PLoS ONE: Østrogen induceret Metastatisk modulatorer MMP-2 og MMP-9 er mål for 3,3′-diindolylmethane i Thyroid Cancer

Abstrakt

Baggrund

Kræft i skjoldbruskkirtlen er den mest almindelige endokrine relateret kræft med stigende forekomst i løbet af de seneste fem år. Aktuelle behandlinger for kræft i skjoldbruskkirtlen, såsom kirurgi eller radioaktivt jod terapi, kræver ofte patienterne til at være på livslang thyreoideahormon substitutionsterapi og givet betydelige gentagelse af kræft i skjoldbruskkirtlen, er der behov for nye forebyggende modaliteter. Den foreliggende undersøgelse undersøger ejendom en naturlig kost stof, der findes i korsblomstrede grøntsager, 3,3′-diindolylmethane (DIM), til at målrette den metastatiske fænotype af kræft i skjoldbruskkirtlen celler gennem en funktionel østrogen receptor.

Metode /Principal resultaterne

Thyroid cancer cellelinjer blev behandlet med østrogen og /eller DIM og udsat for

in vitro

vedhæftning, migration og invasion analyser til at undersøge de anti-metastatisk og anti-østrogene effekter af DIM. Vi observerede, DIM inhiberer østrogen medieret stigning i skjoldbruskkirtlen cellemigrering, adhæsion og invasion, som også støttes af ER-α nedregulering (siRNA) undersøgelser. Western blot og zymografi analyser leveres direkte bevis for denne DIM medieret hæmning af E

2 forbedrede metastase forbundet begivenheder i kraft af at målrette væsentlige proteolytiske enzymer, nemlig MMP-2 og MMP-9.

Konklusion /Betydning

Vores data rapporter for første gang, at DIM viser anti-østrogene lignende aktivitet ved at hæmme estradiol forbedret kræft i skjoldbruskkirtlen celledeling og

in vitro

metastase forbundet begivenheder, nemlig vedhæftning, migration og invasion. Mest markant, MMP-2 og MMP-9, som er kendt for at fremme og styrke metastase, blev bestemt til at være mål for DIM. Denne anti-østrogen lignende ejendom DIM kan føre til udvikling af en hidtil ukendt forebyggende og /eller terapeutisk kosttilskud til patienter kræft i skjoldbruskkirtlen ved at målrette progression af sygdommen

Henvisning:. Rajoria S, Suriano R, George A , Shanmugam A, Schantz SP, Geliebter J, et al. (2011) Østrogen induceret Metastatisk modulatorer MMP-2 og MMP-9 er mål for 3,3′-diindolylmethane i kræft i skjoldbruskkirtlen. PLoS ONE 6 (1): e15879. doi: 10,1371 /journal.pone.0015879

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Oktober 6, 2010; Accepteret: November 25, 2010; Udgivet: 18 Jan 2011

Copyright: © 2011 Rajoria et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute 1R01CA131946 og klinisk finansiering fra New York øjet og øret Ambulatorium, New York, New York. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Forekomsten af ​​skjoldbruskkirtlen proliferative sygdomme (TPD), herunder kræft i skjoldbruskkirtlen og struma, er stadigt stigende med kræft i skjoldbruskkirtlen er den mest almindelige blandt endokrine kræft [1], [2]. De seneste statistikker viser 37.000 nye tilfælde blev diagnosticeret i USA alene i 2009 og på verdensplan næsten 27 millioner patienter påvirkes [2]. De godt differentierede papillære og follikulært skjoldbruskkirtelkræft varianter tegner sig for mere end 90% af alle skjoldbruskkirtelkræft og er invasiv metastatisk [3]. Aktuelle behandlinger for TPD omfatter kirurgi involverer hel eller delvis fjernelse af skjoldbruskkirtlen, radioaktivt jod (I

131), kemoterapi eller en kombination af alle [4]. Disse behandlinger ofte kræver patienter til at tage udskiftning skjoldbruskkirtelhormoner hele livet [4], [5] med gentagelse hastigheden er uacceptabelt højt, nåede næsten 20-30% [5], [6]. I de senere år har en gentagelse sats og ikke-lydhørhed over for konventionelle skjoldbruskkirtlen behandlinger steg således berettiger undersøgelse af nye forebyggende og terapeutiske foranstaltninger helst fra naturlige forbindelser til stede i kosten.

