PLoS ONE: Withaferin A alene og i kombination med cisplatin blænder Vækst og metastaser af kræft i æggestokkene ved Målretning Formodede Cancer Stem Cells

Abstrakt

I øjeblikket er behandling for kræft i æggestokkene indebærer cytoreduktive kirurgi efterfulgt af kemoterapi, hovedsageligt, carboplatin kombineret med paclitaxel. Selvom dette regimen indledningsvis effekt i en høj procentdel af tilfældene, desværre inden for få måneder efter første behandling, tumor tilbagefald opstår på grund af platin-resistens. Dette tilskrives kemo-modstand cancer stamceller (CSCS). Heri viser vi for første gang, at withaferin A (WFA), en bioaktiv forbindelse isoleret fra planten withania somnifera, når de anvendes alene eller i kombination med cisplatin (CIS) er rettet mod formodede CSCS. Behandling af nøgne mus med ortotopisk ovarietumorer genereret ved injektion af human ovariecancer epithelcancer cellelinje (A2780) med WFA og cisplatin (WFA) alene eller i kombination resulterede i en reduktion 70 og 80% i tumorvækst og fuldstændig inhibering af metastase til andre organer sammenlignet med ubehandlede kontroller. Histokemisk og Western blot analyse af tumorer viste, at inddragelse af WFA (2 mg /kg) resulterede i en meget signifikant eliminering af celler, der udtrykker CSC markører – CD44, CD24, CD34, CD117 og Oct4 og nedregulering af Notch1, Hes1 og Hey1 gener. I modsætning behandling af mus med CIS alene (6 mg /kg) havde modsat virkning på disse celler. Stigning i celler, der udtrykker CSC markører og Notch1 signalvejen i tumorer udsat for CIS kan forklare gentagelse af kræft hos patienter behandlet med carboplatin og paclitaxel. Da WFA alene eller i kombination med CIS eliminerer formodede CSCS, konkluderer vi, at WFA i kombination med CIS kan udgøre mere effektiv terapi for kræft i æggestokkene

Henvisning:. Kakar SS, Ratajczak MZ, Powell KS, Moghadamfalahi M, Miller DM, Batra SK, et al. (2014) Withaferin A alene og i kombination med cisplatin blænder Vækst og metastaser af kræft i æggestokkene ved Målretning Formodede Cancer Stem Cells. PLoS ONE 9 (9): e107596. doi: 10,1371 /journal.pone.0107596

Redaktør: Deodutta Roy, Florida International University, USA

Modtaget: 16. juli 2014 Accepteret: August 5, 2014; Udgivet: 29 September, 2014

Copyright: © 2014 Kakar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Jeg bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne i mit studie er frit tilgængelige i manuskriptet

Finansiering:. NIH /NCI CA124630, James Graham Brown Cancer Center forskningsmidler, School of Medicine Basic Forskningsprogram Research Grant. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Medforfatter Surinder Batra er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) er fortsat den førende dødsårsag hos kvinder blandt gynækologiske kræftformer og er den 5. største årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt kvinder i USA [1], [2]. Størstedelen af ​​ovariecancer er diagnosticeret på fremskredent stadium på grund af de hovedsagelig ikke-specifikke symptomer. I øjeblikket er behandling for ovariecancer indebærer cytoreduktiv kirurgi efterfulgt af kemoterapi, især med platin /taxan kombination [3]. Selvom dette regimen indledningsvis effekt i en høj procentdel af tilfældene (70 til 80%), desværre 70% af kvinder udvikler tilbagevendende kræft inden for få måneder efter indledende behandling som følge af platin-resistens [4], [5]. Desuden er cisplatin (CIS) tilknyttet flere alvorlige bivirkninger, såsom kvalme, opkastning, myelosuppression, hepatotoksicitet, neurotoksicitet, nefrotoksicitet og ototoksicitet [4], [6] – [9]. Derfor behov for nye behandlingsmuligheder, der er målrettet kræftceller særlig formodede cancer stamceller er obligatorisk enten ved første-line indstilling eller endnu mere på første og anden linie styring af tilbagevendende kræft i æggestokkene.

