcelleresistens xenograft vækst blev vurderet i 30 dage. Tumorvækstkurver viste en statistisk signifikant suppression af H1975 cellevækst in vivo, når sammenlignet med vehikel eller gefitinib behandling (

P

0,05; A). Mus indgivet oral KPT-276 (100 mg /kg, tre gange om ugen i tre uger) tolereret behandling brønd (B). Proteinet niveau CRM1was påvist i xenotransplantattumorer ved immunhistokemi (C, 400 ×).

Diskussion

I denne undersøgelse har vi undersøgt den terapeutiske effektivitet af nye lægemiddelkandidater-lignende CRM1 hæmmere i NSCLC celler

in vitro

in vivo

. Resultaterne viste, at SINE CRM1 inhibitoren KPT-185 reducerede NSCLC cellelevedygtighed og induceret dem til at undergå apoptose på en dosis-afhængig måde. KPT-185 udviste også en stærk antitumoraktivitet i EGFR-TKI-resistente NSCLC cellelinier. Desuden KPT-185 også induceret cellecyklusstop ved G1 /S checkpoint i KPT-185-sensitive NSCLC cellelinjer, nedreguleret niveauer af CRM1 og EGFR protein, akkumuleret p53, IKB-α og NF-KB i kernen, og aktiverede caspase-8, 3 og 9-proteiner i NSCLC-celler. Oral indgivelse af KPT-276 inhiberede signifikant tumor xenograft vækst i H1975-bærende NOD-SCID-mus, som var resistente over for EGFR-TKI behandling. Vigtigst musene tålte KPT-276 behandling med minimal tab af kropsvægt og uden alvorlig toksicitet. Yderligere undersøgelser vil vurdere de underliggende molekylære mekanismer i KPT-185 anti-tumor aktivitet i et klinisk forsøg for NSCLC patienter.

Faktisk seneste undersøgelser har vist, at CRM1 overekspression er forbundet med tumor progression og dødelighed i flere humane kræftformer [23]. For eksempel viste Zhang at CRM1 siRNA førte til CRM1 knockdown protein og reduceret mantle-celle lymfom (MCL) cellelevedygtighed, og Sines induceret CRM1 protein translokation ind i kernen, hvor dens udtryk blev nedreguleret [22]; således disse data syntes at være modsat tidligere CRM1 hæmmere [13], [14], [24], [25]. I den aktuelle undersøgelse, vi demonstreret, at KPT-185 reducerede NSCLC cellelevedygtighed, apoptose, og standset NSCLC celler ved G1-fasen af ​​cellens cyklus. Disse data er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser om CRM1 inhibitorer i forskellige menneskelige kræftformer [13], [14], [22] – [25]. Vores nuværende data viste endvidere, at SINE-inhibitor KPT-185 nedreguleret CRM1 protein niveauer i NSCLC celler gennem KPT-185-induceret proteasom nedbrydning af CRM1 protein. Således er en mulig cytotoksisk mekanisme CRM1 inhibitorer er via ubiquitin /proteasom-vejen, hvilket reducerer eksport af tumor suppressor proteiner (TSP) fra kernen til cytoplasmaet, såsom p53, IkB-α og NF-KB. Etchin et al. endvidere dokumenteret, CRM1 inhibitorer kunne binde til rillen af ​​CRM1 protein, der normalt var besat af NES, og blokere CRM1-rettet protein eksport [21].

En række undersøgelser har vist, at NF-KB-aktivering er vigtigt at opretholde tumor cellelevedygtighed, og inhibering af NF-KB-aktivitet alene er tilstrækkelig til at inducere celledød [26], [27]. Men i vores nuværende undersøgelse, vi ikke observere væsentlige ændringer i NF-KB og IKB-a ekspressionsniveauer i NSCLC celler efter KPT-185 behandling, men IKB-α og NF-KB blev delvist akkumuleret i kernen i KPT-185 behandlingsgruppe. CRM1 vides at eksportere vildtype p53 fra kernen til cytoplasmaet af cancerceller via dets C-terminale NES, der giver mulighed for effektiv nedbrydning af p53 ved proteasomer. I vores nuværende undersøgelse fandt vi, at inhibering af CRM1 aktivitet ved KPT-185 forhindrede p53 i at forlade kernen, hvilket resulterer i ophobning nukleare p53 og stabilisering i p53 bred typen NSCLC A549-celler. I H1975 celler, som har en mutant p53, KPT-185 behandling nedreguleret p53-niveauer og begrænses p53 til nucleus. Desuden p53 niveauer var stabile i både HCC827 og H2228-celler, hvilket antyder, at apoptose i disse celler er p53-uafhængig. Overraskende, p53 var ikke påvises i H1650 og H1650GR celler. The H1650 cellelinien er tidligere blevet beskrevet som en cellelinje der bærer mutant type p53 [28].

