PLoS ONE: Drug-Tolerant Cancer Cells Vis Reduceret tumorfremkaldende Kapacitet: Udtømning af CD44 + celler og Beviser for Epigenetisk Mechanisms

Abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) besidder høj tumor-initierende kapacitet og er blevet rapporteret at være resistente over for terapeutiske midler. Vice versa, terapi-resistent cancerceller synes at manifestere CSC fænotyper og egenskaber. Det er generelt blevet antaget, at lægemiddelresistente kræftceller alle kan være CSCS selvom den generelle anvendelse af denne antagelse er ukendt. Her har vi kronisk behandlet DU145 prostatacancerceller med etoposid, paclitaxel og nogle eksperimentelle lægemidler (dvs. STAUROSPORIN og 2 paclitaxel analoger), hvilket førte til populationer af narkotika-tolerante celler (DTC). Overraskende, udstillet disse dobbeltbeskatningsoverenskomster, når implanteret enten subkutant eller ortotopisk i NOD /SCID-mus, meget reduceret tumorgenicitet eller var endda ikke-tumorigen. Drug-tolerant DLD1 kolon kræftceller udvalgt af en lignende kronisk udvalg protokol også vist reduceret tumorgenicitet mens narkotika-tolerant UC14 blære kræftceller demonstreret enten steget eller faldet tumor-regenererende kapacitet. Drug-tolerant DU145 celler viste lave proliferative og klonogene potentiale og var stort set blottet for CD44

+ celler. Fremadrettet knockdown af CD44 i DU145 celler hæmmet celledeling og tumor regenerering, mens restaurering af CD44-ekspression i narkotika-tolerante DU145 celler øget celledeling og delvist forøget tumorgenicitet. Interessant, viste narkotika-tolerant DU145 celler både stigninger og fald i mange “stemness” gener. Endelig blev dokumenteret, at kronisk eksponering narkotika genereret dobbeltbeskatningsoverenskomster via epigenetiske mekanismer, der involverer molekyler såsom CD44 og KDM5A. Vores resultater viser således, at en) ikke alle dobbeltbeskatningsoverenskomster nødvendigvis CSCS; 2) traditionelle kemoterapeutiske lægemidler, såsom taxol og etoposid kan direkte målrette CD44

+ tumor-initierende celler; og 3) dobbeltbeskatningsoverenskomsterne genereres via kronisk lægemiddeludvælgelse involverer epigenetiske mekanismer

Henvisning:. Yan H, Chen X, Zhang Q, Qin J, Li H, Liu C, et al. (2011) Drug-Tolerant Cancer Cells Vis Reduceret tumorfremkaldende Kapacitet: Udtømning af CD44

+ Celler og Beviser for Epigenetisk mekanismer. PLoS ONE 6 (9): e24397. doi: 10,1371 /journal.pone.0024397

Redaktør: Amit Singh, University of Dayton, USA

Modtaget: Juli 5, 2011; Accepteret: August 8, 2011; Udgivet: 15 September, 2011

Copyright: © 2011 Yan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret af National Institutes of Health (NIH) R01-ES015888, NIH 1R21CA 150.009, Department of Defense, W81XWH-08-1-0472, Department of Defense, W81XWH-11-1-0331, Elsa Pardee Foundation, MDACC center for Cancer Epigenetik. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cancer stamceller (CSC) koncept, at tumorer indeholder dæmme-lignende kræftceller, blev foreslået årtier siden og for nylig genoplivet til at forklare den cellulære heterogenitet i tumoren. Et af de vigtigste kriterier for at definere CSCS er deres forbedrede evne til at regenerere transplanterbare tumorer, som histologisk rekapitulere fænotypiske heterogenitet af forældremyndigheden tumor [1]. Som sådan er CSCS ofte kaldes tumor-initierende celler. CSCS blev først identificeret i leukæmi og, siden 2003, er blevet rapporteret i mange humane solide tumorer, herunder gliom [2], Ewings sarkom [3], og kræft i brystet [4], [5], kolon [6] – [ ,,,0],12], bugspytkirtel [13], [14], lever [15] – [17], mave [18], lunge [19], [20], hoved og hals [21], nyre [22], og æggestok [ ,,,0],23], [24].

