PLoS ONE: GSK3p Overekspression Indikerer dårlig prognose og dens Hæmning Reducerer Cell Proliferation og overlevelse af ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

Baggrund

Glycogensynthasekinase 3 beta (GSK3p) er centralt involveret i diverse cellulære processer, herunder spredning og apoptose. Denne undersøgelse havde til formål at undersøge indflydelsen af ​​GSK3p udtryk på prognosen af ​​menneskets ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og virkningerne af GSK3p hæmning i NSCLC cellelinjer.

Metoder

immunhistokemisk og Western blot-assays blev anvendt til at evaluere GSK3p ekspressionsniveau i humane NSCLC væv. Lentiviral RNA-interferens blev udført for at inhibere ekspressionen af ​​GSK3p i A549, H292, H1299 og SK-MES-1 cellelinier. Cell overlevelse, apoptose og motilitet blev evalueret

in vivo

in vitro

.

Resultater

Niveauerne af GSK3p var større i NSCLC væv (n = 211) end i kontrol væv (n = 194) (

P

0,001). Det 5-års opfølgning analyse viste, at positiv GSK3p udtryk var tegn på dårlig prognose (

P

= 0,006). Desuden knockdown af GSK3p i NSCLC cellelinjer undertrykt celleproliferation, anholdt tumorceller i G0 /G1 fasen, induceret apoptose og nedsat celle motilitet. En xenograftmodel viste, at deregulering af GSK3p svækket tumorigenese, hvilket bekræftes af reduceret celledeling baseret på Ki-67 og signifikant øget apoptotisk celledød. Inhiberingen af ​​GSK3p havde inkonsistente virkninger på ekspressionen af ​​β-catenin, afhængigt af celletypen undersøgt.

Konklusion

Aberrant ekspression af GSK3p tjener som en uafhængig markør for dårlig prognose for NSCLC. Inhiberingen af ​​GSK3p undertrykt tumorigenese ved at dæmpe celleproliferation, øget apoptose og fastholdende cellemotilitet. Disse resultater identificerer GSK3p som en tumor promotor og et potentielt terapeutisk mål i NSCLC

Henvisning:. Zeng J, Liu D, Qiu Z, Huang Y, Chen B, Wang L, et al. (2014) GSK3p Overekspression Indikerer dårlig prognose og dens Hæmning Reducerer Cell Proliferation og overlevelse af ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 9 (3): e91231. doi: 10,1371 /journal.pone.0091231

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: September 11, 2013; Accepteret: 10. februar, 2014 Udgivet: marts 11, 2014

Copyright: © 2014 Zeng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Nature Science Foundation of China (81201851 til Dan liu og 81641028 til Weimin Li). Hjemmesiden for National Nature Science Foundation of China er https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default166.htm. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft har været den førende årsag til verdensomspændende cancer-relaterede dødsfald i årtier [1]. I Kina er antallet af lungekræft tilfælde og dødsfald i forbindelse med lungekræft steget med stigende cigaret misbrug og forureningsniveauer [2]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som primært omfatter adenocarcinom og pladecellecarcinom, tegner sig for næsten 85% af lungecancere. Skønt der er taget nye terapeutiske metoder, er de fleste patienter stadig diagnosticeret på fremskredne stadier, og 5-års overlevelse er stadig mindre end 15% [1]. For at forbedre resultatet og livskvaliteten for patienter med NSCLC, har mange nylige undersøgelser fokuseret på at finde nye terapeutiske mål og identificere biomarkører for at lette individualiseret behandling [3].

