PLoS ONE: Effektiv afskaffelse af kræftceller ved deoxyglucose-ABT-263/737 Kombination Therapy

Abstrakt

Som enkelte agenter, ABT-263 og ABT-737 (ABT), molekylære antagonister af Bcl-2 familie, binder tæt til Bcl-2, Bcl-xL og Bcl-w, men ikke til Mcl-1, og inducere apoptose kun i begrænsede celletyper. Forbindelsen 2-deoxyglucose (2DG), i modsætning hertil delvis blokerer glycolyse, langsommere cellevækst men sjældent forårsager celledød. Injiceres i et dyr, 2DG akkumuleres overvejende tumorer, men ikke skader andre væv. Men når celler, der var særdeles resistente over for ABT blev forbehandlet med 2DG i 3 timer, ABT blev en potent inducer af apoptose, hurtigt frigivende cytochrom c fra mitokondrier og aktivering caspaser på mindre end mikromolære koncentrationer i en Bak /Bax-afhængig måde. Bak normalt afsondret i komplekser med Mcl-1 og Bcl-XL. 2DG primtal celler ved at gribe ind Bak-Mcl-1 forening, hvilket gør det lettere for ABT at tage afstand Bak fra Bd-XL, hvilket frigør Bak til at fremkalde apoptose. En meget aktiv glukose transporter og Bid, som en agent for mitokondrie apoptotiske signal forstærkning loop, er nødvendige for en effektiv apoptose induktion i dette system. Denne kombination behandling af kræft-bærende mus var meget effektiv mod tumor xenograft fra hormon-uafhængig højt metastaseret kemo-resistente humane prostata kræftceller, hvilket tyder på, at kombinationsbehandlingen kan give et sikkert og effektivt alternativ til genotoxin-baserede behandlinger mod kræft.

Henvisning: Yamaguchi R, Janssen E, Perkins G, Ellisman M, Kitada S, Reed JC (2011) Effektiv afskaffelse af kræftceller ved deoxyglucose-ABT-263/737 kombinationsbehandling. PLoS ONE 6 (9): e24102. doi: 10,1371 /journal.pone.0024102

Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: 16. april, 2011; Accepteret: 31 Jul 2011; Udgivet: 19 September, 2011

Copyright: © 2011 Yamaguchi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. EJ modtaget National Institutes of Health (NIH) /National Cancer Institute Grant CA138617 modtog ME NIH give P41RR004050, og FFC modtog CA113318, CA055164, og CA081534. Noget af arbejdet her beskrevne blev udført ved hjælp af faciliteter på National Center for Mikroskopi og Imaging Research ved University of California San Diego, støttet af NIH NCRR gennem tilskud nummer P41RR004050 til ME. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

2-deoxy-D-glucose er en glukose molekyle, som har 2-hydroxylgruppen erstattes med hydrogen. 2DG transporteres over plasmamembranen af ​​en glucose transporter [1]. Når i cytosolen, er 2DG phosphoryleret af hexokinase II og dets produkt, 2-deoxyglucose-6-phosphat, er fanget i cytosolen og bliver en inhibitor af hexokinaser, ligesom glucose bliver glukose-6-fosfat og bliver en inhibitor af hexokinaser. Men som glucose-6-phosphat hydrolyseres af glucose-6-phosphatase meget hurtigt, producerer NADPH og generere energi, dens modstykke, 2-deoxyglucose-6-phosphat, er en dårligere substrat af glucose 6-phosphatase. Følgelig 2-deoxyglucose 6-phosphat akkumuleres i cytosolen, inhibering hexokinaser og sænke cellulære energiniveauer. Det skønnes, at den intracellulære halveringstid af 2-deoxyglucose 6-phsophate er ca. 50 min i cancerceller [2]. Således 2DG virker som en inhibitor af glycolytiske vej.

langsommere hydrolysehastigheder af 2-deoxyglucose 6-phsophate tillade glucoseoptagelse skal måles i levende dyr ved