Kost har altid været af afgørende betydning i sin forening med cancerudvikling og forebyggelse [7] – [9]. Med hensyn til forebyggelse af kræft, har flere undersøgelser fundet en omvendt sammenhæng af kræftrisiko med et forbrug på kosten produkter, såsom tomater, soja og korsblomstrede grøntsager [7] – [10]. Især har korsblomstrede grøntsager som broccoli, grønkål, blomkål og kål blevet accepteret af flere organisationer, herunder National Cancer Institute og Federal Drug Administration, at have en forebyggende effekt mod tumor udvikling, især i østrogen lydhør væv [7], [8 ]. Cruciferous grøntsager indeholder flere phyto-kemikalier, herunder Indol-3-carbinol (I3C), som er en effektiv oral kemoforebyggende middel imod bryst- og prostatacancer [11] – [13]. I3C spontant konverterer til sin dimere produkt, 3,3′-diindolylmethane (DIM) ved en lav pH [11] – [14]. DIM er en stabil forbindelse og en sikkerhedsvurdering afslører, at langvarig administration af DIM (op 12 måneder) i mus ikke førte til nogen åbenlys nyre-, hjerte eller gastrointestinal toksicitet [15]. Dette antyder, at DIM kan være en lovende naturligt tilgængelig bioaktive forbindelse, der kan anvendes som en anticarcinogenic middel som det giver en mere sikker og forudsigelig reaktion.

I øjeblikket er den præcise cellulære og biokemiske mekanisme, hvormed DIM udøver sine anticarcinogenic virkninger stadig at blive fuldstændigt belyst, men baseret på tilgængelig litteratur, DIM interfererer med forskellige signaltransduktionsbaner. I brystkræft og prostatakræft, har DIM blevet observeret at inducere dosisafhængig apoptose ved at inhibere AKT kinase og IKK-medieret kBa phosphorylering, hvilket fører til inaktivering af AKT og translokation af NFKB til kernen, hvilket resulterer i nedsat cellevækst og proliferation [16] , [17]. Også er det blevet rapporteret, at DIM udøver sine kemoforebyggende virkninger i hormonafhængige cancere, såsom bryst ved opregulering af p21

WAFI /CIP1 og aktiveringen af ​​JNK [18]. Interessant, en potentielt mål af DIM aktivitet er østrogen metabolisme. Dalessandri et al. har vist, at DIM forøgede niveauerne af 2-hydroxyestrones hos postmenopausale kvinder med en historie af brystkræft hvilket resulterer i en samlet stigning i 2-hydroxyestrones at 16a-hydroxyestron forhold [19] således favoriserer anti-proliferative betingelser. Smith et al. har vist, at DIM, sammen med en phytoestrogen, genistein kan modulere østrogen metabolisme i retning 2-hydroxylering i østrogenfølsomme prostatacancerceller [20]. For nylig har vi også opdaget i vores laboratorium, at dim kan modulere østrogen metabolisme hos patienter med TPD resulterer i en stigning i forholdet 2-hydroxyestrones at 16a-hydroxyestron (upublicerede data), hvilket tyder anvendelsen af ​​kosten forbindelser, såsom DIM, i TPD forebyggelse.

på grundlag af alle tilgængelige og diskuteret i litteraturen oplysninger blev denne undersøgelse designet til at definere mekanismen (er) med ansvar for de anti-cancer effekter af DIM i kræft i skjoldbruskkirtlen. Vi rapporterer, at DIM kan have terapeutiske virkninger ved at fungere som en kemo-forebyggende middel besidder anti-østrogene egenskaber i skjoldbruskkirtlen celler i kraft af at nedregulere østrogen inducerede cellulære fænotyper af vedhæftning, invasion og migration. Vores data indikerer, at den anti-østrogen som tilhører DIM tilskrives målrette ekspression af matrixmetalloproteinaser (MMP’er), som er vigtige proteaser involveret i vedhæftning, invasion og migration af kræftceller. Den omstændighed, at MMP’er er under transkriptionel regulering af østrogenresponselement (ERE) låner yderligere tiltro at DIM besidder anti-østrogene egenskaber.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur

