PLoS ONE: Anvendelse af et stabilt udtrykt FRET Biosensor til bestemmelse af Styrken af ​​Cancer Drugs

Abstrakt

Mange cancer medicin er beregnet til at dræbe kræftceller ved at inducere apoptose. Men styrken assays anvendes til måling af bioaktivitet af disse produkter er generelt cellelevedygtighedsassays, som ikke skelner mellem celledød og vækstinhibering. Her beskriver vi en cellebaseret fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) biosensor designet til at måle bioaktivitet af apoptoseinducerende cancerlægemidler. Biosensoren indeholder cyan fluorescerende protein (CFP) bundet via caspase 3 og caspase 8 specifik spaltning genkendelsessekvenser til gult fluorescerende protein (YFP). Ved caspaseaktivering, som i tilfælde af apoptose induktion, er linkeren spaltes afskaffe den cellulære FRET signal. Dette assay afspejler nøje virkningsmekanismen af ​​kræftlægemidler, dræbe cancerceller og kan derfor fungere som en styrketest for forskellige cancerlægemidler. Vi strengt demonstrere dette gennem karakterisering af en klasse af proteiner rettet mod dødsreceptorer. Ettrins-assay synes at være overlegen i forhold til andre apoptose-assays på grund af sin enkelhed, bekvemmelighed og robusthed

Henvisning:. Bozza WP, Di X, Takeda K, Rivera Rosado LA, Pariser S, Zhang B (2014) Anvendelse af et stabilt udtrykt FRET Biosensor til bestemmelse af styrken af ​​Cancer Drugs. PLoS ONE 9 (9): e107010. doi: 10,1371 /journal.pone.0107010

Redaktør: Wei Xu, University of Wisconsin – Madison, USA

Modtaget: April 28, 2014 Accepteret: August 10, 2014; Udgivet: September 4, 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Forfatterne bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle data er inkluderet i papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Critical Path Initiative fond; og Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Medicinsk modforanstaltninger Initiative fond. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Styrken er et mål for aktiviteten af ​​et lægemiddel i form af koncentration eller mængde, der kræves for at frembringe en defineret biologisk [1] virkning. Derfor bør en potens-assay konstrueres for at afspejle så meget som muligt de virkningsmekanismer af et lægemiddel. For onkogene lægemidler, som er beregnet til at dræbe kræftceller, ville en potens-assay være et mål for stoffets cytotoksicitet i kræftceller. Historisk blev mange kemoterapeutiske midler identificeret ved screening med højt gennemløb af sammensatte biblioteker under anvendelse cellelevedygtighedsassays med MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) eller andre beslægtede farvestoffer [2], [3]. Denne analyse format er blevet bredt vedtaget som en styrke test i udviklingen af ​​kræftmedicin. Imidlertid kan cellelevedygtighedsassays ikke skelne mellem celledød og vækststandsning effekter, hvilket efterlader en hage ved vurderingen af ​​den sande bioaktivitet af en cancer lægemiddel. Som et mål for cancerterapi er at dræbe cancerceller, er det kritisk at vurdere evnen af ​​et lægemiddel til at inducere celledød. Den form for celledød mest almindeligt tilknyttet kræftbehandling, både

in vivo

in vitro

er apoptose, eller programmeret celledød.

Et kendetegn for apoptose er den aktivering af caspase proteaser, hvilket resulterer i spaltning af strukturelle proteiner og apoptotisk legemers dannelse [4]. Der er to forskellige mekanismer, nemlig indre og ydre, der fører til caspaseaktivering som reaktion på en lægemiddelbehandling. Klassiske kemoterapier såsom etoposid, compactin, fluorouracil (5-FU), taxol og camptothecin inducerer caspase 3-aktivering i en p53-afhængig måde [5] – [7] indebærer ofte mitokondrielle forandringer. Derimod en ny klasse af proteiner rettet mod død receptorer udtrykt på celleoverfladen er under udvikling [8] – [11]. Disse proteiner indbefatter det rekombinante humane tumornekrosefaktor (TNF) varianter, TNF-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) og død receptoragonistiske antistoffer. TRAIL binder til dødsreceptor 4 og /eller 5 (DR4 /5) og efterfølgende inducerer samling af en død-fremkaldende signaler kompleks (DISC) indeholdende adapter protein Fas-associeret protein med dødsdomænet (FADD) og pro-caspase 8. Senest DISC, pro-caspase 8 bliver aktiveret ved selv-spaltning og frigives i cytosolen, hvor det aktiverer caspase 3. i nogle celletyper, den apoptotiske signalering forstærkes yderligere