Montering tyder på, at CSCS kan være mere modstandsdygtige over for anticancer-midler, som vist i leukæmiske [25] og myelomatose [26] stamceller. CD133

+ CSCS stigning efter strålebehandling og bidrage til glioblastoma radioresistance gennem præferentiel aktivering af DNA beskadigelse checkpoint respons og en stigning i DNA-reparation kapacitet [27]. Den CD44

+ CD24

lo /- bryst CSCS er beriget med brystkræftpatienter, der har modtaget adjuverende kemoterapi [28] og mere modstandsdygtige over for nogle kemoterapeutiske stoffer [29]. I musemodeller for brysttumorer, er CSCS også vist sig at være resistente over for cisplatin behandling [30]. Endvidere kemoresistent coloncancerceller vise CSC fænotyper [31] og CD133

+ hepatiske CSCS er kemoresistent grund præferentiel aktivering af Akt pathway [32]. Disse nye fund fremhæver potentielle inddragelse af CSCS i terapi modstand og i sygdomstilbagefald. Det er blevet antaget, at narkotika-resistente kræftceller kan alle beriget med CSCS selv om den generelle anvendelighed af denne antagelse forbliver uprøvet.

immunhistokemisk farvning [33], [34], klonogene assays [35], [36 ], samt tumor transplantation eksperimenter [37] – [41] har fremlagt beviser, at menneskelig prostatakræft (PCA) indeholder også stamceller-lignende celler. Vores systematiske studier i xenograftmodeller indikerer, at PCA-celler er heterogene med hensyn til deres tumorfremkaldende strøm med CD44

+ cellepopulation der huser både hvilende CSCS og hurtigt prolifererende tumor progenitorer [38], [42]. En brøkdel af CD44

+ PCA celler er langsomme-cykling, kan tilsyneladende undergår selvfornyelse, fortrinsvis udtrykke ‘stemness’ gener, og besidder høj tumorigene og metastatiske potentialer. CSCS kan yderligere beriges ved hjælp CD44

+ α2β1

hi markør profil [39] og PCA celle holoclones, hvor de fleste celler er CD44

+ α2β1

hej, indeholder selvfornyende tumor-initierende celler [41]. Vores seneste arbejde viser, at Nanog, afgørende for selvstændige fornyelse og pluripotens af ES-celler, der er beriget med CD44

+ PCa cellepopulationen og funktionelt nødvendig for tumor udvikling [43]. Faktisk inducerbar Nanog ekspression er tilstrækkelige til at udstyre CSC fænotypiske og funktionelle egenskaber og fremme kastrationsresistent PCa udvikling [44]. Et centralt ubesvarede spørgsmål er, om stamceller-lignende PCA celler kan opføre sig som nogle andre CSCS er modstandsdygtig over for lægemidler, eller alternativt om narkotikabehandling ville berige PCa-initierende celler. Her rapporterer vi de uventede fund, at nogle lægemiddel-tolerant cancerceller er langt mindre tumorigen eller endog ikke-tumorigen. Overraskende narkotika-tolerante DU145 PCA cellekulturer er blottet for CD44

+ celler, som i det mindste delvist, tegner sig for deres reducerede tumorgenicitet.

Materialer og metoder

Animal-relaterede undersøgelser er blevet godkendt af MD Anderson Cancer center Institutional IACUC udvalg (ACUF 08-05-08132). Alle andre undersøgelser præsenteret heri var den investigator-initieret og ikke kræver godkendelse fra andre tilsynsmyndigheder.

Cells, reagenser og dyr

DU145, PC3 og UC14 celler blev opnået fra ATCC og dyrket i RPMI indeholdende 7% varmeinaktiveret FBS, 100 pg /ml streptomycin og 200 U /ml penicillin (Gibco). DLD1 celler blev opnået fra ATCC og dyrket i DMEM indeholdende 7% FBS med antibiotika. Etoposid (VP16) og paclitaxel blev indkøbt fra Sigma. Doxorubicin (Dox) og STAUROSPORIN (STS) blev købt fra Biomol. WP1102 og WP1103 blev to nyligt syntetiserede paclitaxel-analoger med substitutioner ved den 2′-OH (fra Priebe gruppe; detaljer vil blive offentliggjort andetsteds). Primære antistoffer, der anvendes i den aktuelle undersøgelse omfattede: kanin mAb til CD44 (Abcam) for vestlige blotting (1:1,000), mus mAb til CD44 (BD Pharmingen) til immunfarvning (1:500), mus mAb til ABCG2 (Abcam; 1: 500), kanin pAb til Bcl-2 (Santa Cruz, 1:500), mus mAbs til p21 og p27 (Santa Cruz, 1:1,1000 for begge), kanin pAb til hTERT (Santa Cruz, 1:100), kanin mAb til GAPDH (Cell Signaling, 1:2,000) og mAb til p-actin (Cell Signaling, 1:1,000). Sekundære antistoffer blev købt fra GE Healthcare og ECL Plus reagenser var fra PerkinElmer Inc. NOD /SCID-mus blev oprindeligt indkøbt fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) og ynglekolonier etableret i vores dyr facilitet og vedligeholdes i standardbetingelser i henhold til den institutionelle retningslinier.