18F-fluor-2-deoxyglucose baseret positron Emission Tomography (FDG-PET). Nylige fremskridt i FDG-PET har klart vist meget højere glucosetransporter aktiviteter in vivo, af næsten al faste tumorer sammenlignet med normale raske væv, bekræfter Warburg Effect [1]. FDG-PET er også blevet en meget følsom måde at opdage tumorer på et meget tidligt tidspunkt, for eksempel tidligt asymptomatisk kræft i bugspytkirtlen. Da 2DG akkumuleres overvejende kræftceller og delvist hæmmer meget uudnyttet glykolysen i disse celler, administration af 2DG er en sikker og effektiv måde at bremse kræft vækst [1]. Men den cytostatiske aktivitet 2DG er generelt kortvarig, kun varer omkring en uge [3]. 2DG er således blevet forsøgt i kombination med andre kemoterapeutiske midler, men igen med blandede resultater. I nogle tilfælde kan det sænke effektiviteten af ​​andre behandlinger [4]. En af årsagerne til nedsat virkning i disse kombinationsterapier kan være, at i nogle celler, 2DG aktiverer en insulin-lignende vækstfaktor-receptor (IGFR), der kunne aktivere PI3K-mTOR-AKT pro-overlevelse pathway [5], [6].

Forskellige lægemidler rettet mod Bcl-2 og Mcl-1 er blevet testet for deres evne til at inducere apoptose i cancerceller [7]. Den mest fremtrædende blandt dem er de Bcl-2-antagonister ABT-737 og ABT-263 [8], [9]. ABT-737 binder specifikt og med høj affinitet til Bcl-2-familien af ​​proteiner, herunder Bcl-2, Bcl-xL og Bcl-w, men ikke til Mcl-1. ABT-737 blev modificeret ved tre sider for at skabe ABT-263 til forbedret oral biotilgængelighed uden tab af affinitet til det Bcl-2-familien af ​​proteiner [9]. Som et enkelt middel, men ABT-263/737 (ABT) inducerer apoptose kun i begrænsede tumor typer, såsom lymfomer og nogle småcellet karcinom [8], [9], [10]. Årsagen til forskellige følsomheder til ABT er ikke helt klart.

Apoptose forløber typisk ved enten indre vej, hvor cytochrom c er frigivet fra mitokondrier i en Bax /Bak-afhængig måde, aktiverende apoptosomes i cytosolen, eller den ydre vej, hvor caspaser aktiveres direkte nedstrøms for dødsreceptorer (gennemgået af Salvesen Riedl [11]). Ofte er der krydstale mellem disse to veje. Fordi ABT binder mitokondrielle proteiner, er ABT-induceret apoptose menes at opstå gennem indre vej, men vi ved ikke præcis, hvordan dette gøres.

Det kritiske trin i indre vej af apoptose er når cytochrom c er frigivet fra mitokondrier, fordi når cytochrom c frigives til cytosolen, det stimulerer dannelsen af ​​apoptosomes, død bøddel. Af denne grund er cytochrom c-frigivelse ofte kaldes point of no return [12]. Indtil for nogle år siden, mente man, at calcium-aktiverede mitokondrier permeabilitetsovergang porer (MPTP) kan være nødvendig for cytochrom c-frigivelse under indre vej af apoptose. Det blev dog vist, at tBid-induceret cytochrom c-frigivelse og efterfølgende apoptose kunne finde sted i fravær af VDAC [13] og cyclophilin D [14], [15], to væsentlige dele af MPTP (revideret i Yamaguchi Perkins [16]). I stedet den fremherskende dogme er, at cytochrom c-frigivelse sker gennem mitokondriske outermembrane porer (MOMPs). Selvom MOMP er et veletableret begreb, dets eksistens forbliver hypotetisk fordi i modsætning nukleare porer eller MPTP, er der ingen EM billeder af MOMPs. Ligeledes har MOMPs ikke blevet isoleret som et biologisk enhed. Således vides det ikke, om Bak eller Bax bor i MOMPs. Den mest detaljerede analyse af MOMP dannelse under apoptose, kom fra at studere lipidvesikler samlet med mitokondrie outermembrane proteiner. I disse undersøgelser blev tBid-aktiveret Bax bruges til at stimulere MOMP forsamling på vesikler [17], at stimulere frigivelsen af ​​proteiner så store som 2000 kDa [18] gennem porer med diametre på 25-100 nm [19]. Hvis MOMPs på mitokondrier er omtrent samme størrelse, ville man forvente at se dem ved hjælp af elektronmikroskopi (EM), men de er ikke blevet afbildet. Således eksistensen af ​​MOMPs forbliver hypotetisk. Ikke desto mindre fra en mekanistisk synspunkt, eksistensen af ​​MOMPs består helt eller delvist af Bax og Bak giver mening.