EGFR regulerer vigtige tumorgene processer, herunder proliferation, apoptose modstand, angiogenese og invasion, og ofte overudtrykkes under udviklingen og progression af NSCLC [29]. EGFR kan påvises i kernen og eksporteres til cytoplasmaet ved CRM1. I vores undersøgelse, vi viste, at EGFR blev reduceret efter KPT-185-reducerede CRM1 ekspression i NSCLC celler. Noske et al. [30] viste omvendt sammenhæng af EGFR med CRM1 udtryk i kræft i æggestokkene væv. Niveauer af EGFR-proteinekspression blev reduceret efter eksponering af ovariecancerceller at leptomycin B (LMB), hvilket antyder, at CRM1 spiller en rolle i den intracellulære transaktivering af EGFR [30]. I modsætning hertil Lo et al. påvises et forhøjet nuklear EGFR niveauer efter LMB behandling i humane epidermoide carcinom A431-celler [31], hvilket indikerer, at øget nuklear EGFR ved LMB tilvejebringer en plausibel mekanisme, ved hvilken cellerne shuttle celleoverflade-EGFR gennem kerneporen kompleks og i det nukleære rum.

Survivin er medlem af inhibitorer af apoptose familie og beskytter mod apoptose ved enten direkte eller indirekte inhibere aktiveringen af ​​caspaser [32]. PARP er et substrat for caspase og dets aktivering fører til apoptose. I vores nuværende undersøgelse KPT-185 var i stand til at aktivere caspase-8, -9 og -3, PARP, men inhiberer survivin i alle seks NSCLC cellelinier. Vores nuværende data viste også, at KPT-185 var i stand til at inducere apoptose i både EGFR-TKI-følsomme og resistente NSCLC celler. Desuden fandt vi, at den pan-caspaseinhibitoren Z-VAD-FMK helt forhindrede KPT-185-induceret apoptose i H1975 celler. Vores resultater viste, at SINE-induceret apoptose var afhængig af caspaseaktivering i NSCLC-cellelinier.

KPT-185 har vist sig at besidde uegnede farmakokinetiske egenskaber

in vivo

, enten subkutant eller oralt. Imidlertid KPT-276, strukturelt beslægtet med KPT-185, er egnet til oral terapi [22]. Mutka et al. bemærkede, at LMB har off-target effekter mod andre end CRM1 proteiner, og at disse off-target effekter kunne bidrage til LMB s bivirkninger (ca. 20% krop vægttab) [33]. I vores nuværende undersøgelse har vi udnyttet KPT-276 i en dosis på 100 mg /kg tre gange om ugen i tre uger til at behandle mus, der bærer NSCLC tumor celle xenotransplantater. Vi fandt, at disse mus tålte (mindre end 10% vægttab) behandlingen. Desuden KPT-276 udviste høj antitumoraktivitet i EGFR-TKI-resistente NSCLC cell xenotransplantater. Disse resultater indikerer, at KPT-276 kan være en nyttig CRM1 hæmmer til klinisk behandling af NSCLC-patienter, især for EGFR-TKI-resistente patienter.

Støtte Information

Figur S1.

lokalisering og ekspression af EGFR, IKB-α, og NF-KB blev påvist i nærvær og fravær af KPT-185 ved immunfluorescens mikroskopi. Ekspressionen af ​​EGFR blev nedreguleret, og IKB-α og NF-KB blev akkumuleret i kernen i KPT-185 behandlingsgruppen sammenlignet med kontrolgruppen (400 ×)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0089848.s001 Hotel (TIFF)

figur S2. Salg The proteinniveauer af EGFR og survivin blev detekteret i xenotransplantattumorer ved immunhistokemi. Ekspressionen af ​​EGFR og survivin blev nedreguleret i KPT-276 behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollen og gefitinib behandlingsgruppe (400 ×)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0089848.s002

(TIF)

tak

Vi vil gerne takke Karyopharm Therapeutics Incorporated selskab for at give KPT SINE forbindelser, og professor Michael Wang og Liang Zhang fra University of Texas MD Anderson Cancer center, Houston Texas, USA, til kritisk kommentarer.

undersøgelsen blev præsenteret som en plakat på AACR 2013 årlige møde i Washington DC, USA (Abstract # 3444).