Etablering af narkotika-tolerante celler (DTCs) og bestemmelse af IC

50 værdier

DU145, DLD1, og UC14 celler blev oprindeligt udsat for forskellige stoffer, i firdobbelte brønde ved en række koncentrationer, dvs. 0, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 0,1 pM, 0,5 pM, 1 pM, 2 pM, 4 pM, og 10 uM. Lægemidler blev genopfyldes hver 3 dage, og celler blev behandlet kontinuerligt i 2 uger. Cell overlevelse og død blev nøje overvåget under en omvendt fase-kontrast mikroskop. Ved slutningen af ​​en 2-ugers behandling, “optimale” drug blev bestemt på grundlag af kriteriet om, at narkotika viste signifikante hæmmende effekt på celle ekspansion, men ikke helt dræbe hele befolkningen (-90% celledræbende). Hele forsøget blev gentaget en gang. Disse eksperimenter førte til bestemmelsen af ​​optimale koncentrationer (angivet i teksten). Derefter cancerceller blev kontinuerligt dyrket i medium indeholdende den optimale koncentration af lægemidler i mindst 3 måneder til at etablere de dobbeltbeskatningsoverenskomster, der blev betegnet som DU145-VP16-celler, DU145-paclitaxel-celler, så videre og så videre. De dobbeltbeskatningsoverenskomster blev rutinemæssigt dyrket i medium, der indeholder de optimale koncentrationer af de enkelte stoffer.

For at bestemme de halvt maksimale koncentrationer af hæmning (dvs. IC

50) af forældrenes kræftceller og dobbeltbeskatningsoverenskomsterne, 2,5- 3,0 × 10

5-celler blev udpladet i fire eksemplarer i 24-brønds plader. Efter dyrkning natten over blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af den første udvælgelse lægemiddel eller ikke-udvælgelse lægemidler (for at undersøge potentielle krydsresistens) i 24-48 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev antallet af levedygtige celler talt under anvendelse trypanblåt assays og GraphPad prisme 5.0-software blev anvendt til at analysere data og beregne IC

50 værdier.

Klonale og BrdU-inkorporering assays, immunofluorescens, og immunoblotting

Grundlæggende procedurer for disse eksperimenter er blevet beskrevet i vores tidligere publikationer [37] – [39], [43] – [45]. Til bestemmelse af samlet celleantal blev 5000 celler udpladet in triplo eller firdobbelt i 12-brønds plader og dyrket i 10 dage, med frisk medium tilført hver 3. dag. Ved afslutningen blev antallet af levedygtige celler talt under anvendelse trypanblåt. For BrdU-assays blev celler udpladet i tre eksemplarer på dækglas (10.000 celler /dækglas) natten over og derefter pulseret med 10 uM BrdU i 4 timer. Ved afslutningen blev cellerne fikseret i 4% paraformaldehyd indeholdende 5% sucrose i 10 minutter. Celler blev inkuberet i 20 minutter i 1% Triton-100 og derefter denatureret, neutraliseret, blokeret og inkuberet med monoklonalt anti-BrdU-antistof (1:100) i 1 time ved 37 ° C efterfulgt af gede-anti-muse-IgG-Alexa Fluor 594 (30 min ved 37 ° C). I alt 500-1000 celler blev talt pr dækglas og to dækglas blev talt for hver celletype at bestemme procentdelen af ​​prolifererende (dvs. BrdU

+) celler.

I klonal analyse, 100 celler var udpladet i tredobbeltbestemmelse i 6-brønds plader og dyrket i 10 dage med frisk medium fodret hver 3. dag. I slutningen begge holoclones og meroclones [41] blev optalt, og resultaterne blev præsenteret som kloning effektivitet. Paraclones indeholdt store og aldrende celler [41], og generelt havde 20 celler og derfor ikke blev kvantificeret. Immunofluorescens-farvning af CD44 blev udført som beskrevet [38], [45]. Til Western blotting. parental DU145 og forskellige lægemiddel-tolerant DU145 celler blev høstet til fremstilling helcellelysat i Western blotting-analyse af molekylerne, der er angivet i figuren paneler. I nogle eksperimenter blev DU145-VP16-celler først behandlet med forskellige koncentrationer af Trichostatin A (TSA) eller 5′-aza-deoxycytidin (Aza) i 72 timer. Salg