I vores tidligere undersøgelser [10], viste vi for en første gang, at withaferin a (WFA), en bioaktiv forbindelse isoleret fra planten withania somnifera, når de anvendes alene eller i kombination med CIS havde en tids- og dosisafhængig synergistisk virkning på hæmningen af celleproliferation og induktion af celledød, hvilket reducerer nødvendige dosis af cisplatin. Vi viste også, at mens WFA opnår sin antitumorvirkning gennem generering af ROS fører til DNA-beskadigelse, CIS opnår dens virkninger dog direkte binding til DNA forårsager dannelse af DNA-addukter. Kombinationsbehandling resulterede også i en betydelig forøgelse af reaktive ilt arter (ROS) produktion og DNA skader.

WFA har været en del af indisk traditionel medicin i århundreder. Den er tilgængelig i USA over-the-counter som et kosttilskud, og er kendt for at behandle forskellige sygdomme på grund af dets anti-inflammatoriske [11], [12], anti-bakterielle [13], og cardio beskyttende egenskaber [14]. I de senere år har WFA blevet foreslået som et potentielt anti-cancer forbindelse vist sig at forebygge tumorvækst, angiogenese og metastase [15], [16] i forskellige typer cancer [17] – [26]. Mekanismer, som WFA når sin anticancer aktivitet, omfatter inaktivering af Akt og NF-KB [27] for at opnå apoptose, fald i pro-overlevelse protein Bcl-2 [28], G2 /M-cellecyklusstandsnings [29], [30], generation af reaktive ilt arter (ROS) [31], [32], induktion af Par-4 [17], aktivering af caspase 3 og 9 aktiviteter, DNA-skader [10], hæmning af HSP90 [20], regulering af FOXO3a og Bim [15] hæmning af Notch-1 [33] og nedregulering af ekspressionen af ​​HPV E6 og E7 oncoproteiner [19].

Udvikling af resistens over for lægemidler og gentagelse af kræft i æggestokkene har været et stort klinisk problem. er blevet foreslået en række mekanismer, der inducerer resistens. I løbet af de sidste mange år har der været stigende dokumentation for, at “cancer stamceller (CSCS)”, er den vigtigste udløsende faktor for tumor progression, kemo-modstand og tilbagefald efter initial behandling [34], [35]. Først beviser for eksistensen af ​​cancer stamceller kom i år 1997, med identifikationen af ​​leukæmi stamceller [36], [37]. I år 2003, Al-Hajj et al. [38] eksperimentelt demonstreret den hierarkiske stamcelle oprindelse i brystkræft. Men indtil for nylig eksistensen af ​​formodede cancer stamceller inden solide tumorer var forblevet kontroversiel [39]. I de seneste undersøgelser under anvendelse af murine modeller for hjernen, huden og intestinale tumorer, har tre uafhængige grupper billede overbevisende evidens for eksistensen af ​​CSCS i tumorer og deres rolle i tumorekspansion [40] – [42]. Derfor CSCS inden tumor masse undergår selv-fornyelse og giver anledning til heterogene kræft slægter, der omfatter tumorvæv. CSCS oprenset i overensstemmelse hermed til nogle overflademarkører kan danne tumorer, når de injiceres i nøgne mus [36], [43], [44]. Da, kræft i æggestokkene er meget heterogen; forskellige celleoverflademarkører er blevet rapporteret for formodede æggestokkene CSCS. Mest almindeligt rapporteret omfatter CD24, CD34, CD44, CD133, CD117, ALDH1, Oct4, MyD88 og EpCAM [45] – [53]. Da er CSCS for at være store aktører, der er ansvarlige for at udvikle resistens over for lægemidler og dermed fører til kræft tilbagefald [52], [53], er rettet mod CSCS og hæmmer deres selvfornyelse vil føre til reduktion af væksten kræft [33].

i vores nuværende undersøgelse viser vi for første gang, at WFA alene eller i kombination med CIS hvis de anvendes til at behandle mus, der bærer humane ortotopisk ovarietumorer ikke kun undertrykker tumorvækst men er målrettet mod celler, der udtrykker CSC markører samt inhiberer Notch1 og dens nedstrøms signalering gener (Hes1 og Hey1), der er blevet rapporteret til at spille en afgørende rolle i selv-fornyelse og vedligeholdelse af CSCS (33).