BH3-only proteiner såsom tBid, BIMs kaldes “aktivatorer”, fordi de direkte interagere med Bax eller Bak, ændre deres kropsbygning og fremkalde oligomerisering, med andre ord “aktivere” dem, hvilket fører til cytochrom c-frigivelse og apoptose. Nyere fund dog foreslå en anden situation, hvor apoptose foregår i fravær af aktivatorproteiner. Først Huang og kolleger har vist, at Bak normalt afsondres af Mcl-1 og Bcl-XL, og Bak skal frigives fra både før det kan danne oligomerer [20]. Tanken om, at inaktivere nogle anti-apoptotiske proteiner uden hjælp fra nogle aktivator kan inducere apoptose, er ikke uden kontroverser [21], [22]. Vi går ind for ideen, fordi Huang og kolleger fandt, at inaktivere både Bd-XL og Mcl-1 var nok til at inducere apoptose i Bid og Bim knockout MEF’er [23], og Hayashi og kolleger fandt det samme i Bid og Bim mangelfuld blodplader celler [24 ].

Under forudsætning af, at Bim og Bud ikke er involveret i ABT-induceret apoptose, vi kan spekulere årsager til forskellige følsomheder til ABT-737. Da ABT-737 binder til Bd-XL, inaktivere det, men det binder ikke til Mcl-1, hvis der er færre Mcl-1-proteiner til stede, så effekten af ​​ABT-737 skal stige. Faktisk Huang og kolleger fandt, at ved at nedbryde Mcl-1 fra HeLa-celler med siRNA, blev de følsomme for ABT-737 [25]. Mange grupper også rapporteret inverse korrelationer mellem kræftcelle følsomhed over for ABT-737 og Mcl-1-ekspressionsniveauer i mange cancertyper (se Information S1). Men der er undtagelser; HL-60 humane promyerlocytic leukæmiceller udtrykker rimeligt store mængder Mcl-1, men de er ikke desto mindre, følsomme for ABT-737 [26]. Således hvordan ABT-737 inducerer apoptose i nogle cancerceller og ikke i andre, forbliver dårligt forstået.

Vi påbegyndte dette projekt med henblik på at søge efter midler, der kan øge effektiviteten af ​​ABT. Når vi co-behandlede humane tumorcellelinier med ABT og lægemidler, som interfererer med cancer specifik cellulær metabolisme, fandt vi, at 2DG forbehandling stærkt forbedret effektiviteten af ​​ABT uden at skade sunde celler. Vi viser, at 2DG-ABT inducerer apoptose uden at ændre Mcl-1-niveauer i ABT-resistente celler. Når kræftceller resistente over for ABT forbehandles med 2DG, protein niveauer af Mcl-1 forbliver de samme, men Bak-Mcl-1 association er tabt, sensibiliserende celler for ABT-induceret apoptose. Hvordan 2DG behandling af kræftceller forstyrrer Bak-Mcl-1 er ikke kendt. Cancercelle følsomhed over for ABT synes således at blive bestemt ikke blot af proteinniveauer af Mcl-1, men også af, hvor meget Bak afsondres ved dets association med Mcl-1.

Resultater

2DG-ABT effektivt inducerer apoptose af cancerceller

Anvendt som enkeltstof, 30 nM ABT-737 dræbte 90% af RS (4; 11) non-Hodgkins B-celle lymfom celler i 9 timer ( fig. 1a). Men en 1-times præinkubation af RS (4; 11) celler med 5 til 10 mM 2DG i medium indeholdende 10 mM glucose øget effektivitet ABT dramatisk og dræbte 90% af celler med kun 3 nM ABT-737. 2DG alene ikke forårsage celledød under 10-timers inkubation. Når vi testet for caspaseaktivering blev det konstateret, at så lidt som 1 nM ABT-737 kunne aktivere caspaser i 3 timer, så længe cellerne blev præinkuberet med 2DG i 3 timer. Nr caspaseaktivering ud over baggrunden blev observeret i celler, som blev inkuberet med 2DG alene. Således kan det konkluderes, at 2DG sensibiliserer RS ​​(4; 11) celler til ABT-induceret apoptose. Vi gentog eksperimentet under anvendelse af forskellige koncentrationer af ABT-263 og talt celler ved trypan-blåt farvestof scoring for døde celler 24 timer efter ABT tilsætning (fig. S1a). Resultatet viste også en synergistisk virkning af 2DG og ABT

a, RS (4; 11). Celler forbehandlet med 20 mM fructose eller 0-10 mM 2-deoxy-D-glucose i regelmæssig RPMI-medium indeholdende 12 mM glucose, i 1 time inden tilsætning af ABT-737 ved angivne koncentrationer. 9 timer senere blev cellerne analyseret ved FACS for Annexin-V positivitet. Chi Square Test of Independence for to variabler, 2DG og ABT, var P (x ~