Etablering af GFP-mærket lægemiddel-tolerant DU145 celler

Kort fortalt 293FT emballage celler [43] blev transficeret med pLL3.7-GFP lentiviral vektor [43] sammen med emballage plasmider ved anvendelse lipofectamin. Virusholdige medium blev opsamlet 48-72 timer senere, centrifugeret ved 3000 omdrejninger, passeres gennem et 0,45 um filter til fjernelse af snavs og endelig underkastes ultracentrifugering (20.000 rpm x 2 timer ved 4 ° C). Drug-tolerant DU145-celler blev derefter inficeret med virus ved MOI (infektionsmultiplicitet) på 20-25.

Subkutan (sc) og ortotopisk tumor eksperimenter

Grundlæggende procedurer blev beskrevet tidligere [37 ] – [39], [41], [43], [46]. Kort fortalt blev forældre- og lægemiddel-tolerant DU145 (og andre) celler ved forskellige numre injiceret i 50% Matrigel s.c ind flankerne af NOD /SCID-mus. Når den største tumor (er) i enhver gruppe skal afsluttes med IACUC regler eller tumor-bærende dyr blev døende, blev alle dyr i denne gruppe ofret og tumorer høstet. For orthotopisk implantation blev dyrene bedøvet, og celler blev injiceret i en 20-pi medium-Matrigel blanding (01:01) i den dorsale prostata. Når tumorbyrde blev klart (ved palpering), blev forsøget afsluttet, dyrene aflivet, og primære tumorer sammen med flere organer (dvs. lunge, lever, milt, pancreas, nyre, etc) blev dissekeret og undersøgt for mikro- og macrometastasis (dvs. GFP

+ foci) under et Nikon epifluorescens mikrodissektion mikroskop.

CD44 knockdown eksperimenter

shRNA-medieret knockdown blev udført som for nylig beskrevet [43], [46]. Kort fortalt blev 293FT pakkeceller transficeret med enten pGIPz CD44-shRNA lentiviral vektor eller pGIPz-NS kontrolvektor. Den virusholdige dyrkningsmedium blev opsamlet 72 timer efter transfektion, centrifugeret ved 3000 omdrejninger, filtreret gennem et 0,45 um-sprøjtefilter, og endelig underkastes ultracentrifugering (20.000 rpm x 2 timer ved 4 ° C). Den virale pellet blev rekonstitueret i OPTI-MEM-medium og anvendes til at inficere HT1080 fibrosarcomceller at bestemme den virale titer. Derefter blev DU145 celler inficeret med pGIPz-NS eller pGIPz-CD44shRNA vira ved en MOI på 20, og, 24-48 timer senere, blev anvendt i enten in vitro karakteriseringer eller in vivo-tumor-eksperimenter.

CD44 overekspression eksperimenter

Den grundlæggende retroviral procedure blev beskrevet tidligere [45]. Kort fortalt blev retrovirale vektorer, herunder styrevektor pBabe-GFP og pBabe-CD44 (Addgene, Cambridge, MA) transficeret ind i ampho-Phoenix 293-celler (ATCC). 48-72 timer efter transfektion blev virusholdige dyrkningsmedium opsamlet, centrifugeret ved 3000 omdrejninger, filtreret gennem et 0,45 um-sprøjtefilter, og endelig underkastes ultracentrifugering (22.000 rpm x 2 timer ved 4 ° C). Den virale pellet blev rekonstitueret i OPTI-MEM-medium og anvendt til at inficere lægemiddel-tolerante DU145-celler i 24-48 timer, som derefter blev anvendt i både in vitro og in vivo forsøg.

Terapeutisk behandling af ortotopisk PC3 tumorer med paclitaxel

Den grundlæggende procedure for terapeutiske eksperimenter blev for nylig beskrevet [46]. Kort fortalt blev PC3-GFP-celler implanteret i den dorsale prostata (DP) af mandlige NOD /SCID-mus (500.000 celler /DP; n = 10). Tre uger senere blev 5 dyr per gruppe injiceret intravenøst, med 15 mg /kg legemsvægt af paclitaxel eller vehikelkontrol (PBS). Injektionerne blev gentaget hver uge i to uger mere (dvs. i alt 3 injektioner) blev og dyr afsluttet 49 dage efter tumorcelleimplantation. DP tumorer blev dissekeret ud, afbildes og vejet henviser flere organer, herunder lunge, bugspytkirtel, lymfeknude, lever og hjerne, blev undersøgt for metastase på en dissekere epifluorescensmikroskop [46].