Materiale og metoder

Cell linje og cellekultur

ovarieepitelceller cancercellelinie A2780 blev oprindeligt opnået fra Denise Connolly (Fox Chase cancer center) og blev opretholdt i RPMI 1640-medium indeholdende insulin og suppleret med penicillin /streptomycin (100 IU /ml og 100 ug /ml) og 10% kalvefosterserum (FCS) (Hyclone, Atlanta, GA) som tidligere beskrevet [10].

cellemigrering Boyden kammer assays

Cell migration in vitro blev analyseret ved bestemmelse af evnen af celler til at vandre gennem en syntetisk basalmembran. Den anvendte procedure var som beskrevet tidligere [54]. Kort fortalt blev polycarbonatfiltre (8 uM) anbragt i modificeret Boyden kammer. A2780 celler i log-fase blev trypsinbehandlet og udpladet i 6 brønds plader. Efter 24 timers udpladning blev cellerne behandlet med WFA og CIS både alene og i kombination som tidligere [10] beskrevne. Efter 24 timers behandling blev cellerne trypsiniseret og suspenderet i serumfrit medium. I alt 2 × 10

5 celler blev overført til øverste kammer. Mediet indeholdende 5% FBS blev tilsat til det nederste kammer. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 24 timer og fik lov til at migrere gennem membranen. Ikke-migrerede celler blev fjernet med en ren vatpind. Migrerede celler på anden side af membranen blev farvet med krystalviolet og talt i tre forskellige felter under Olympus mikroskop. Forsøgene blev gentaget tre gange. Værdierne repræsenterede er gennemsnittet ± SEM af tre uafhængige forsøg.

Generering af ortotopisk ovarietumorer i nøgne mus og behandling med WFA og CIS både alene og i kombination

orthotopisk ovarietumorer blev dannet ved indsprøjtning ovariecancer cellelinie A2780 direkte ind ovarie som beskrevet af Nunez Cruz et al. [55]. Kort fortalt, A2780 (1 × 10

6) celler blev injiceret direkte i venstre æggestok af 5 til 6 uger gamle nu /nu hunmus (Jackson Laboratory) under aseptiske betingelser og under let anæstesi. Efter 10 dages post-celle injektion blev mus behandlet med 1) vehikelkontrol (10% DMSO og 90% glyceryl trioctanoate), 2) WFA 2 mg /kg, 3), CIS 6 mg /kg, og 4) WFA 2 mg /kg plus CIS 6 mg /kg. Fem dyr tilfældigt blev inkluderet i hver gruppe. CIS i saltvand blev injiceret i.p. en gang om ugen, mens WFA blev injiceret i.p. hveranden dag. Efter 4 ugers behandling blev dyrene aflivet; tumor og andre væv, såsom un-injicerede æggestok, lunge, nyre, lever, binyre og hjerte blev indsamlet fra hver mus. Tumorer blev vægtet på tidspunktet for indsamlingen. De tumorer og andre væv blev delt i to dele, den ene del var hurtigt nedfrosset, og den anden del blev fikseret i 10% pufret formalin. Dyrenes eksperimenter blev godkendt af University of Louisville, Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) (protokol # 12063).

Formalin fast tumor og væv blev behandlet og indlejret i paraffin ved hjælp af standard protokoller som beskrevet tidligere [56]. Fem uM tykke sektioner af de indlejrede tumorer og væv blev fremstillet og farvet med Hematoxylin og Eosin (H 0,05 bestemt ud fra den tosidede test blev betragtet som signifikant. Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af SPSS 10.0 software.

Resultater

WFA /kombination CIS hæmmer celle migration in vitro

Forskellige skridt er involveret i tumorprogression og metastase, herunder detachement af tumorceller fra den primære tumor site, transmigration i lymph- eller blodkar, tilknytning til endotel på fjerne steder i metastase efterfulgt af såning i nye placering og efterfølgende ekspansion. For at undersøge effekten af ​​WFA og CIS på A2780 celle migration, vi behandlede A2780 celler med WFA og SNG både alene og i kombination i 48 timer. Som vist i fig. 1, ved at anvende Boyden-kamre bemærkede vi, at behandling af celler med WFA eller CIS alene inhiberede celle migration på en dosisafhængig måde sammenlignet med ubehandlede kontrolceller. Mens behandling af celler med 20 pM CIS inhiberede cellemigration, tilsætning af WFA (0,5 uM eller 1,5 uM) til CIS resulterede i forøget inhibering af cellemigration, hvilket antyder, at WFA kombineret med CIS er mere effektiv end hvert middel anvendes.