Glycogensynthasekinase 3 beta (GSK3p) er en multifunktionel serin /threoninproteinkinase, som oprindeligt blev isoleret fra kanin-skeletmuskel [4]. Under hvilebetingelser, GSK3p er konstitutivt aktiv grund tyrosin-216-phosphorylering, og det phosphorylerer og inhiberer en forskelligartet gruppe af pro-onkogene substrater, såsom β-catenin, cyclin D1, c-Jun, c-Myc og CREB. Til gengæld, phosphorylering af serin-9 inaktiverer GSK3p [5] – [7]. Baseret på disse funktioner, GSK3p er en potentiel tumor suppressor, og inaktivering af GSK3p er blevet rapporteret i mange cancerceller [8], [9]. Imidlertid har mange undersøgelser vist, at GSK3p positivt kan regulere proliferation og apoptose af tumorceller [10] – [18]. Desuden har undersøgelser vist, at inhibering af GSK3p dæmper overlevelse og proliferation og inducerer apoptose i forskellige typer af cancere, såsom pancreascancer [11], colorectal cancer [12], [15] og blærecancer [18]. Men den rolle GSK3p adskiller i forskellige kræftformer [19], og den præcise rolle GSK3p i NSCLC er fortsat uklart.

I denne undersøgelse har vi undersøgt udtryk for GSK3p i humane NSCLC væv og dens prognostisk betydning. I H292, H1299, SK-MES-1 og A549 NSCLC cellelinier blev GSK3p ekspression inhiberes ved lille hårnåle-RNA (shRNA) overføres af lentiviral vektor. Stabile Knockdown cellelinjer blev kontrolleret og anvendes i yderligere forskning. Tumorigenese, spredning, apoptose og celle migration blev også vurderet både

in vivo

in vitro

, og resultaterne viste, at afvigende ekspression af GSK3p fungerede som en selvstændig indikator for dårlig prognose for NSCLC. Endvidere inhibering af GSK3p ved RNA-interferens undertrykt tumorigenese ved at dæmpe celleproliferation, øget apoptose og undertrykke celleinvasion. Tilsammen udgør disse fund identificerer GSK3p som en tumor promotor og et potentielt terapeutisk mål for NSCLC.

Materialer og metoder

1. Patienter og væv indsamling

Kirurgisk resektion NSCLC væv (n = 211) samt aftryk af normal lunge støder op til tumorvæv (n = 194) blev opnået fra West China Hospital, Sichuan University. Ingen af ​​patienterne var blevet behandlet med nogen præoperative kemoterapi eller strålebehandling. Opfølgning oplysninger var tilgængelige for 160 sager. De patologiske stadier blev bestemt i henhold til International Union Against Cancer (UICC) tumor-node-metastaser (TNM) system til maligne tumorer klassificering. For yderligere at udforske, var omfanget af differentiering og histologisk, bestemt efter WHO klassificering for NSCLC. Efter kirurgisk resektion, alle patienter fik standardbehandling efter retningslinjer fra 2004 NCCN klinisk praksis Oncology for NSCLC. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient, og institutionel Review Board godkendelse af denne undersøgelse blev opnået fra West China Hospital, Sichuan University.

2. Stabil gendæmpning benytter små interfererende RNA medieret af lentiviral vector

Den humane lunge NSCLC cellelinjer A549, H292, H1299 og SK-MES-1, som blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC), blev dyrket ifølge ATCC protokoller

Sekvenser (GAAGAAAGATGAGGTCTAT) rettet mod GSK3p (GenBank: NM_002093). der var designet ved hjælp af BLOCK-iT RNA-interferens (RNAi) Designer (Invitrogen, Carlsbad, CA) blev udvalgt. En sekvens uden relation til GSK3p genet (TTCTCCGAACGTGTCACGT) er designet som en negativ kontrol (NC) [20]. Den pGCSIL-GFP lentiviral vektor blev købt fra GeneChem og NeuronBiotech Corp (Shanghai, Kina). Grønt fluorescerende protein (GFP) blev anvendt som markør for at observere og sortere disse transficerede tumorceller med fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Virkningerne af RNA-interferens blev vurderet ved RT-PCR (ved 5

th dage efter transfektion) og western blotting (ved 7

th dage efter transfektion). Derefter blev NSCLC cellelinier med stabil og vedvarende GSK3p gen vælte opnået for yderligere

in vivo

og

in vitro

undersøgelser. Cellerne inficeret med lentivirus, der leverede sekvensen rettet mod GSK3 blev nævnt som det vælte gruppen (KD gruppe). Tilsvarende blev celler indeholdende lentivirus-leveret NC sekvens navngivet som NC-gruppe; og disse tumorceller ikke inficeret af lentivirus blev brugt som en normal kontrol og navngivet som kontrolgruppen (CON gruppe).