1

2 193,35) = 0.000000. Da kombinationen var klart bedre end de forventede værdier, statistikken antyder synergistisk vekselvirkning mellem 2DG og ABT-737. b, HeLa-celler blev forbehandlet i 1 time enten med eller uden 10 mM deoxyglucose i DMEM indeholdende 12 mM glucose, før tilsætning ABT-737. Seks timer senere blev cellerne analyseret ved FACS for Annexin-V-farvning. c, HeLa-celler blev forbehandlet i 3 timer med 2DG før tilsætningen af ​​ABT-737. Celler blev analyseret for caspase aktivitet ved 3 timer efter ABT-737 tilføjelse. d, blev HeLa, PPC-1 og MCF-7-celler behandlet med 10 mM 2DG i 3 timer før tilsætning af 1 pM ABT-263 til inkubering natten over. Trypanblåt-negative (levedygtige) celler blev talt og plottes (gennemsnit ± std dev; n = 3). e, Kombinationsbehandling reducerer klonogen overlevelse PPC-1-celler. PPC-1-celler blev behandlet én gang i 24 timer med 5 mM 2DG, 1 pM ABT-263, begge, eller forblev ubehandlede. 250-1000 celler blev udpladet pr 30 mm skål, og 12 dage senere blev overlevende cellekolonier farves.

Dernæst testede vi, om 2DG kunne sensibilisere ABT-resistente tumorceller til ABT-737 eller ABT -263. Indledende forsøg blev udført under anvendelse HeLa cervical cancerceller. HeLa-celler blev forbehandlet i 1 time med 2DG før tilsætning af ABT-737. Ni timer efter tilsætning af 1 uM af ABT-737, ca. 35% af HeLa-celler, der var forbehandlet med 2DG, var Annexin V-positive (fig. 1b). Denne hastighed af celledød var sammenlignelig med den set efter behandling af HeLa-celler med 1 pM staurosporin (STS), en velkendt inducer af apoptose i HeLa-celler I et andet sæt eksperimenter, når HeLa-celler blev forbehandlet i 3 timer med 10 mM 2DG i et medium indeholdende 25 mM glucose, blev robust caspaseaktivering observeret inden for 3 timer ved koncentrationer på ABT-737 så lave som 0,1 uM (fig. 1c). Uden 2DG forbehandling, selv 10 uM ABT-737 ikke kunne aktivere caspaser i samme periode. Dette eksperiment blev også gentaget under anvendelse ABT-263 og scoring døde celler med trypan-blåt farvestof inkorporering (fig. S1b). Igen, det viste en synergistisk virkning af ABT-263 og 2DG. ABT-737 og ABT-263 blev sammenlignet side-by-side ved hjælp tre timers 2DG-forbehandling af HeLa-celler. ABT-263 var lidt bedre end ABT-737 i inducere apoptose (fig. S2a).

Betingelser for 2DG-ABT induceret apoptose

Kinetic og dosis-respons-undersøgelser med HeLa-celler viste følgende : (i) tilstedeværelsen af ​​glucose i mediet er nødvendig for 2DG-ABT induceret apoptose (fig S2b.), og den optimale molære forhold for apoptose induktion med 2DG: glucose er på ca. 0,4 til 1,0; (Ii) 2DG bør tilføjes 3 til 4 timer forud for tilsætningen af ​​ABT (fig S2C . D); og (iii) caspaseaktivering observeres inden for 3 timer ABT tilsætning. Disse betingelser kan afspejle stabiliteten af ​​ABT-263/737 i opløsning (ca. 4 timer [9]), såvel som beskaffenheden af ​​intercellulære signaler genereret af 2DG; det skal tage 3 til 4 timer for 2DG at generere et stærkt nok signal til at være effektive. Under disse betingelser, reduktionen i cellulære ATP-koncentrationen er meget lille (fig. 5a), hvilket tyder på, at ATP insufficiens ikke giver en forklaring på den forbedrede følsomhed over for ABT-737 og ABT-263.