A2780 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af WFA og CIS både alene og i kombination i 48 timer. Cellerne blev trypsiniseret og underkastet for cellemigrering under anvendelse Boyden kammer. Celler blev farvet med krystalviolet og fotograferet (A). De farvede celler blev talt under mikroskop under anvendelse af tre forskellige områder; anførte værdier er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. * Repræsenterer signifikant sammenlignet med kontrol ved p ≤ 0,05 (B). Con = kontrol, W = WFA. Værdier vist i parentes er uM.

WFA /kombination CIS undertrykker tumorvækst og metastase i nøgne mus

I vores

in vitro

undersøgelser, vi viste, at behandling af CIS-sensitive cellelinjer (A2780 og CaOV3) samt CIS-modstand cellelinje (A2780 /CP70) med WFA og CIS både alene og i kombination inhiberede celleproliferation på en tids- og dosisafhængig måde og induceret celle apoptose og DNA-beskadigelse. Desuden den samlede virkning af WFA og CIS var synergistisk [10]. For at vurdere effekten af ​​WFA kombination /CIS på tumorvækst og metastase in vivo, vi testede effekten af ​​WFA og CIS både alene og i kombination på tumorvækst og metastase i nøgne mus, der bærer podede ortotopisk humane tumorer i æggestokkene. Murin ortotopisk tumorer blev oprettet ved injektion A2780 celler direkte ind venstre æggestok af 5 til 6 uger gamle nu /nu hunmus. Begyndende fra dag 10 efter podning med tumorceller blev dyrene behandlet med WFA og CIS både alene og i kombination som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Efter 4 ugers behandling blev dyrene aflivet. Vi har bemærket, at kontrolsystemerne mock-behandlede dyr udviklede meget vaskulariserede og store tumorer (fig. 2). Samtidig 4 ud af 5 WFA (2 mg /kg) alene-behandlede dyr udviklede tumorer, der var betydeligt mindre i størrelse. Tilsvarende 3 ud af 5 dyr behandlet med CIS (6 mg /kg) udviklede tumorer, der var betydeligt mindre i størrelse sammenlignet med mock-behandlede kontroller. Desuden behandling af dyr med WFA (2 mg /kg) i kombination med CIS (6 mg /kg) resulterede i 70 til 80% reduktion i tumorvægt sammenlignet med ubehandlede kontroldyr (fig. 2) og ud af 5 mus, der kun tre mus udviklede tumorer. Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i tumor vægt i mus behandlet med WFA og SNG alene eller i kombination (Fig 2)

A:. 1 × 10

6 A2780 celler blev injiceret i hunmus æggestok. Efter 10 dages post-injektion blev musene behandlet med WFA og CIS både alene eller i kombination i fire uger. Mus blev aflivet; tumorer blev udskåret ud, fotograferet og vægtet. Tumorer vist er repræsentant fra hver gruppe. B: Tumorer vægt blev plottet fra hver gruppe. Vandret linie repræsenterer median vægten af ​​hver gruppe. Behandlede gruppe viste signifikant lavere vægt end ubehandlede mus. Resultaterne er middelværdien (rød linje) og ± SD (lodret streg). * Repræsenterer signifikant sammenlignet med kontrol ved p ≤ 0,05

H . E histo-patologiske analyse af ikke-injicerede modsatte æggestokke, lever og lunger viste metastaser til lever og æggestokke i mock- behandlede dyr kun . Metastatiske celler omfattede -10% af celler i disse organer (fig. 3). I modsætning hertil blev der ikke observeret metastaser i WFA og CIS behandlede grupper. Disse resultater antyder, at kombinationen af ​​lav dosis af WFA (2 mg /kg) med suboptimal dosis af CIS (6 mg /kg) er meget effektive til at undertrykke tumorvækst og metastase af ortotopisk ovarietumorer i nøgne mus. Dette indikerer, at det ville være muligt at reducere terapeutisk dosis af CIS, når det kombineres med WFA i mennesker til forbedring bivirkninger forbundet med høje doser af CIS.