3. Tumorigenese i xenotransplanterede mus

Nude mus (BALB /c-nu /nu, n = 6 for hver gruppe, lige mange hanner og hunner, 6-8 uger gamle) blev leveret af Laboratory Animal Center i Sichuan Universitet. Musene blev opstaldet i laminare flow kabinetter under specifikke patogenfrie betingelser og fodres ad libitum. Alle undersøgelser med mus blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr. Godkendelse til denne undersøgelse blev givet af Institutional Animal Care og behandling Komité Sichuan University.

Efter behandling med forskellige virus, eksponentielt voksende A549 celler blev subkutant injiceret i ryggen af ​​Balb /c nøgne mus (1 x 10

6 /ml hver). Tumorvolumenerne blev vurderet hver 3. dag efter følgende formel: tumorvolumen (mm

3) = d

2 × D × 0,52. Fire uger efter tumorimplantation blev musene aflivet smertefrit. Deres organer blev undersøgt for grov tegn på anatomiske forandringer.

4. Celleproliferationsassays

The Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Rockville, USA) blev anvendt til at vurdere celleproliferation ifølge fabrikantens protokol. Tumorceller (2 × 10

3 per brønd) blev podet i 96-brønds dyrkningsplader, og behandlet med 10% FBS og inkuberet ved 37 ° C. Den optiske densitet ved 450 nm blev målt ved 24, 48, 72, 96 og 120 timer efter virus transfektion. De viste data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter og er vist som middelværdi ± S.D.

5. Cellecyklusanalyse

Tooghalvfjerds timer efter transfektion blev cellecyklus data opnået ved at analysere for PI-farvede celler under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) med en FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA ). For hver prøve mindst 3 × 10

5-celler blev talt, og dataene blev analyseret med BD CellQuest software. De viste data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter og er vist som middelværdi ± S.D.

6. Apoptose analyse

tumorceller (ca. 5 × 10

5) blev farvet med 5 pi Annexin V-APC og 7AAD (KeyGen, Nanjing, Kina) ved stuetemperatur og derefter analyseret ved flowcytometri inden for 1 h. Annexin V (+) /7AAD (-). Celler blev betragtet som apoptotiske celler

TUNEL-metoden (in situ Celledød Detection Kit AP, Roche, Schweiz) blev anvendt til at bestemme niveauet af apoptose i xenograft tumorvæv. Apoptotiske celler blev påvist under anvendelse af alkalisk phosphatase og farvet med rødt. For hver tumor blev apoptotiske celler i 5 tilfældige høj effekt felter talt, og hastigheden af ​​apoptose blev beregnet efter følgende formel:

Apoptose rate = antal apoptotiske celler /totale antal af tumorceller talt × 100 %.

7. RNA-ekstraktion og real-time PCR

Primerne for human GSK3p var 5′-ATTTCCAGGGGATAGTGGTGT-3 ‘(sense) og 5′-TCCTGACGAATCCTTAGTCCAAG-3′ (antisense); og dem for GAPDH var 5’-CCATCACCATCTTCCAGG-3 ‘(sense) og 5’ATGAGTCCTTCCACGATAC 3’ (antisense). Primerne og proberne blev indkøbt fra GeneChem, Shanghai, Kina. MRNA-ekspressionsniveauer blev kvantificeret i tre eksemplarer af real-time RT-PCR under anvendelse af en 2720 termisk cykliseringsapparat (Applied Biosystems, Foster City, Californien). De relative niveauer af target udskrifter blev kvantificeret ved hjælp af 2 (-delta Delta Ct) metode [21] og normaliseret til niveauet af menneskelige GAPDH udskrifter.