Fire skjoldbruskkirtlen cellelinier blev anvendt i denne undersøgelse, BCPAP (human papillær thyroidcancer cellelinje), 8505C (human papillær thyroidcancer cellelinje), CGTHW-1 (human follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinje) og ML-1 (human follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen). BCPAP, 8505C og CGTHW-1 blev dyrket i RPMI-1640 (Mediatech, Herndon, VA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Atlanta Biologicals, Atlanta, GA), penicillin 10.000 IU /ml, streptomycin 10.000 ug /ml (Mediatech) og 2 mM L-glutamin (Mediatech) mL-1 blev dyrket i DMEM (Mediatech) suppleret med 10% FBS, penicillin 10.000 IU /ml, streptomycin 10.000 ug /ml og 2 mM L-glutamin. BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1 cellelinier blev indkøbt fra DSMZ, Braunschweig, Tyskland. MCF-7 (human brystcancer cellelinje) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) og dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS, penicillin, streptomycin, insulin og L-glutamin.

Western Blot-analyse

Celler blev høstet under anvendelse af 0,25% trypsin (Mediatech), vasket med PBS, og lyseret (1 × 10

6/100 pi lyseringspuffer) ved hjælp af radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer [50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,2% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 0,5% NP40, 1 uM Pefabloc] og inkuberet på is i 30 minutter med intermitterende hvirvelbehandling. Lysaterne blev centrifugeret ved 14.000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C og supernatanten blev opsamlet. Cellelysater (20 ug protein) blev underkastet 12% SDS-PAGE under reducerende betingelser (tilstedeværelse af β-mercaptoethanol) som beskrevet tidligere [21], [22]. Kort fortalt blev proteinerne overført til Immobilon-P-membraner ved 220 mA i 2 timer og membraner blev blokeret med 4% tørmælk i TBST [200 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl og 0,01% Tween-20 tilsættes frisk /liter 1 × TBS (TBST)] i mindst 2-3 timer på et rysteapparat ved stuetemperatur. Efterfølgende blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C med enten ER-α (Abcam, Cambridge, MA), ER-β (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) antistof eller actin (Santa Cruz Biotechnology) i TBST. Membraner blev vasket tre gange med TBST og inkuberet med det respektive peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret sekundært antistof, i 2 timer ved stuetemperatur i TBST indeholdende 2% mælk. Efter fire vaske med TBS-T og én vask med TBS blev membranerne udviklet af ECL-substrat (Pierce Rockford, IL) og registreret på Denville autoradiografi film.

XTT celleproliferationsassay

To tusinde celler i 200 pi medium blev udpladet i hver brønd i plader med 96 brønde og inkuberet natten over for at tillade celleadhærence. Medierne blev fjernet, og 3,3′-diindolylmethane (DIM), venligt tilvejebragt af Dr. Michael Zeligs (bioresponset, Boulder, Colorado) blev tilsat i koncentrationer på enten 10, 25, 50, 75, 100 eller 500 uM i en totalvolumen på 200 pi og inkuberet i 24 timer. Medierne blev kasseret og friske vækstmedier blev tilsat uden DIM efterfulgt af tilsætning af 50 pi XTT [1 mg /ml i serumfrit RPMI + phenazinmethosulfat (25 nM)]. Efter 4 timers inkubation blev OD taget i en mikropladelæser ved 450 nm og reference ved 630 nm. Den gennemsnitlige OD-værdier blev beregnet for hver dosis ved de respektive tidspunkter og den procentvise overlevelse som en funktion af tid og dosis blev anvendt til at sammenligne de eksperimentelle og kontrolgrupper.

klongenicitetsassayet

Sådan bestemme virkningen af ​​DIM på clonogenicity, BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1-celler blev udpladet i seks-brønds plader (200 celler pr brønd). Cellerne fik lov at adhærere natten over, hvorefter frisk medium indeholdende ± 10

-8 M E

2 ± 50 pM DIM blev tilsat eller efterladt ubehandlet. Efter 21 dage i kultur blev cellerne fikseret og farvet under anvendelse af 0,025% Coomassie brilliant blue R250 (i 50% methanol og 10% eddikesyre) for at visualisere cellekolonier. Kolonierne blev talt, og procentvise hæmning af clonogenicity blev bestemt i de behandlede celler.