Mus blev behandlet med WFA og CIS som angivet i figur 2. Tumorer og andre væv sektioner blev farvet med H & E og undersøgt af en uddannet patolog. Metastase (vist med pile) blev observeret i un-injicerede æggestokke og lever og udgør ca. 10% af cellerne.

WFA alene eller i kombination med CIS eliminerer formodede cancer stamceller i ortotopisk ovarietumorer

Chemo-modstand og gentagelse af kræft i æggestokkene er et stort problem og dødsårsag. I de senere år er der blevet foreslået et koncept af CSCS i faste cancere herunder ovariecancere [57], [58]. CSCS er blevet rapporteret til at være ansvarlig for kemo-modstand, tumorvækst og gentagelse af kræft efter behandling. Formodede CSCS er blevet rapporteret som kræft initierende celler i stand til at udvikle tumorer, når injiceres i nøgne mus [57]. For at teste om WFA når de anvendes alene eller i kombination med CIS mål CSCS udførte vi immunhistokemisk analyse af tumorerne indsamlet fra mock-behandlede dyr og dyr behandlet med WFA og CIS både alene og i kombination under anvendelse af antistoffer for markører udtrykt af formodede CSCS herunder CD44, CD24, CD34, CD117 og Oct4 [56]. Som vist i fig. 4-6, observerede vi ~10-20% af cellerne positive for CD44, CD24, CD34, CD117 og Oct4 i tumorer indsamlet fra ubehandlede dyr. Men behandling af dyr med WFA (2 mg /kg) resulterede i en yderst signifikant reduktion i antallet af disse celler. I modsætning hertil behandling af dyr med CIS alene i en dosis på 6 mg /kg resulterede i signifikant stigning i CD44, CD24, CD34, CD117 og 4. okt positive celler (60%) (fig. 4-6). Vigtigere, behandling af dyr med WFA i kombination med CIS (6 mg /kg) signifikant reduceret antal celler, der udtrykker CSC markører.

De viste data repræsenterer to uafhængige forsøg. W = WFA. Værdier i parentes er mg /kg.

De viste data repræsenterer to uafhængige forsøg. W = WFA. Værdier i parentes er mg /kg.

De viste data repræsenterer to uafhængige forsøg. W = WFA. Værdier vist i parentes er mg /kg.

WFA alene eller i kombination med CIS ned regulerer ekspressionen af ​​CSC-relaterede markører

For at bekræfte vores immun-histokemisk analyse af CD44, CD24, CD34, CD117 og Oct4 positive celler i ortotopisk tumorer, udførte vi western blot-analyse af tumorekstrakter vha specifikt antistof for markører detekteres af immunhistokemisk farvning. Som vist i fig. 7, ekspression af CD24, CD34, CD44, og Oct4 antigener var signifikant nedreguleret i tumorer indsamlet fra dyr behandlet med WFA alene sammenlignet med tumorer fra mock-behandlede dyr. I modsætning blev observeret en signifikant stigning i ekspression af CD24, CD34, CD44 og Oct4 i tumorekstrakter fra dyr behandlet med CIS (6 mg /kg) sammenlignet med mock-behandlede mus eller mus behandlet med WFA (2 mg /kg) alene . Interessant behandling af dyr med WFA (2 mg /kg) i kombination med CIS (6 mg /kg) resulterede i en signifikant eliminering af celler, der udtrykker CD44, CD24, CD34 og Oct4 antigener.

Beta-actin blev anvendt som en intern kontrol. De viste data repræsenterer to uafhængige forsøg. Con = kontrol, W = WFA. Værdier vist i parentes er mg /kg.

Stigning i antallet af celler, der udtrykker markører af formodede CSCS i tumorer indsamlet fra dyr behandlet med CIS, som analyseres af immunfarvning samt Western blot analyse tyder på, at behandling af CIS kan øge antallet af celler, der udtrykker disse markører og kan forklare udvikling af kemo-modstand og gentagelse af kræft i æggestokkene hos patienter behandlet med CIS eller dens derivat, såsom carboplatin i kombination med paclitaxel, som er almindeligt anvendt i kemoterapi. I modsætning eliminering af celler, der udtrykker CSC markører i tumorer ved behandling med WFA alene eller i kombination med CIS (6 mg /kg), at WFA er yderst effektiv til at eliminere celler, der udtrykker CSC markører.