Analyse af ‘stemness’ genekspression profiler ved kvantitativ revers transkriptase – polymerasekædereaktion (qPCR)

Den grundlæggende procedure for qPCR-analyse blev for nylig beskrevet [44], [46]. Kort beskrevet blev totalt RNA ekstraheret fra DU145 og DU145-VP16-celler under anvendelse af et RNeasy RNA-oprensningskit (Qiagen, Valencia, CA). ABI High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) og vilkårlige hexamerer blev anvendt til cDNA-syntese. qPCR blev udført ved M.D. Anderson Science-Park Molecular Biology Core Facility ved anvendelse af en ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). File Builder 3.1 software (Applied Biosystems) blev anvendt til at designe PCR-primere og prober. Humane genspecifikke primerpar blev anvendt til ekspression profilering af SYBR® Green metoden. Den eksperimentelle Ct (tærskel cyklus) blev kalibreret mod denne af 18S kontrol produkt. Alle amplifikationer blev udført tre gange. Den DDCt fremgangsmåde blev anvendt til at bestemme mængden af ​​genprodukt i forhold til den, der udtrykkes i parentale DU145 celler (1-fold, 100%).

Statistiske analyser

GraphPad prisme 5.0-software og F- testen blev brugt til at sammenligne IC

50 værdier. Uparret

t

-test blev anvendt til at sammenligne forskelle i celleantal, BrdU

+% celler, kloning effektivitet, CD44

+% celler og tumor vægte. Fishers eksakte test blev anvendt til at sammenligne forekomsten og latenstid.

Resultater

Kronisk subletal lægemiddelbehandling førte til lægemiddel-tolerant cancerceller

Klinisk mange kræftpatienter ofte behandlet kronisk af anticancer-midler. Det bedste eksempel er måske CML (kronisk myeloid leukæmi) patienter, der skal tage imatinib (Gleevec) kontinuerligt i år [47]. Desuden metronomisk kemoterapi – er en form for kemo administration præget af hyppige, ofte dagligt, udvidet administration af små doser af konventionelle chemodrugs uden væsentlige pauser [48], fremstår som en standard terapeutiske regime for mange kræftformer. Baseret på de forudsætninger, CSCS kan have en særlig fordel af overlevende lægemidler og sandsynligvis de celler, der medierer resistens, vi testede, om kræftceller, der har overlevet KRONISK narkotikabehandling alle kan have CSC egenskaber. Vi først behandlet DU145 prostatacancer (PSA) celler med to kliniske lægemidler, dvs. etoposid (VP16) og paclitaxel (Taxol) samt tre eksperimentelle lægemidler, STAUROSPORIN (STS), en promiskuøs proteinkinasehæmmer, og to nyligt syntetiserede paclitaxelanaloger betegnes WP1102 og WP1103 (detaljer, der skal fremlægges andetsteds). Som beskrevet i Methods, vi først behandlet DU145 celler med disse fem stoffer på en afstand af 10 koncentrationer i 2 uger for at bestemme de “optimale” subletale koncentrationer, hvor lægemidler signifikant inhiberede tumorcelle ekspansion, men ikke dræbte hele befolkningen. Brug af denne kronisk behandling protokol, “efterligner” metronomisk behandling i klinikken, vi bestemt de optimale koncentrationer, i DU145 celler, af VP16, paclitaxel, STS, WP1102, og WP1103 ved 1,25 uM, 50 nM, 7 nM, 5 nM, og 25 nM. DU145 celler blev efterfølgende dyrkes, kontinuerligt, i medium, der indeholder de optimale koncentrationer af lægemidler til ~ 3 måneder. De resulterende lægemiddel-tolerant celle (DTC) linjer blev betegnet som DU145-VP16, DU145-paclitaxel, DU145-STS, DU145-WP1102, og DU145-WP1103 celler.