8. Cell invasion assay

The Cell Invasion Assay Kit (ECM550, Chemicon, Californien, USA) blev anvendt til at vurdere celle invasiv. Efter virus transfektion, en portion af den fremstillede cellesuspension (300 ul, 1,0 x 10

6 celler /ml) blev tilsat til hver øvre insert. Efter 48 timers inkubation blev inserterne dyppet i farveopløsning i 20 min for at farve de invasive celler på membranen. Derefter blev de invasive celler i 5 tilfældige udsigt mikroskop optælles. De viste data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter og præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse

9. Western blotting-analyse

I alt proteiner blev udvundet fra NSCLC tumorvæv og transficerede dyrkede celler og derefter kvalificeret hjælp af en protein udvinding kit (Keygen, Nanjing, Kina) og BCA Protein Assay reagens (Thermo videnskabelige, Rockford, USA) . Proteinerne blev separeret ved SDS-PAGE og visualiseret ved immunoblotting med antistoffer specifikke for GSK3p (# 9315, fortyndet 1: 400) og β-catenin (# 9582, fortyndet 1: 200) (Cell Signaling Technology, Beverly, USA). Efter eksponering for et kemiluminescerende HRP substrat (Millipore, Billerica, USA) blev målproteiner detekteret ved anvendelse af et ChemiDoc XRS-system (Bio-Rad, Philadelphia, USA), og billederne blev analyseret med gel-Pro Analyzer 4.0 software (Media Cybernetics ).

10. Immunhistokemisk assay

GSK3p i NSCLC tumorvæv og de tilstødende normale væv blev immunhistokemisk farvet som beskrevet i vores tidligere undersøgelser [22] – [24]. Semikvantitativ vurdering af sektionerne blev udført ved 2 patologer i en blindet måde. Den negative kontrol for immunfarvning blev udført uden primært antistof. Både fraktionen og intensiteten af ​​de immunfarvet tumorceller blev overvejet. Fraktionen blev beregnet som gennemsnittet af 5 tilfældigt udvalgte high-power felter vurderet ved lysmikroskopi som følger: 0, ingen farvede målceller (tumor, bronkial eller alveolære celler); 1, 20% af celler farvet; 2, 20~50% af celler farvet; og 3, over 50% af cellerne farvet. Intensiteten score blev defineret som følger: 0, ingen væsentlig farvning af målcellerne; 1, knapt påviselig farvning i cytoplasmaet og /eller kernen af ​​målcellerne; 2, klart brun farvning; og 3, mørkebrun farvning. Fraktionen og intensitet scoringer blev ganget at give en samlet score i intervallet fra 0 til 9. Scores mellem 2 og 9 blev betragtet som positivt udtryk. Immunohistokemiske assays blev ligeledes udført på histologiske snit af paraffinindlejrede xenotransplantattumorer.

Farvning af den proliferative markør Ki-67 blev udført for at vurdere væksten af ​​xenograft-tumorer. Ki-67-antistof (# MA1-80199, fortyndet 1: 100) blev opnået fra Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA. Ki-67 mærkningsindeks (Ki-67 LI) blev beregnet ifølge følgende formel:

Ki-67 LI = antal Ki-67 positive celler /totale antal af tumorceller talt × 100%

11. Statistisk analyse

SPSS 17,0 til Windows (SPSS Inc., Chicago, Ill, USA) blev anvendt til alle dataanalyse. De immunhistokemi resultater og deres foreninger med kliniske karakteristika blev analyseret ved hjælp af chi-square test. Spearmans rank test blev anvendt til at analysere sammenhængen mellem protein fænotyper. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at analysere univariate overlevelse, og sammenligninger af overlevelse distributioner blandt grupper blev udført ved anvendelse af log-rank test. Den prognostiske betydning af GSK3p udtryk i forhold til andre patologiske variabler blev vurderet ved anvendelse multivariat Cox regressionsanalyse. De kvantitative data er udtrykt som middelværdi ± S.D. Den statistiske signifikans af forskelle mellem grupperne blev bestemt ved envejs ANOVA efterfulgt af Fishers PLSD post-hoc test. Alle

P

værdier var 2-tailed, og værdier på

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

1. GSK3p opreguleres i NSCLC tumorvæv

Repræsentative billeder af immunhistokemisk farvning for GSK3p i NSCLC væv og de tilsvarende normale væv er vist i figur 1A. GSK3p blev fremtrædende udtrykt i NSCLC (n = 211), primært i cytoplasmaet af tumorceller. Sammenligninger af GSK3p proteinniveauer mellem tumorvæv og normalt lungevæv, er vist i tabel 1. Resultaterne viste, at GSK3p niveau var signifikant forøget i NSCLC væv sammenlignet med de normale lungevæv (

P

0,001). Western blotting analyser bekræftede også, at ekspressionsniveauet af GSK3p i tumorer var højere end i deres normale modstykker. (

P

= 0,04, figur 1B).