Transwell Migration Assay

BD BioCoat Kontrol Indsætter (BD Biosciences, Bedford, MA) med 8-um pore-membran filtrene blev anvendt til migration assay som tidligere beskrevet [21], [23]. Kort fortalt blev cellerne udsultet i 18 timer under anvendelse af sult medium [phenolrødt-frit medium suppleret med 10% trækul strippet FBS (Sigma Chemical Co.) og penicillin (10.000 IE /ml)]. Celler blev derefter høstet ved trypsinisering og 2,5 × 10

4-celler blev podet i det øvre kammer i 500 pi medium indeholdende 1% FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 uM DIM. Det nedre kammer indeholdt 750 pi medium suppleret med 5% FBS. Efter 18 timers inkubation blev de ikke migrerende celler fjernet fra den øvre overflade af membranen ved forsigtigt at skrubbe hjælp bomuld podepind. Celler på den nedre overflade af membranen blev derefter fikseret under anvendelse af methanol og farves med 1% toluidinblåt 1% borax plet efterfulgt af to vaske med destilleret vand. Inserts blev derefter lov til at airdry og talt i 10X felt. Data udtrykkes som antal migrerede celler pr 10X felt mikrograf for hver prøve godt og normaliseret til celletal opnået fra den ubehandlede kontrol.

Scratch Sår Assay

vandrende evne BCPAP, 8505C, CGTHW -1 og ML-1-celler blev også vurderet ved en ridse sår assay. 5 × 10

5-celler blev udpladet i en plade med seks og lodes adhærere og vokse til 60-70% sammenflydende cellemonolag. Efterfølgende blev tre lodrette sår forårsaget per brønd under anvendelse af en 2,5 pi steril pipettespids efterfulgt af fjernelse af enhver cellerester og løsnede celler. De sårede cellemonolaget blev derefter inkuberet i frisk komplet medium med eller uden 25 og 50 pM DIM og estradiol. En vandret linje blev foretaget for at muliggøre visualisering af celler i samme punkt. Cellerne blev inspiceret hver tredje time, indtil scratch celler til kontrol var fuldt migreret fra den ene ende af sår til andre, som var 24 timer for BCPAP, 8505C og CGTHW-1 og 48 timer for ML-1. Billeder blev taget lige over og under vandret mærke ved anvendelse af et lysmikroskop ved 5X.

celleadhæsionsassay

BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1-celler blev høstet som beskrevet og podet ved en tæthed på 5 × 10

5 celler per brønd i 6-brønds petriskåle i medier suppleret med ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 pM DIM eller ubehandlet og lodes adhærere i 2 timer. Efter angivne tidspunkter, blev medium med ikke-klæbet celler kasseret, og brøndene blev forsigtigt vasket to gange med PBS for at fjerne eventuelle løst bundne celler. Adhærente celler blev dernæst skrabet og talt under anvendelse af 0,4% trypan blå opløsning (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Antallet af adhærente celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer og virkningen af ​​DIM på celleadhæsion blev udtrykt som procent nedgang i adhærerende celletal for celler behandlet med DIM forhold til kontrolceller.

Invasion assay

invasion assay blev udført som tidligere beskrevet [21] ved brug af BD BIOCOAT vækstfaktor Reduceret Matrigel invasion kamre (BD Biosciences, Bedford, MA) med 8-um pore membranfiltre der blev overtrukket med matrigel. Protokollen var stort set den samme som migration assay, bortset fra at vækstfaktor reduceret Matrigel invasion kamre blev rehydreret i 2 timer ved hjælp af serum frit RPMI medier ved 37 ° C før lastning celler på skær. Når rehydreret, 2,5 x 10

4 celler blev resuspenderet i RPMI (500 pi) indeholdende 1% FBS med ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 pM DIM og blev omhyggeligt overført til den øvre overflade af filtre i kammeret. Cellerne fik lov til at invadere i 18 timer, hvorefter cellerne blev farvet og talt på samme måde som beskrevet for migration assay. Procent invasion blev beregnet baseret på procent af celler invaderer gennem vækstfaktoren reduceret Matrigel invasion kamre i forhold til cellerne migrerer gennem kontrol membranen.