For at bestemme, om lægemiddel-tolerant DU145 celler var virkelig tolerante af de oprindelige udvælgelse narkotika, behandlede vi parentale og lægemiddel-tolerant DU145 celler side om side med de respektive fem lægemidler. Som vist i fig. 1, narkotika-tolerante DU145 celler var generelt mere modstandsdygtige end forældrenes DU145 celler til udvælgelseskriterierne narkotika. Således DU145-VP16-celler 10 gange mere modstandsdygtige end DU145 celler til VP16 (IC

50 værdier er 0,78 uM for DU145 og 9,17 uM for DU145-VP16-celler). DU145-paclitaxel-celler var ca. 7 gange mere resistente over for paclitaxel end DU145 celler (Fig. 1, A og C). Tilsvarende DU145-WP1103 celler blev næsten 30 gange mere resistent over for WP1103 end DU145 celler (fig. 1B-C). Endelig DU145-STS og DU145-WP1102 celler blev ca. 1,5 og 3 gange mere modstandsdygtige over for STS og WP1102 henholdsvis end uselekterede DU145 celler (fig. 1B-C). Derfor er forskellen resistens blandt de etablerede dobbeltbeskatningsoverenskomster rangeret DU145-WP1103 DU145-VP16 DU145-Paclitaxel . DU145-STS≈Du145-WP1102

A-B. Forældrekontrol DU145 og narkotikarelaterede tolerant DU145 cellelinjer udvalgt med to kliniske lægemidler (A) eller tre eksperimentelle lægemidler (B) blev udsat, side-by-side, til de respektive udvalg lægemidler (f.eks DU145-VP16-celler til VP16 og Du145- paclitaxel celler til paclitaxel) ved koncentrationerne (omdannet til logaritme) angivet. Y-aksen repræsenterer cellevækstinhiberingen (%). C. tabulerede præsentationer af IC

50 værdier (se Materialer Metoder) og tilsvarende 95% CI (konfidensinterval) af DU145 celler og narkotika-tolerante DU145 celler som svar på de fem stoffer angivet. Værdier blev beregnet ud fra data opnået i A og B.

Efterfølgende vi udsat DU145-VP16-celler til tre ikke-vælge medicin, dvs. paclitaxel, STS, og doxorubicin (Dox). Som vist i fig. 2, DU145-VP16-celler var mere resistente (end parentale DU145 celler) til paclitaxel (ca. 4 gange), STS (1,5 gange), og Dox (13 gange), hvilket antyder, at dobbeltbeskatningsoverenskomster var også krydsresistente over for andre ikke-udvælgelse narkotika

DU145-VP16-celler blev behandlet med paclitaxel (A), STS (B), og doxorubicin (Dox; C). ved de koncentrationer [log] angivet. Resultaterne er præsenteret som% hæmning og IC

50 (D) blev bestemt som i figur 1.

Brug lignende strategier, vi også etableret lægemiddel-tolerant DLD1 kolon (fig. 3) og UC14 blære (ikke vist) cancerceller. I DLD1 celler, de optimale koncentrationer for VP16, paclitaxel, WP1102, og WP1003 var bestemt til at være på 2,5 uM, 100 nM, 120 nM og 100 nM. Som vist i fig. 3, de etablerede DLD1-VP16, DLD1-paclitaxel, DLD1-WP1102, og DLD1-WP1103 celler var resistente over for de respektive samt valg narkotika. Endvidere DLD1-VP16-celler viste også krydsresistens over for paclitaxel og Dox (fig. 3B). Drug-tolerant UC14 celler blev ligeledes mere modstandsdygtige over for udvælgelse lægemidler (dvs. paclitaxel, STS, VP16, Dox, WP1102, og WP1103), end de parentale UC14 celler (ikke vist).

Parental og lægemiddel- tolerante DLD1 cellelinier udvalgt med optimale koncentrationer (se teksten) af VP16, paclitaxel, WP1102, og WP1103, blev udsat, side-by-side, til de respektive udvælgelse lægemidler i koncentrationer (omdannet til logaritmen) angivet (A). Y-aksen repræsenterer cellevækstinhiberingen (%). B. tabulerede præsentationer af IC

50 værdier og tilsvarende 95% CI (tillid intervaller) af forældrenes DLD1 celler og narkotikarelaterede tolerant DLD1 linjer som reaktion på både valg og ikke-valg af lægemidler.

Drug-tolerant DU145 celler var overraskende mindre tumorigent end forældrenes DU145 celler

Vi antager, at de dobbeltbeskatningsoverenskomster kan besidde CSC egenskaber og være mere tumorigen in vivo. Meget til vores overraskelse, alle lægemiddel-tolerant DU145-celler subkutant (sc) injiceret i NOD /SCID-mus demonstrerede meget reduceret tumorfremkaldende kapacitet sammenlignet med det samme antal parentale DU145 celler, som viste en tumorfremkaldende frekvens (TIF) af ~ 1/175 (tabel 1). Injektion af et stigende antal forældre DU145 celler, forventeligt, førte til reduceret latenstid (tabel 1). I modsætning hertil viste DU145-VP16-celler en TIF af -1 /62.000 og 100.000 celler injiceret, tumor latens var mere end dobbelt så lang som for det samme antal af DU145 celler (tabel 1). Faktisk er både DU145-paclitaxel og DU145-WP1103 celler var ikke-tumorigene op til 10.000 (for DU145-WP1103) og 100.000 (for DU145-paclitaxel) celler implanteret (tabel 1). Selv for DU145-STS og DU145-WP1102 celler, som viste de laveste IC