WFA alene eller i kombination med CIS hæmmer Notch 1 og dens downstream signalering gener (Hes1 og Hey1)

Self-fornyelse, lægemiddelresistens og differentiering er vigtige egenskaber for CSCS. Sonic Hedgehog (Shh), Notch1, Twist1, Snail og Wnt1 signalering transduktionsveje spiller store roller i selvfornyelse af disse celler [33], [59] – [68]. WFA er blevet rapporteret at inhibere Notch-1 og nedstrøms signalering gener (Hes1 og Hey1) [33], [68]. Notch 1 signalvejen er forbundet med regulering af celle skæbne ved flere forskellige udviklingsstadier og er blevet impliceret i cancer initiering og progression [63], [69], [70]. I vores nuværende undersøgelse som vist i fig. 8, bemærkede vi stærkt signifikant inhibering af ekspression af Notch 1 og dens downstream signaling gener Hes1 og Hey1 i tumorer indsamlet fra mus behandlet med WFA (2 mg /kg) sammenlignet med tumorer fra kontrol- mock-behandlede dyr. I modsætning hertil dyr behandlet med CIS (6 mg /kg) viste en meget signifikant stigning i niveauet af Notch1, Hes1 og Hey1 gener. Hvad er vigtigt, tumorer indsamlet fra mus behandlet med WFA (2 mg /kg) i kombination med CIS (6 mg /kg) viste signifikant reducerede niveauer af Notch1 samt Hes1 og Hey1 proteiner (fig. 8), hvilket tyder på nedregulering af Notch1 signalering af WFA alene eller i kombination med CIS fører til eliminering af formodede CSCS.

Beta-actin blev anvendt som en intern kontrol. De viste data repræsenterer to uafhængige forsøg. Con = kontrol, W = WFA. Værdier vist i parentes er mg /kg.

Diskussion

Den mest almindelige første linje kemoterapi bruges til kræft i æggestokkene efter cytoreduktive kirurgi er carboplatin i kombination med paclitaxel. Initial responsrate på denne kombination er meget høj (70 til 80%), men inden for 6 til 20 måneder efter første behandling tumor tilbagefald og patienter bliver modstanden mod CIS [71]. Resistens over for CIS er blevet forbundet med række mekanismer, såsom forøgelse af glutathion og metallothionein niveauer, fald i lægemiddeloptagelse, forøgelse af DNA reparationsmekanismer (på grund af forøget ekspression af excision reparation gener) og tolerance af dannelsen af ​​platin-DNA-addukter [ ,,,0],72]. Statusændring af p53 er også blevet rapporteret at spille vigtig rolle i følsomhed CIS [73], [74].

I de senere år har adskillige forskere rapporteret en tilstedeværelse af lille population af CSCS i tumorvæv til være ansvarlig for induktion af kemo-modstand og gentagelse af kræft [75] – [77]. Den overbevisende beviser for den rolle af CSCS i æggestokkræft blev leveret af Bapat et al. [45], som viste tilstedeværelsen af ​​CSCS på enkelt celle niveau i ascites i et ovariecancer patient, der sekventielt kan spredes tumor over flere generationer. I overensstemmelse med dette, rapporterede mange andre forskere tilstedeværelsen af ​​CSCS i ovariecancer cellelinjer, patienternes ovarietumorer og tumorassocierede-ascites [57], [76], [77]. Som en opfølgning af disse observationer CSCS er blevet isoleret baseret på tilstedeværelsen af ​​nogle ekstracellulære markører. Mest almindelige beslutningstagere anvendes til æggestokkene CSCS inkluderer CD44, CD24, CD34, CD117 og CD133. CSCS udtrykker også ALDH1, Oct4, MyD88 og EpCAM [47], [51], [57], [60], [78], [79]. En stigning i antallet af CSCS i ovarietumorer korrelerer med en dårlig prognose, herunder kortere samlet og sygdomsfri overlevelse [80] – [82]. Udvikling af kemo-resistens af ovariecancer kunne forklares ved berigelse for CSCS [77], [83] – [85]. I en nylig undersøgelse, Abubaker et al. [53] demonstreret under anvendelse af to ovarian cancer cellelinjer (epithelial OVCA433 og mesenchymal HEY) berigelse for en population af celler med høj ekspression af CSC markører på proteinniveauet samt mRNA-niveauer efter behandling med CIS, paclitaxel og en kombination af begge. Desuden viste disse forskere stigning i tumorgene egenskaber af ovariecancerceller som respons på kemoterapi narkotika. I den foreliggende undersøgelse, viser vi en eller anden måde i overensstemmelse med disse undersøgelser [53], at antallet af CSCS stigninger i dyr med ortotopisk ovarietumorer behandlet med CIS på 6 mg /kg. Denne stigning i CSCS befolkning i æggestokkene tumorer i mus med CIS kan forklare udviklingen af ​​kemo-modstand og gentagelse af kræft i æggestokkene hos patienter behandlet med CIS eller dens afledte carboplatin anvendes i kombination med paclitaxel.