MMP detektion

Thyroid celler blev podet ved en densitet på 5 × 10

5 celler per brønd i 6-brønds dyrkningsskåle og fik lov at adhærere natten over, hvorefter de blev derefter skiftet til serumfrit medium og inkuberet med ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 pM DIM eller venstre ubehandlet i 24 timer. Konditioneret medium blev høstet, centrifugeret til fjernelse af eventuelt snavs, og portioner blev opbevaret ved -80 ° C indtil analyseret for MMP-2 og MMP-9-sekretion og aktivitet som beskrevet tidligere [24], [25]. Kort fortalt blev den totale proteinkoncentration af det konditionerede medium bestemt ved anvendelse af Bio-Rad proteinassay farvestof og lige proteiner blev anvendt til hvert eksperiment. For gelatinezymografi blev SDS-PAGE geler copolymeriseret med 0,1% gelatine (Sigma Chemical Co.) og 1 ug protein blev løst under ikke-reducerende betingelser. Efter elektroforese blev gelerne vasket to gange i renatureringsbuffer (2,5% Triton X-100 i destilleret vand) i 1 time på en orbitalryster. De zymogrammer blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur efterfulgt af 36 timer ved 37 ° C i zymografi buffer (5 mM CaCl

2, 0,2 mM NaN

3 og 1 pM ZnCl

2 i 50 mM Tris- HCI) med buffer skifter hver 12 timer. Geler blev herefter farvet med Coomassie blue (G-250 farvning, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) og affarvet med 10% methanol og 7,5% eddikesyre. Western blot-analyse blev udført under anvendelse af konditioneret medium fra skjoldbruskkirtlen cancerceller (lige proteinkoncentrationer) som beskrevet i det foregående afsnit under anvendelse af MMP-2 og MMP-9 (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA) antistoffer. For MMP-inhibering, blev generelt MMP-inhibitor 1,10 phenanthrolin (Sigma Chemical Co.) anvendt. 2,5 × 10

4 celler blev resuspenderet i RPMI (500 pi) indeholdende 1% FBS med ± 10

-8 ME

2 ± 20 pM 1,10 phenanthrolin ± 25 pM DIM og podet på BD BIOCOAT Kontrol indsatser for migration og matrigel coatede skær til invasion, som beskrevet i tidligere afsnit.

siRNA og transfektionsbetingelser

for at lukke munden på østrogen-receptor undersøgelser, ER-α lille interfererende RNA (siRNA) og siRNA transfektion reagens (DharmaFECT1) blev opnået fra Dharmacon (Dharmacon, Inc., Lafayette, CO). BCPAP og MCF-7-celler blev udpladet i plader med 6 brønde og fik lov at adhærere natten over. Celler blev transficeret i 48 timer, og efterfølgende trasfected celler blev høstet og podet på BD BIOCOAT Kontrol Inserts (migration) og Matrigel coatede inserter (invasion) i medier indeholdende 1% FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 uM DIM. Ikke-transficerede kræft i skjoldbruskkirtlen celler behandlet med ± 10

-8 M E

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 pM DIM blev anvendt som passende positive kontroller. undersøgelser migrations- og invasion blev udført som beskrevet i tidligere afsnit.

Statistisk Beregning

Eksperimenter præsenteret her repræsenterer tre gentagelser med statistisk signifikans bestemmes ved hjælp af en parret Students

t

test med en sandsynlighed (

s

‘værdi) ≤0.05 bruges til at afvise nulhypotesen.