(A) Typiske IHC farvning billeder af human NSCLC tumor og normal lungevæv (forstørrelse x 200). (B) Western blotting-analyser bekræftede, at i parrede normal /tumorvæv fra NSCLC kræftpatienter, højere ekspressionsniveauer af GSK3p i tumorer blev fundet i forhold til deres normale kolleger. Forsøgene blev gentaget 3 gange, og dataene er vist som middelværdi ± SD. *

P

0,001. (C) Phosphoryleret glycogensyntase (PGS), et substrat af GSK3p, blev påvist i disse NSCLC cellelinjer, bortset H292.

Som et substrat af GSK3p proteinet ekspression af phosphoryleret glycogensynthase (PGS) blev anvendt til at indikere aktiviteten af ​​GSK3p. I disse fire cellelinjer, undtagen H292 PGS, blev påvist (Fig 1C), som foreslog høj aktivitet af GSK3p i human lungekræft.

2. Positiv udtryk for GSK3p er forbundet med dårlig prognose for NSCLC

Patienter med komplet klinisk information (160 sager, 39 kvinder og 121 mænd, 61,19 ± 10,53 år) blev indskrevet i overlevelse analyse. Den mediane alder var 60,00 år (interval, 29 til 83 år). De kliniske karakteristika og overlevelse analyseresultater er opsummeret i tabel 2 og figur 2. 5-årige overlevelsesrate for hele gruppen var 49,07%, og den mediane follow-up tid var 58,00 måneder (interval, 0 til 77,67 måneder).

(A) i hele gruppen, patienter med positiv GSK3p udtryk havde kortere overlevelsestid,

P

= 0,006. Figur 2B-D viser overlevelsen analyse for undergrupperne. (B) I den nederste differentiering undergruppe, patienter med positiv GSK3p udtryk havde signifikant kortere overlevelsestid,

P

= 0,013. (C) I T1 + T2 undergruppe, patienter med positiv GSK3p udtryk havde signifikant kortere overlevelsestid,

P

= 0,003. (D) I n0 + N1 undergruppe, patienter med positiv GSK3p udtryk havde signifikant kortere overlevelsestid,

P

= 0,010. (E) Patienter i M0 undergruppen med positiv GSK3p udtryk havde signifikant kortere overlevelsestid,

P

= 0,008. Kaplan-Meier-kurver for de undersøgte proteiner blev brugt til at sammenligne den positive (

stiplede linjer

) og negative fænotyper (

ubrudte linjer

).

univariate analyse blev udført for at estimere forholdet mellem kliniske karakteristika og GSK3p ekspression. Som vist i tabel 2, NSCLC patienter med forskellige kliniske karakteristika, såsom køn, alder, histologisk type og tumor-node-metastaser (TNM) fase, viste tilsvarende niveauer af GSK3p. Den prognostiske betydning af positiv GSK3p-udtryk i forskellige undergrupper blev vurderet ved hjælp af log rank test. I hele gruppen, patienter med positiv GSK3p udtryk havde kortere overlevelsestid (

P

= 0,006, figur 2A). Resultaterne viste også, at mandlige køn, ældre alder og pladecellekræft (SCC) med positiv GSK3p udtryk var associeret med dårligere prognose (

P

= 0,019,

P

= 0,020 og

P

= 0,002, henholdsvis). Derudover NSCLC patienter med dårligt differentierede tumorer eller i den fase undergrupper relativt tidligt (T1 + T2, n0 + N1 og M0) med positiv GSK3p udtryk havde signifikant kortere overlevelsestid (

P

= 0,013,

P

= 0,003,

P

= 0,010 og

P

= 0,008, henholdsvis;. vist i figur 2B-E)

Desuden multivariat Cox regressionsanalyse viste, at i denne gruppe, tumorstørrelse, lymfeknude invasion og GSK3p ekspression var uafhængige prædiktorer for NSCLC prognose. Disse resultater antydede, at GSK3p spiller en vigtig rolle i NSCLC tumorigenese og bedt yderligere analyse.