Alle efterfølgende eksperimenter blev udført ved anvendelse af følgende betingelser: Tilføj 5-10 mM 2DG til cellekultur. Tre timer senere tilsættes 1-3 uM ABT. Assay for caspaseaktivitet og cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier tre timer efter ABT-behandling. Seks timer efter ABT-behandling, assay for Annexin V-farvning. 24 timer senere, tælle levedygtige celler ved trypan blåt farveeksklusion assay. Reaktionen på den protokol varierede fra cellelinje til cellelinje. Blandt cancerceller, der svarede godt var brystkræft cellelinien MCF-7 og hormon resistent prostatacancer-cellelinie PPC-1. I begge tilfælde blev over 95% af cellerne elimineres i 24 timer ved kombinationsbehandlingen (fig. 1d). Et enkelt middel anvendelse af 2DG forårsagede nogle dødsfald (31,3% for HeLa, ingen observeret i MCF-7, og 21,5% for PPC-1). Eftersom alle celler har varieret mængder af glykogen som lagret kilde til glucose, satserne for celledød ved 2DG var høj grad afhængig af tidligere historie af dyrkede betingelser. Dyrkede celler, der normalt overvinde 2DG-induceret vækst-standsning og begynder at vokse i 24-48 timer (data ikke vist). Når endvidere 2DG blev injiceret i cancer-bærende mus, det bevirkede ikke tumorregression, men forsinkede tumorvækst med 5-6 dage. Efter denne korte forsinkelse, tumorer begyndte at vokse. Andre grupper havde gjort lignende observationer [4]. Årsagen til den erhvervede resistens over for 2DG er ikke kendt. Som en enkelt agent, effekten af ​​ABT-263 var også marginal (13,7% for HeLa, 3,1% for MCF-7 og 36,7% for PPC-1). Virkningerne af 2DG-ABT kombination langt oversteg de additive virkninger af 2DG og ABT i alle tre cellelinjer (HeLa forventet levedygtige celler 59%, observeret 25%, MCF7 forventede levedygtige celler 115%, observeret 3,8%, og PPC1 forventes levedygtige celler 49,7 %, observeret 3,9%). Den Klonogen Cell Survival assay viste også, at over 95% af PPC-1-celler blev elimineret ved blot én behandling, mens anvendelser af ABT eller 2DG enkelt middel var stort set ineffektive (fig. 1e). Eftersom p53 er inaktive i nogle af de yderst følsomme tumorlinjer herunder PPC-1 [27], [28], [29], konkluderer vi, at kombinationen apoptose er p53-uafhængig. De mulige årsager til forskellige reaktioner vil blive diskuteret senere.

For at forstå præcis, hvad molekylære begivenheder finder sted, når ABT tilsættes 2DG behandlede celler, besluttede vi først at undersøge, hvilken type af apoptose bliver induceret af kombination af 2DG og ABT.

Kombinationsbehandling med 2DG og ABT inducerer apoptose gennem den intrinsiske pathway

det er blevet rapporteret, at anvendelsen af ​​10 nM ABT-737 i blot 2 timer forårsager mitokondrie ydre membran til at sprænges i kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) -celler [30]. Dette er ikke et normalt fænomen i apoptose. Cytochrom c er normalt frigives gennem mitokondrie outermembrane porer i ordentlig måde [31]. Ødelæggelsen af ​​mitokondrier sker længe efter cytochrom c-frigivelse af aktiviteterne i fuldt aktiverede celledød machineries. Når vi undersøgte HeLa celler behandlet med 2DG-ABT kombination under anvendelse EM blev brud på mitochondriske ydre membraner ikke påvist (fig. 2a). I ABT-behandlede celler imidlertid let afkortning af mitokondrier blev observeret (fig 2b . C); fra 0,717 +/- 0,05 pm for ubehandlet til 0,530 +/- 0,05 pm for ABT kun, 0,553 +/- 0,06 um for 2DG + ABT, og let forlængelse af mitokondrier i 2DG-behandlede celler ved 0,844 +/- 0,05 pm. Vi spekulere, at siden Bd-XL og Bcl-w er kendt for at være involveret i mitokondriel fusion /fission [32], kan ABT har hæmmet deres aktiviteter. Med hensyn til forlængelse af mitokondrier under 2DG, det kan have skabt en øget efterspørgsel efter mitokondrie respiration, og for at opfylde denne byrde, mitokondrier kan være blevet længere. Selvom 2DG og ABT havde modsatte virkninger på længden af ​​mitokondrier, de begge påvirkede fysiologier af mitokondrier. Selvom nogle gætter på, at mitokondrier fusion /fission maskiner også kan spille en rolle i apoptose, idéen forbliver kontroversielle [33].