Resultater

skjoldbruskkirtel celler udtrykker østrogen receptor

skjoldbruskkirtlen er ikke kendt for at fungere som en traditionel estrogen responsive væv, såsom bryst. For at bestemme status for østrogenreceptoren i thyreoideaceller anvendte vi fire skjoldbruskkirtlen cellelinier som vores cellekulturmodeller. BCPAP og 8505C er humane papillære kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinier, CGTHW-1 og ML-1 er humane follikulære skjoldbruskkirtlen cancercellelinjer. Vi observerede, at alle de skjoldbruskkirtlen cellelinjer analyseret udtrykte begge isoformer af østrogenreceptoren (ER), ER-α og ER-β (Fig. 1) ved sammenlignelige niveauer. MCF-7, en klassisk ER udtrykkende brystcancer cellelinje, blev anvendt som en positiv kontrol til påvisning af begge polymorfe former af ER’er (ER-α og ER-β).

Hele celleprotein (20 ug) blev opløst ved SDS-PAGE efterfulgt af Western blot-analyse for eR-α (fortynding 1:500), eR-β (fortynding 1:1000) og actin (fortynding 1:5000). Alle cellelinjer anvendt i denne undersøgelse (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1) udtrykker både ER-α og ER-β på sammenlignelige niveauer.

DIM har anti-proliferativ effekt på thyreoideaceller

DIM, en naturlig forbindelse fra korsblomstrede grøntsager er blevet observeret at have anti-proliferative egenskaber mod flere hormon responsive kræftformer [14], [16] – [18]. Vi ønskede at evaluere effekten af ​​DIM på den proliferative aktivitet af kræft i skjoldbruskkirtlen og for at gøre dette, et XTT-assay blev udført, og resultaterne er vist i tabel 1. Alle cellelinier (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML -1) anvendt i denne undersøgelse blev behandlet med forskellige koncentrationer af svagt til 24 timer. En dosisafhængig inhibering i cellelevedygtighed blev observeret med en 50% inhibering ved en koncentration på ca. 50 pM DIM under 24 timers behandling i alle fire cellelinjer, BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1. Baseret på disse observationer (tabel 1), blev 25 uM DIM koncentration, der anvendes til yderligere at karakterisere effekten af ​​DIM på skjoldbruskkirtlen celler på både molekylære og fænotypiske niveau.

DIM hæmmer klonogene evne skjoldbruskkirtlen celler

En af de kendetegnende egenskaber af kræftceller er evnen til at dele sig under isolerede forhold ved hjælp af minimal parakrin og muligvis mere autokrine faktorer [26]. Anticancer virkning DIM på evnen for BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1-celler til at dele sig uendeligt blev bedømt ved en klonogen celleoverlevelse assay. To hundrede celler per brønd i seks-brønds plader blev behandlet med 50 pM DIM ± østradiol i 21 dage. Som vist i tabel 2, de ubehandlede skjoldbruskkirtlen celler har evnen til at danne kloner hvorimod østrogen behandling resulterede i ca. 8 (8505C) -33% (ML-1) stigning i klon formation afhængigt cellelinier. DIM fuldstændigt ophævet klon dannelsen af ​​alle cellelinier, uanset om de blev behandlet med østradiol. Disse eksperimenter etablere forskellen reaktionsevne forskellige skjoldbruskkirtlen kræftceller til østradiol og anti-østrogene aktivitet af DIM.

DIM reducerer vandrende evne skjoldbruskkirtlen celler

Tumor celler har en forbedret evne til at migrere ind nabolandet væv og visse midler såsom østradiol er observeret at støtte i denne migration proces. Terapeutiske midler, som kan sænke evnen af ​​disse celler til at migrere formodentlig effektivt kan nedsætte risikoen for metastase. Vi har tidligere vist, at skjoldbruskkirtlen celler har evnen til at øge migrationen som respons på østrogen [21] og for at bestemme, om DIM kan påvirke vandrende potentiale i disse celler,

in vitro Salg migration assays blev udført. Udsultet skjoldbruskkirtel-celler blev podet i en transwell migration kammer med estradiol ± fulvestrant eller ± 25 pM DIM og lov til at migrere. Vi observerede, thyreoideaceller var i stand til at migrere og denne evne til at migrere blev forstærket, når celler blev behandlet med E