3. GSK3p positivt regulerer tumorcelleproliferation og overlevelse i NSCLC

En lentiviral vektor blev anvendt til at overføre designet shRNAs målrettet GSK3p i disse 4 NSCLC cellelinjer til vedholdende tavshed sit udtryk. Virkningerne af RNA-interferens blev vurderet ved RT-PCR (5 dage efter transfektion) og western blotting (7 dage efter transfektion). Disse resultater viste, at RNA og protein niveauer af GSK3p i tumorceller fra alle 4 celle undersøgte linjer blev signifikant reduceret, som vist i figur 3A-B (alle

P

0,001). Endvidere xenotransplantaterne væv isoleret fra nøgne mus blev immunhistokemisk farvede, og resultaterne verificeret den vedvarende stabile reduktion i GSK3p niveauer efter RNA-interferens (figur 3C). Disse resultater indikerede, at GSK3p var effektivt og stabilt slået ned af shRNA i alle 4 NSCLC cellelinier.

(A) GSK3p-specifikke shRNAs blev transficeret ind NSCLC celler med lentiviral vektor, og cellerne blev høstet og talt 5 dage efter transfektion. Real-time PCR viste, at indblanding fra shRNA effektivt slået ned mRNA ekspressionen af ​​GSK3p i NSCLC celler. (B) Cellerne blev høstet og talt 7 dage efter transfektion. Western blot viser effektiviteten af ​​protein silencing ved shRNA. (C) efter behandling med GSK3 shRNA (KD gruppe), den negative kontrol shRNA (NC-gruppe) eller normalt saltvand (CON gruppe), de A549-celler (1 x 10

6 /ml) blev injiceret i ryggen på nøgne mus. Fire uger senere, xenotransplantattumorer blev isoleret og immunhistokemisk farvede. Resultaterne verificeret vedvarende reducerede niveauer af GSK3p i KD gruppen i forhold til kontrolgrupperne. Pile viser positiv farvning i cytoplasmaet af tumorceller (forstørrelse x 400). Forsøgene blev gentaget 3 gange, og dataene udtrykkes som gennemsnit ± SD. *

P

. 0,001

CCK-8 assay viste, at knockdown af GSK3p klart undertrykt levedygtighed alle 4 cellelinjer (alle

P

0,001, figur 4A). I

in vivo

undersøgelse med xenograft mus, tumorer i KD gruppen voksede betydeligt langsommere og havde lavere tumor volumen i hele 4-ugers periode (

P

= 0,001, figur 4B ). Ved afslutningen af ​​observationsperioden, vægten af ​​xenotransplantaterne i KD gruppen var meget lavere end for kontrolgruppen (

P

= 0,001, figur 4C). Desuden blev Ki-67 LI af xenografter faldet drastisk i KD gruppen sammenlignet med de af NC og CON grupper (38,98% versus 75,14% vs. 73,84%,

P

0,001, figur 4D), hvilket indikerede, at nedregulering af GSK3p hæmmede celledeling

in vivo

. Disse resultater antyder, at GSK3p positivt regulerer vækst og tumorigenese af NSCLC-celler, og vi næste søgt at løse, hvordan disse effekter blev medieret.