via

mitokondrierne som et resultat af den translokation af caspase 8 medieret spaltning af bud (BH3 interagerende domæner protein). Således kan styrken af ​​en cancer lægemiddel vurderes ved måling af størrelsen af ​​caspaseaktivitet i behandlede celler. En metode til måling af caspaseaktivitet har været anvendelsen af ​​fluorescerende prober indeholdende caspase substrater, der viser ændringer i fluorescensintensitet upon caspaseaktivering [12] – [16]. Alternativt kan aktive caspaser påvises ved immunoblotanalyse ved anvendelse af antistoffer specifikke for det kløvede form af det enkelte enzym [14], [17] – [19]. Dog kan disse assays være forbundet med stor variation på grund af komplekse drift procedurer. I denne undersøgelse har vi udviklet et cellebaseret FRET assay til afprøvning af styrken af ​​cancer produkter. FRET proben indeholder genkendelsessekvenser for både caspase 3 og caspase 8 og viste sig at være følsomme overfor cancer lægemidler, der virker gennem indre eller ydre reaktionsveje. Navnlig med stabilt udtrykt FRET-probe, er lægemiddelinduceret reaktion overvåges direkte på de behandlede celler uden yderligere procestrin. Desuden FRET assay detekterer celler, som undergår apoptose med markant følsomhed og eksperimentel enkelhed, gør det en lovende potens assayet til måling af cancerlægemidler.

Materialer og metoder

Cellelinier og reagenser

MDA-MB-231 human brystcancer cellelinje blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). En pCMV6-AC plasmid til ekspressionen af ​​et fusionsprotein (552 aminosyrer), der indeholder fuld-længde cyan fluorescerende protein (CFP) og gult fluorescerende protein (YFP) bundet via en caspase genkendelsessekvens blev indkøbt fra OriGene (Rockville, MD). Linkeren mellem FFP og YFP indeholder seksten aminosyrer, GSGDEVDGGIETDGSG, som kan spaltes af aktiveret caspase 3 ved G ↓ DEVD eller caspase 8 ved G ↓ IETD, hvor ↓ angiver protease cut site. Den kodende cDNA-sekvensen (1656 basepar) for FFP-linker-YFP fusionsproteinet blev klonet i pCMV6-AC vektoren ved SGF I og Mlu I restriktionssites, og den korrekte konstruktion blev verificeret ved nukleotidsekventering. Plasmidet blev transficeret i MB231 celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens pr producentens anvisninger (Invitrogen, Carlsbad, CA). Transficerede celler blev selekteret mod neomycin (G418) ved 1 mg /ml (Corning Cellgro, Manassas, VA). G418-resistente kloner blev opsamlet under anvendelse af kloningscylindre (Millipore, Temecula, CA) og testet for fluorescens intensitet og protein ekspressionsniveauer. Den stabile klon med den højeste ekspressionsniveauerne af den fælles fiskeripolitik-linker-YFP sonde, benævnt som MB231_CFP-YFP blev anvendt i de følgende analyser. Celler blev holdt i DMEM /F-12 50/50 medium suppleret med 5% FBS, 4 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 0,4 mg /ml G418 sulfat. Parentale MB231-celler blev dyrket i de samme medier uden tilsætning af G418 sulfat. Både rekombinant humant TRAIL (rhTRAIL, Cat # 375-TEC) og et agonistisk monoklonalt antistof (Cat # MAB631) specifikke for dødsreceptoren 5 blev indkøbt fra R dette hjælper med at opnå et forbedret signal-til-støj-forhold og undgår høje baggrund subtraktioner som kan komplicere FRET beregninger. Derudover vores arbejde har strengt fokuseret på egnetheden af ​​den beskrevne assay i at fungere som en styrketest for komplekse proteinlægemidler der er målrettet mod dødsreceptorer mens andre arbejder primært har fokuseret på små molekyler lægemiddelforskning.

En begrænsning af vores assay vedrørende tilgængeligheden af ​​molekylære target (s) i MDA-MB-231-celler for et specifikt medikamentmolekyle. For eksempel er MDA-MB-231-celler vides at være defekte i ekspressionen af ​​HER2-receptoren og dermed gøre assayet ubrugelig til evaluering anti-HER2 monoklonale antistoffer, der er godkendt til anvendelse ved behandling af brystkræft.