Stigning i antallet af CSCS i tumorer inokuleret i nøgne mus efterfulgt af CIS behandling er resultat af amplifikation af CSCS stede i human cancercellelinie A2780. På anden side voksende tumor vil tiltrække værtsafledte normale stamceller, der vil give stroma og kar til at udvide tumorvæv. Disse celler kunne give trofiske signaler for CSCS, og dette er i øjeblikket undersøgt i vores laboratorier.

I de seneste år er en stor del af indsatsen er blevet afsat til at udvikle lægemidler, der kan dræbe kræftceller samt CSCS for at reducere kemo-modstand og gentagelse af kræft efter behandling. WFA som rapporteret udviser en hæmmende virkning mod flere forskellige typer af kræftceller. Imidlertid har sin virkning på CSCS ikke blevet udforsket hidtil. I vores tidligere undersøgelse [10], demonstrerede vi, at WFA når de anvendes alene eller i kombination med CIS inhiberer celleproliferation og inducerer celledød af både CIS-sensitive (A2780 og CaOV3) samt CIS-resistente (A2780 /CP70) cellelinier . I vores nuværende opfølgende undersøgelse viser vi, at WFA (2 mg /kg), når det anvendes alene eller i kombination med CIS til behandling mus bærende orthotopisk ovarietumor reducerede tumorvækst med 70 til 80% og forhindrede metastase til andre organer. Desuden af ​​mus der bar ortotopisk ovarietumorer med WFA alene eller WFA + CIS slået celler, som udtrykker CSC markører. (CD44, CD24, CD34, CD117 og Oct4). I modsætning antallet af disse celler som nævnt ovenfor steg i vores hænder efter behandling af CIS alene. Således er vores resultater viser klart, at kombinationen af ​​lav dosis af WFA (2 mg /kg) med suboptimal dosis af CIS (6 mg /kg) er meget effektiv til at undertrykke tumorvækst og eliminering af formodede CSCS “udvidet” af CIS behandling. Da terapeutisk dosis af CIS er 8 mg /kg [19], WFA i kombination med CIS har potentiale til at være yderst effektiv og virkningsfuld behandling for kræft i æggestokkene, og kan lindre CIS-terapi relaterede bivirkninger.

Selv- fornyelse, lægemiddelresistens og differentiering er vigtige egenskaber for CSCS og flere udviklingsmæssige veje såsom Sonic Hedgehog (Shh), Notch, Wnt og TGFp, Twist, og Snail, som har vist sig at være afgørende i disse processer [33], [59] – [67], [86]. WFA er blevet rapporteret at inhibere Notch1 og nedstrøms signalering gener (Hes1 og Hey1) [43], [77], der har været impliceret i cancer initiering og progression [63], [69], [70].

i vores foreliggende undersøgelse viser vi for en første gang særdeles signifikant hæmning af Notch1 og dens downstream signalproteiner Hes1 og Hey1 i tumorer indsamlet fra dyr behandlet med WFA (2 mg /kg) sammenlignet med tumorer fra mock-behandlede dyr.