50 differentialer (fig. 1B-C), reduceret tumorincidensen med TIF af 1/971 og 1 /45.787, henholdsvis og mindre tumorer var også observeret (tabel 1).

for at afgøre, om tumor implantation websted kan have en effekt på forskellen tumorgenicitet observerede, etablerede vi GFP-mærkede DU145 forældre- og narkotika-tolerante DU145 celler og implanteret lige mange (dvs. , 500.000) af celler orthotopisk i det dorsale prostata (DP) på de mandlige NOD /SCID-mus. Når eksperimentet blev afsluttet 75 dage efter tumor celle injektioner, observerede vi, at DU145-VP16 og DU145-STS celler genereret mindre tumorer end parentale DU145-celler (fig. 4A). Faktisk er både DU145-paclitaxel og DU145-WP1103 celler var ikke-tumorigene i DP tumor regenerering model (fig. 4A). Betydeligt, parentale DU145 celler metastaseret til flere organer, herunder lymfeknuder, nyrer, bugspytkirtel, lever, lunge og milt henviser lægemiddel-tolerant DU145 celler manglede synlige metastaser til nogen af ​​disse organer (Fig 4B-C;. Data ikke vist)

A. GFP-mærkede forældre eller narkotika-tolerant DU145 celler blev implanteret (500.000 celler /injektion), i 50% Matrigel, i DP af NOD /SCID-mus. Alle dyr blev afsluttet 75 dage efter implantation. Vist er tumor incidens og tumor vægt (middel ± standardafvigelse, statistik, der ikke gælder på grund af relativt lille antal dyr). B-C. Repræsentative tumor og orgel billeder fra en tumorbærende dyr i DU145 (B) og DU145-VP16 (C) -gruppe, hhv. Alle billeder blev erhvervet ved hjælp af et Nikon microdissecting epifluorescensmikroskop på 0,75 × og indrammede område i B (lunge GFP billedet) repræsenterer en udvidelse viser GFP

+ spots i lungen.

Doping tolerante DLD1 celler viste også reduceret tumorgenicitet mens narkotika-tolerant UC14 celler demonstrerede stofafhængige ændringer i tumor-initierende kapacitet

for at afgøre, om den reducerede tumorgenicitet forbundet med resistente celler er begrænset kun til DU145 celler, vi på samme måde injiceres, sc, stigende antal forældre DLD1 og fire lægemiddel-tolerante DLD1 cellelinjer i NOD /SCID-mus. Som vist i tabel S1, lægemiddel-tolerant DLD1 celler, men viser lignende tumorincidensen, regenereret signifikant mindre tumorer i sammenligning med parentale DLD1 celler på samme celleantal.

Vi udførte lignende begrænsende-fortynding tumor eksperimenter i 6 narkotikarelaterede valgt UC14-celler (tabel S2). I modsætning til narkotikarelaterede tolerant DU145 og DLD1 celler, som ensartet demonstreret reduceret tumorigent potentiale, 4 af de 6 narkotikarelaterede tolerant UC14 celler (tabel S2, skygget brun) vist bedre tumor-regeneration kapacitet i forhold til det samme antal forældre UC14 celler. Interessant, to narkotikarelaterede tolerant UC14 cellelinjer også regenereres meget mindre tumorer end det samme antal forældre UC14 celler (tabel S2, skygget lyserød). Disse resultater indikerer, at lægemiddel-tolerante UC14 celler er enten mere eller mindre tumorigene end de parentale celler, afhængigt af den første udvælgelse narkotika.