(A) CCK-8 test viste, at inhibering af GSK3p undertrykte proliferationen af NSCLC cellelinjer

in vitro

. *

P

0,001. (B)

In vivo

: Som beskrevet i figur 3C, blev xenograftmodeller udviklet i nøgne mus. Hver gruppe bestod af 6 dyr. Tumorer blev observeret hver 3. dag i 4 uger. De xenotransplantattumorer af mus i KD gruppen voksede signifikant langsommere (efter tumorens volumen) over hele observationsperioden. *

P

0,001. (C) Sammenligning af de isolerede xenotransplantattumorer. Billedet viser, at tumorer isoleret fra KD gruppe var mindre og lettere end tumorerne fra kontrolgruppen. Dataene er udtrykt som middel ± SD, n = 6. *

P

0,001. (D) repræsentativt billede af Ki-67 IHC af en tumor xenograft ses under et mikroskop. At beregne Ki-67 LI, blev celler med brune-farvede kerner betragtet som positive, hvilket indikerer aktiv proliferation (forstørrelse x 400). Dataene er udtrykt som middel ± SD, *

P

0,001. (E) Cellecyklusanalyse efter 72 timer efter transfektion. Resultaterne antyder, at inhibering af GSK3p resulterede i G1 /S standsning i A549 og SK-MES-1-celler og ændrede proportioner cellepopulationen i forskellige faser af cellecyklussen. Dataene er præsenteret som middelværdier ± S.D. fra 3 uafhængige forsøg udført tredobbelt. *

P

0,001. (F) ved flowcytometri, de apoptotiske analyseresultater viste, at inhibering af GSK3p i høj grad øget apoptotiske på NSCLC-celler (bortset fra A549-celler)

in vitro

. *

P

0,001, ▴

P

0,05. (G) Resultaterne af TUNEL assay for xenotransplantattumorer foreslået, at inhibering af GSK3p øgede den apoptotiske sats af A549-celler

in vivo

(forstørrelse x 400). Dataene er udtrykt som middel ± SD, *

P

0,001. (H) Transwell analyser viser, at hæmning af GSK3p

in vitro

faldt betydeligt invasiviteten af ​​NSCLC celler. Dataene er udtrykt som middel ± S.D. *

P

. 0,001

Efter at have udført cellecyklus-analyse ved flowcytometri, fandt vi, at hæmning af GSK3p øgede antallet af celler i G0 /G1 fasen og faldt antallet af celler i S-fasen i A549 (

P

= 0,003, og

P

0,001) og SK-MES-1-celler (

P

= 0,002,

P

= 0,022) (Figur 4E). I H1299 og H292 celler, GSK3p knockdown resulterede i en tendens til en stigning i G0 /G1 befolkning, men forskellene nåede ikke statistisk signifikans (i H1299-celler,

P

= 0,056, og i H292 celler,

P

= 0,216).

In vitro

, celleapoptosen analysen foreslog, at de apoptotiske satser i KD gruppe var meget højere end i kontrolgruppen, med undtagelse af A549 cellelinje (H292, H1299 og SK-MES-1, alle

P

0,001, A549,

P

= 0,461, figur 4F). For xenograft mus, den TUNEL-analysen viste, at den apoptotiske sats i KD-gruppen (3,06% ± 1,24%) var meget højere end for de andre grupper (NC-gruppen, 0,11% ± 0,04% og CON gruppe, 0,46% ± 0,23%) (

P

0,001). Som vist i figur 4G blev apoptotiske celler farvet rød og indskrumpet. Tilsammen tyder disse resultater på, at inhibering af GSK3p induceret NSCLC celle apoptose.

4. Inhibering af GSK3p reducerer invasionsevne af NSCLC-celler

For at tælle de migrerede celler

in vitro

, Transwell assay under anvendelse af NSCLC-celler blev gentaget 3 gange, og resultaterne er vist i figur 4H. For alle 4 cellelinjer, KD gruppen viste signifikant færre invasive celler (alle

P

0,001), hvilket tydede på, at hæmning af GSK3p i høj grad undertrykt invasiviteten af ​​NSCLC celler. I de xenograft mus, blev der ikke metastaser findes på grov inspektion og palpation. Desuden lysmikroskopi analyse viste ingen tegn på metastatiske foci i fikseret og farvet organer.

5.β-catenin ekspression efter inhibering af GSK3p

Som vist i figur 5, at udtrykket niveau af β-catenin blev øget betydeligt i KD gruppen af ​​planocellulært line SK-MES (

P

0,001). Desuden knockdown af GSK3p stærkt undertrykt udtryk for β-catenin i H1299 celler (

P

0,001), men ikke i H292 (

P

= 0,108) eller A549-celler (

P

= 0,185).