HeLa celler behandlet med enten 10 mM 2DG i 6 timer, 1 uM ABT-263 til 3 timer, eller 2DG i 3 timer før tilsætning af ABT-263 i yderligere 3 timer, eller ubehandlet. a blev celler fikseret til elektronmikroskopi (se metode). Tre celler fra hver behandlingsgruppe blev undersøgt nøje for længden af ​​mitokondrier. Vi har ikke observere en enkelt forekomst af bristede mitokondrie outermembranes. b, Fra hver celle, mindst 12 mitokondrier blev tilfældigt udvalgt til måling. c, gennemsnitlige længder af mitokondrier blev kortere med behandlinger indeholdende ABT-263 (gennemsnit +/- std dev). Da ABT-263/737 binder sig til Bcl-2 familiemedlemmer, der er kendt for at være involveret i mitokondriel fusion /fission kan ABT have ændret balancen i mitokondrie fusion /fission til fission side (p = 0,0001, 95% konfidensinterval af denne forskel:. 14,5407-37,2513; uparrede t-test)

for at afgøre, om 2DG-ABT-induceret apoptose er gennem indre vej, vi brugte vildtype (wt) mus embryo fibroblaster (MEF’er) og Bax /Bak dobbelt knockout (DKO) MEF’er. Disse DKO celler mangler den indre vej. I vildtype MEF forbehandlet med 2DG blev caspaseaktivering induceret inden for 3 timer ABT tilføjelse (Fig. 3a). Der var imidlertid ingen hurtig caspaseaktivering i Bak /Bax DKO MEF’er. Vi konkluderede derfor, at 2DG-ABT-induceret apoptose forekommer ved Bak /Bax-afhængige indre vej (se også fig. S5a).

a, Wt, og Bax /Bak DKO MEF’er blev behandlet med 10 mM 2DG i 3 timer før tilsætning af 3 uM ABT-263 i 3 timer. 3 timer senere blev celler høstet for caspase aktivitetsassays. (Se også fig. S5a). b blev HT1080-celler behandlet med eller uden 2DG i 3 timer. Derefter blev cellerne behandlet med enten 1 uM STS eller anti-Fas (CD95) antistof ved angivne koncentrationer (pg /ml). Celler blev høstet 3 timer efter, og analyseret for caspase-aktivitet. Interessant 2DG synes at have blandet sig Fas-induceret apoptose. I gentagne forsøg, vi observerede konsekvent lavere caspase aktivering i 2DG forbehandlede celler, men de grader af hæmmende aktivitet varierede fra forsøg til forsøg. Vi er ikke sikker på dens årsag. C, i de første 3 timer, HeLa-celler blev enten behandlet med 10 mM 2DG eller venstre ubehandlet og derefter behandlet med 10 pM Z-VAD, 1 pM ABT-737, begge eller ingen af ​​delene i yderligere 3 timer. Cellerne blev fikseret og farvet for DNA (rød) og cytochrom c (grøn) og undersøgt for tab af cytochrom c-farvning som beskrevet i Methods. Bar indikerer 100 um. De repræsentative billeder er vist i fig. S3. Denne graf viser procentdelen af ​​celler med tab af cytochrom c-farvning. Kombinationsbehandlingen havde højere celler med frigivet cytochrom c (p = 0,008 ved uparret t-test). d, Celler behandlet som ic var fraktioneret og cytosolisk fraktioner blev analyseret ved Western blotting.

For at teste, om 2DG sensibiliserer også tumorceller til ydre vej af apoptose, vi brugte HT1080 celler, hvor der er ingen krydstale mellem de indre og ydre veje [34]. Forbehandling af HT1080 celler med 2DG i 3 timer forøgede ikke Fas-induceret apoptose men sænkede caspaseaktivering (fig. 3b). Således har 2DG ikke øge den ydre vej.

2DG-ABT inducerer cytochrom c-frigivelse via en caspase-afhængig mekanisme

Et kritisk trin i indre vej er udgivelsen af ​​cytochrom c fra mitokondrier . Når 1 uM ABT-737 blev anbragt på HeLa-celler, der var blevet forbehandlet med 2DG i 3 timer, observerede vi frigivelse af cytochrom c i over 30% af cellerne inden for de næste 3 timer, men ikke i ubehandlede celler eller celler behandlet med enten 2DG eller ABT alene (fig. 3c og fig. S3).