2 (grå søjler) sammenlignet med ubehandlede celler med 30% stigning i migrering af BCPAP, 50% til 8505C, 89% for CGTHW-1 og 63% for ML-1 (fig. 2A). Denne stigning i cellemigrering blev ophævet ved fulvestrant blev anvendt sammen med østradiol [prikkede søjler) antyder, at migreringsevnen af ​​disse thyreoideaceller påvirkes af østrogen og en østrogenreceptorantagonist har ophævet migration af disse celler. DIM (25 uM) faldt betydeligt migration af skjoldbruskkirtlen celler (sorte søjler). Dette fald blev observeret at være ca. 37-57% og var cellelinje afhængig. Desuden har tilføjelsen af ​​estradiol sammen med 25 pM DIM (skraverede søjler) ikke forbedre vandrende evne skjoldbruskkirtlen celler, der betyder antiøstrogen som evne DIM.

(A) 2,5 × 10

4 celler resuspenderedes i 500 pi RPMI med 1% FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 pM DIM og podet i det øverste kammer i BD BioCoat Kontrol Indsætter (8- um pore membranfiltre). 750 pi RPMI indeholdende 5% FBS blev tilsat til den nederste kammer som en kemoattraktant. Efter 18 timer blev celler, som migrerede fikseret, farvet og talt under 10X objektiv. Grupperne er som følger- ubehandlede (hvide søjler), E

2 behandlede (grå søjler), E

2 + fulvestrant (stiplede søjler), 25 uM DIM (sorte søjler) og E

2 25 uM DIM behandlet (skraverede søjler). Dataene er udtrykt som antal talte celler (migrerede celler) for hver prøve og normaliseret til celleantal opnået fra den ubehandlede kontrol. Stjernen angiver statistisk signifikante forskelle (

s

0,05) mellem de angivne prøver. Ridse sår assay for BCPAP (B) og CGTHW-1 (C). 5 × 10

5-celler blev udpladet og fik lov til at vokse til semi sammenflydende monolag hvorefter en “lodret sår” blev skabt, og cellerne blev derefter lov til at migrere i nærvær af enten 25 uM eller 50 pM DIM. Cellerne blev visualiseret under 5X hver tre timer, og fotografisk dokumentation blev taget på 18 timer, når cellerne fuldstændig migreret fra den ene ende af ‘scratch’ til anden ende i ubehandlede kontroller.

For yderligere at validere effekten af DIM på vandrende evne skjoldbruskkirtlen celler, blev en ridse sår assay udført, hvilket er en delvis

in vivo

repræsentation af metastatisk fænotype [27]. Skjoldbruskkirtel celler (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1) blev dyrket i en 60-70% sammenflydende monolag efterfulgt af dannelse af ridser og efterfølgende inkubation med ± DIM. Vi fandt, at DIM forårsagede et fald i cellemigrering med 50-60% (som observeret visuelt) på en dosisafhængig måde i thyreoideaceller [BCPAP (fig. 2B) og CGTHW-1 (fig. 2C)]. Lignende resultater blev observeret med 8505C og ML-1 (data ikke vist). Vi har også tidligere observeret, at estradiol forstærker migration og denne migration blev inhiberet af fulvestrant, svarende til bunden sår assay opnåede resultater i denne undersøgelse ved hjælp DIM [21].

DIM formindsker vedhæftning evne thyreoideaceller

for at kunne metastaserer, tumorceller nødt til at holde sig til ekstracellulær matrix (ECM) af sekundære organer [26], [28]. Vi evaluerede effekten af ​​DIM på vedhæftning af skjoldbruskkirtlen celler ved at udføre en vedhæftning assay. Thyreoideaceller fik lov til at klæbe i nærvær af 10

-8 ME

2 eller ± 10

-6 M fulvestrant (en klassisk østrogenreceptorantagonist) ± 25 pM DIM i 2 timer og% adhæsion blev beregnet (fig. 3). En stigning i adhæsion blev observeret, når celler blev behandlet med E