(a) Typisk bånd i western blot-assay viste, at proteinniveauer p-catenin var reguleret i en celletypespecifik måde efter inhibering af GSK3p. (B) Kvantitativ analyse af β-catenin-ekspression. Forsøget blev gentaget 3 gange, og dataene udtrykkes som middelværdi ± SD. *

P

. 0,001

Diskussion

GSK3p blev oprindeligt identificeret som en vigtig regulerende enzym af glykogen metabolisme [4], [7]. Siden da har dette protein vist sig at være en vigtig regulator af celleoverlevelse og apoptose, der forbinder denne multifunktionelle kinase til kræft [25], [26]. For nylig har en række undersøgelser vist, at GSK3p positivt kan regulere proliferation og apoptose af tumorceller [10] – [18], selv om den præcise rolle af GSK3p i lungekræft fortsat ukendt. Derfor er den aktuelle undersøgelse udforskede den prognostiske betydning af GSK3p og dens funktion i NSCLC.

Først blev observeret overekspression af GSK3p i NSCLC væv ved sammenligning NSCLC væv med tilgrænsende normale væv, og dette afvigende akkumulering af GSK3p i NSCLC-celler var forbundet med en kortere overlevelsestid og identificeret som en ny risikofaktor for dårlig prognose. Selv om lidt opmærksomhed er blevet betalt til ekspression af GSK3p i lungekræft, tyder på, at overekspression af p-GSK3p kan tjene som markør for dårligere prognose i lungekræft [27]. Fordi p-GSK3p er den inaktive form af GSK3p, overekspression af p-GSK3p er ikke nødvendigvis ækvivalent med tabet af GSK3p, især når det totale protein niveau også i høj grad opreguleres. I vores undersøgelse, høje udtryk for PG’er, som er en indikator for GSK3p-aktivitet, blev påvist i de fleste af NSCLC cellelinier, hvilket viser, at GSK3p er meget aktiv i NSCLC-celler. Derfor vores undersøgelse foreslog, at overekspression af den samlede GSK3p var over-aktiveret og tillagt dårlig prognose i NSCLC patienter. Lignende resultater er blevet rapporteret for blærecancer [18]. Derfor kan GSK3p overekspression tjene som biomarkør for at forbedre tidlig diagnose, patient udvælgelse og bestemmelse af prognosen.

Kodeværktøjer, vores IHC Resultaterne viste, at GSK3p er lokaliseret overvejende i cytoplasmaet i patient- og xenograft tumorvæv. Omvendt flere undersøgelser vist, at GSK3p blev akkumuleret i kernen i pancreas [11], renale [28] og blære kræft [18]. I disse tumorvæv, kan nukleare GSK3p spille en rolle i NF-KB-medieret cancer celleoverlevelse; men efter knockdown af GSK3p, de NF-KB ekspressionsniveauer i de forskellige NSCLC cellelinier af vores undersøgelse var inkonsekvent, hvilket indikerer, at GSK3p kan mediere cancercelleoverlevelse uafhængig af NFKB-ekspression (data ikke vist). Derfor subcellulær lokalisering af GSK3p er kompleks og stramt relateret til dens molekylære mekanisme. Yderligere undersøgelse af den subcellulære lokalisering rolle GSK3p skal gennemføres.

Det næste vigtige spørgsmål er, hvordan man kan forklare den dybe indflydelse GSK3p på prognosen af ​​NSCLC patient. Denne undersøgelse har forsøgt at undersøge de grundlæggende molekylære mekanismer i GSK3p

in vitro

in vivo

. Det er blevet veletableret, at GSK3p spiller en central rolle i reguleringen af ​​apoptose [26]. F.eks GSK3p knockout eller lithium behandling potenserer apoptose i hepatocytter [29], og en forøget apoptose efter inhibering af GSK3p er blevet rapporteret i prostatacancer [30], pancreascancer [11], leukæmi [13], gliom [ ,,,0],17] og blærecancer [18].