i kanoniske mitokondrier-afhængige former for apoptose såsom staurosporine-, etoposide- eller UV-induceret celledød, frigivelse af cytochrom c fra mitokondrierne forekommer opstrøms for caspaseaktivering og kan forløbe i nærvær af caspaseinhibitorer [35], [36]. Derimod under dødsreceptor-induceret apoptose, caspaser aktiveres af disse receptorer kan også spalte Bid protein, der producerer trunkeret Bud (tBid), med tBid derefter inducere Bak /Bax oligomerisering og dannelsen af ​​porer på den mitokondriske ydre membraner, gennem hvilke cytochrom c undslipper. Således er en pan-caspase inhibitor, såsom z-VAD blokke dødsreceptor-induceret cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier. Vi fandt, at 2DG-ABT-induceret cytochrom c-frigivelse også blev blokeret af z-VAD, når det tilsættes synkront med ABT (fig 3c .. D, Fig S2), men vi viste, at 2DG-ABT induceret apoptose er Bax /Bakkes afhængig. Denne gåde kunne forklares ved et Bud-afhængig amplifikation loop, hvor en lille mængde af cytochrom c frigivet af ABT kunne aktivere en kaskade af caspaser (såsom caspaser 9,3,6 og 8) i cytosolen, spaltning Bid at generere tBid , med tBid gengæld aktiverer Bak /Bax og forårsager yderligere frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier [37], [38].

virkningerne af Bid udtømning på 2DG-ABT-induceret apoptose

Vi udforskes, om den hypotese Bid-amplifikationssystem loop spiller en rolle i 2DG-ABT-induceret apoptose. Først, vi fastslået, om Bud spaltes under 2DG-ABT induceret apoptose. I både HeLa og PPC-1-celler, 2DG forbehandling efterfulgt af tilsætning af 1 pM ABT-263/737 inducerede cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier i 3 timer. I begge celletyper, blev udgivelsen af ​​cytochrom c blokeret af z-VAD-fmk. Med PPC-1 linje, næsten 100% af cellerne frigivne cytochrom c, der forårsager næsten 100% apoptose. Med HeLa-celler, andelen af ​​celler, som viser cytochrom c-frigivelse inden for de første tre timer var ca. 30% (fig. 3c). Trunkeret tBid blev set 3 timer efter tilsætning af ABT i PPC-1 og HeLa-celler (fig. 4a, data ikke vist). tBid var til stede i celler behandlet med 2DG alene. Når z-VAD-FMK blev tilføjet med ABT blev spaltningen af ​​Bid blokeret.

a, Bud er aktiveret under 2DG-ABT induceret apoptose. Western blots af PPC-1-cellelysater blev behandlet med 10 mM 2DG i 0-6 timer (venstre panel), med enten 1 uM ABT-263 alene eller ABT-263 + 10 uM z-VAD for de sidste 3 timer (højre panel) , probet med anti-tBid antistof (øverste paneler), anti-Opa1 antistof (midterste paneler), og anti-alfa-tubulins (lavere paneler). Bemærk: tabet af Opa-1-L blev anvendt som en markør for gentegnet mitokondriel cristae under cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier [34]. b, Virkningerne af Bid udtømning på 2DG-AB-induceret apoptose. Indsæt: western blots af PPC-1 cellelysater, mock transficeret (venstre vognbane) eller transficeret med Bid siRNA (højre bane). Bud (+) og Bud (-) PPC-1-celler blev behandlet med enten 2DG, ABT-263 (1 uM), begge, 10 uM ABT-263, eller venstre ubehandlet i 24 timer. De levedygtige celler blev talt og stigningen /faldet i løbet af de indtastede tal blev afbildet. c, I PPC-1-celler enten forbehandlet med 2DG i 3 timer eller uden forbehandling, derefter 1 pM ABT-263 eller 1 uM STS blev tilsat i tre timer, og cytosoliske fraktioner blev analyseret ved western blots. I parallelle forsøg, Bid-depleteret PPC-1-celler blev behandlet med kombinationen af ​​2DG og ABT-263 eller med STS og analyseret (betegnet Bid kd, sidste 2 baner). Celler blev høstet 3 timer efter ABT /STS behandling, og cytosolisk fraktioner blev analyseret med Western blotting.

For at bestemme hvilken virkning, om nogen, Byd har på 2DG-ABT-induceret apoptose, vi tømt den byde protein ved siRNA. 2DG-ABT-induceret apoptose blev stort set blokeret i Bid-depleterede PPC-1-celler. Bid udtømning øgede procentdele af levedygtige celler ved ~8 gange (p 0,0077; uparret t-test) (figur 4b.). Mængderne af frigivet cytochrom c korreleret med apoptotiske satser (Fig. 4c). Således er den Bid-afhængige amplifikation loop kræves til effektiv 2DG-ABT induceret apoptose. Byd udtømning havde en lignende effekt på apoptose induceret af 10 pM ABT-263, men effekten var mindre på STS-induceret apoptose (data ikke vist og figur 4b c.). Endelig Byd KO MEF vises også reduceret følsomhed over for 2DG-ABT-behandlinger (fig. S5A). Vi konkluderede, at Bud spiller en væsentlig rolle i 2DG-ABT-induceret apoptose.