Drug-tolerant DU145-celler var mindre proliferativ og viste lav klondannelseseffektivitet

Da det var helt uventet, at nogle lægemiddel-tolerant cancerceller viste reduceret tumor-regenererende kapacitet, vi efterfølgende fokus på narkotika-tolerant DU145 celler i forsøg på at afdække potentielle mekanismer. Vi konsekvent observeret, at de fleste narkotika-tolerant DU145-celler syntes at proliferere langsommere sammenlignet med DU145 celler. Faktisk, i en prospektiv 10-dages eksperimentet måling levende celletal, observerede vi, at alle lægemiddel-tolerant DU145 celler, bortset DU145-WP1102 celler, udviste meget lavere end-point levende celleantal (fig. 5A), hvilket antyder, at dobbeltbeskatningsoverenskomster var mindre proliferative og /eller mere modtagelige for celledød. Vi derefter udført BrdU-inkorporering eksperimenter til direkte at måle celleproliferation. Som vist i fig. 5B, narkotika-tolerant DU145 celler udviste lavere proliferative indeks (dvs.% BrdU

+ celler). Interessant selv DU145-WP1102 celler vist lavere proliferative indeks (fig. 5B), selv om disse kulturer viste lignende samlede levende celleantal til parentale DU145-celler (fig. 5A). Husk, at DU145-WP1102 celler vises også relativt mindre reduktion i tumor-initierende kapacitet i forhold til andre narkotikarelaterede tolerant DU145 celler (tabel 1). Det er muligt, at DU145-WP1102 celler prolifererede mindre men havde også mindre spontan celledød, hvilket således resulterer i lignende end-point levende celleantal (fig. 5A) og mindre udtalte fald i tumorigenicitet (tabel 1). Faktisk vi konsekvent observeret, at DU145-WP1102 celler, kronisk udvalgte med 5 nM WP1102 sammensatte, viste mindre flydende og apoptotiske celler i kultur kolber sammenlignet med DU145-WP1103 celler (ikke vist), som kronisk blev udvalgt ved hjælp af 25 nM WP1103 sammensatte. Endelig bemærkede vi, at alle narkotikarelaterede tolerant DU145 celler viste lavere kloningseffektiviteter end de parentale DU145 celler (Fig. 5C).

A. Kvantificering af antallet af levedygtige celler. Forælder og lægemiddel-tolerant DU145-celler blev udpladet i fire eksemplarer, i plader med 12 brønde (5000 celler /brønd) og levedygtige celler blev kvantificeret ved anvendelse af trypanblå eksklusion assay 10 dage efter udpladning. B. Kvantificering af% BrdU

+ -celler (se Materialer Methods). C. Bestemmelse af kloning effektivitet. Forælder og lægemiddel-tolerant DU145-celler blev udpladet i fire eksemplarer, i 6-brønds plader (100 celler /brønd) med frisk medium genopfyldes hver 3. dag. Antallet af holoclones og meroclones blev bestemt 10 dage efter plating. I alle data, søjler repræsenterer middelværdien ± SD og statistiske analyser blev udført ved hjælp af Student

t

-test (*, P 0,05, **, P 0,01)

. konsistent med reduceret celleproliferation viste lægemiddel-tolerant DU145-celler forøgede niveauer af to cyclinafhængige kinaseinhibitorer, p21 og p27, især i DU145-Paclitaxel og DU145-WP1103 celler (fig. 6A), de to cellelinier, som fuldstændigt manglede tumorigenicitet (tabel 1). P27 niveauer blev også forhøjet i alle tre andre lægemiddel-tolerant DU145 cellelinier (fig. 6A). Interessant nok den signifikant forøget p27 proteinbånd i DU145-Paclitaxel og DU145-WP1103 celler migrerede lidt hurtigere end proteinet i andre cellelinjer (fig. 6A). Fremtidige studier vil afklare dette potentielt interessant observation. I modsætning til p21 og p27, Bcl-2, et anti-apoptotisk protein, viste mindre, omend dramatiske formindskelser, igen, i de to ikke-tumorigene DU145 linjer, dvs., DU145-Paclitaxel og DU145-WP1103 (fig. 6A).

A. Helcellelysat fra celletyperne anført blev anvendt i Western blotting af p21, p27, Bcl-2, og hTERT og blottet blev testet igen for β-actin. NS, ikke-specifik. B. Western blotting af CD44 og ABCG2. Blottet blev testet igen for β-actin og GAPDH. C-D. DU145 og lægemiddel-tolerant DU145-celler blev udpladet på dækglas og farvet for CD44 under anvendelse af monoklonalt antistof. Vist er repræsentative billeder (C) og kvantificering af CD44

+ celler (D; middel ± SD, *, P 0,01).

Drug-tolerant DU145 kulturer viste nedsat antal af eller var blottet for, CD44

+ celler

Flere beviser tyder på, at formindsket tumor-regenererende kapacitet i narkotika-tolerante DU145 celler kan indebære, foruden kompromitteret proliferativ potentiale måske medieret af øget p21 og p27,