Søg efter 2DG effektorer

Siden 2DG-ABT kombination-induceret apoptose er Bax /Bak-afhængige, undersøgte vi virkninger af 2DG på Bax og Bak i løbet af tre timer før inkubation. Nogle celler dyrket under hypoxiske forhold eller i glucose-udtømte medier i længere perioder, bliver sensibiliseret til apoptose [39], [40], [41]. Selv om der ikke findes en universel markør for cellulær følsomhed for apoptose, er Bax kendt at translokere til mitokondrierne før apoptose og nekrose i nogle tilfælde [41]. Bax translokation synes også at være et særskilt skridt, og ikke nødvendigvis i takt med dens aktivering [42]. Men i HeLa-celler behandlet med 2DG alene, Bax translokation blev ikke induceret i mindst 16 timer (fig. S4A). Til forskel i celler dyrket i glucose-depleterede medier, Bax translokation ikke finde sted under 2DG præ-inkubationsperiode. Endvidere reagerede Bax knockout MEF’er til 2DG-ABT-kombinationsbehandling (fig. S5a), hvilket antyder, at Bax ikke kan spille en kritisk rolle ved priming af cancerceller ved 2DG. Selvfølgelig i fravær af Bak, Bax allerede være på mitokondrier, spiller rollen som Bak og Bax kan aktiveres af en anden mekanisme, når den er i mitokondrierne [43].

Fordi 2DG kan påvirke glycosylering, kan 2DG-behandling inducerer ER stress. Faktisk ekspression af ER stress markering, Grp74, blev observeret i HeLa-celler behandlet med 2DG i 2 til 4 timer (fig. 5b og fig. S4b). Vi antager, at hvis 2DG handler gennem ER stress, kan vi være i stand til at bevidstgøre HeLa celler til ABT-induceret apoptose ved at forbehandle dem med andre ER stress induktorer som thapsigargin. Men dette var ikke tilfældet (fig. S4C). Således 2DG synes at bevidstgøre tumorceller til Bcl-2-antagonister gennem mekanismer, der ikke er afhængige af glukose-udtømning eller ER stress.

a, Effekten af ​​2DG på cellulære ATP-niveauer. Mængderne af ATP blev målt under HeLa-cellekultur med 10 mM 2DG i nærvær af 25 mM glucose i DMEM suppleret med 10% serum. B, Proteinprofiler under 2DG inkubering af HeLa-celler. Prøver blev taget fra HeLa-celler behandlet som i en og forskellige proteinindhold pro- og anti-apoptotiske proteiner blev analyseret ved Western blots. I dette eksperiment, ser vi stigninger i Bd-XL i den første time. Når vi gentog eksperimentet to gange, forblev Bd-XL-niveauer samme. c, Mcl-1-niveauer forblev uændret under 2DG-ABT-induceret apoptose. PPC-1-celler blev behandlet med 10 mM 2DG i 6 timer, 1 uM ABT-263 i 3 timer, eller 10 mM 2DG i 6 timer, hvoraf de sidste 3 timer blev inkuberet med 1 uM ABT-263. d, Bak og Mcl-1 ikke co-bundfald i 2DG behandlede celler. PPC-1-celler blev behandlet som i c. Bak og Mcl-1 blev immunpræcipiteret af specifikke antistoffer konjugeret til protein G-sepharose og de co-udfældede proteiner blev analyseret ved Western blots. Venstre Upper Paneler, Bak co-udfældninger, højre øvre Paneler, Mcl-1 co-udfældninger, og Venstre Lavere Paneler, Protein G-Sepharose udfældes. Af tekniske årsager kunne vi ikke immunpræcipitere Bd-XL og analysere dens indhold.

2DG afbryder Bak-Mcl-1 forening, priming celler til ABT-induceret apoptose

Det har været rapporterede, at dyrkning af celler i glukose-udtømte medium eller i nærværelse af 2DG til udvidet tid (24 timer eller længere), kunne sænke cellulære ATP-koncentrationer og prime forskellige celler for apoptose [39], [40], [44].