2 (grå søjler), som blev ophævet med fulvestrant (prikkede søjler) antyder, at vedhæftningen er en aktiv fænotype i thyreoideaceller muligvis kræver en funktionel ER aktivitet. Interessant nok blev der observeret et signifikant fald i adhæsion, når celler blev behandlet med 25 pM DIM (sorte søjler), med et fald på 58% i adhæsion til BCPAP, 42% for 8505C, 70% for CGTHW-1 og 45% for ML-1 . Kombination af østradiol og 25 uM DIM (skraverede søjler) kunne ikke forbedre vedhæftningen af ​​skjoldbruskkirtlen celler, hvilket tyder på, at DIM kan forhindre østrogen forbedret vedhæftning og kan potentielt fungere som en effektiv anti-østrogen /metastaserende agent, som faldet i celleadhæsion af DIM svarer til faldet i adhæsion observeret med østrogenreceptorantagonist fulvestrant.

5 × 10

5 celler blev suspenderet i komplet medium indeholdende ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 pM DIM og forgyldt med 6 godt petriskåle. Efter 2 timer blev levedygtige adhærerede celler fjernes ved skrabning og talt ved trypanblåt. Grupperne er som følger- ubehandlede (hvide søjler), E

2 behandlede (grå søjler), E

2 + fulvestrant (stiplede søjler), 25 uM DIM (sorte søjler), og E

2 + 25 uM DIM behandlet (skraverede søjler). Data er udtrykt som% klæbet celler sammenlignet med ubehandlede celler, som blev sat til 100% adhæsion. Enkelt stjerne angiver statistisk signifikante forskelle (

s

0,05). Mellem de angivne prøver

DIM hæmmer invasionen af ​​skjoldbruskkirtlen celler

Dannelse af sekundær metastatiske foci ved tumorceller kræver invaderer ECM af sekundære organer [26] og inhibere denne invasion er en strategi i cancer terapi, der er blevet bredt undersøgt. Virkningen af ​​DIM på invasive potentiale BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1 blev analyseret ved anvendelse af et transwell invasion kammer coatet med en biologisk matrix

in vitro

(matrigel). Skjoldbruskkirtel celler blev lagt i en transwell kammer med estradiol ± fulvestrant eller ± 25 uM DIM og fik lov til at invadere gennem matrigel. Vi observerede, thyreoideaceller var i stand til at invadere gennem matrigel og invasion af disse celler blev forøget, når cellerne blev behandlet med E

2 (grå søjler) med en stigning på 40% i invasionen for BCPAP, 36% for 8505C, 30% for CGTHW-1 og 31% for ML-1 (fig. 4). Denne stigning i celleinvasion blev ophævet ved fulvestrant blev anvendt i kombination med estradiol (prikkede søjler) antyder, at en østrogenreceptorantagonist kan blokere den invasive tilbøjelighed thyreoideaceller. For at vurdere effekten af ​​DIM på invasion af skjoldbruskkirtlen celler blev alle cellelinjer behandlet med 25 pM DIM (sorte søjler) og et signifikant fald (

s

0,05) i invasionen blev observeret. Dette fald i invasionen var ca. 52% for BCPAP, 50% for 8505C, 80% for CGTHW-1 og 48% for ML-1 i forhold til at styre celler (normaliseret til 100% og

s

0,05 ). Desuden pro-proliferativ estradiol, i kombination med DIM (stribede søjler), forbedrede ikke den invasive evne skjoldbruskkirtlen celler. Disse data tyder på, at DIM ophæver østrogen forbedret cellulære processer invasion dermed muligvis rettet mod et stort skridt i tumorprogression og metastase.

2,5 × 10

4 celler resuspenderes i 500 pi medium indeholdende 1% FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 uM DIM blev udsået i det øverste kammer vækstfaktor reduceret matrigel invasion kamre. 750 pi vækstmedium indeholdende 5% FBS blev anvendt som chemoattractant i bundkammeret. Procent invasion blev beregnet på basis af antallet af celler invaderer gennem kamrene i forhold til cellerne migrerer gennem kontrol membranen efter 18 timer. Grupperne er som følger- ubehandlede (hvide søjler), E

2 behandlede (grå søjler), E

2 og ICI (prikkede søjler), 25 uM DIM (sorte søjler) og E

2 25 uM DIM behandlet (skraverede søjler). Data er repræsenteret som% invasion, som er gennemsnitlige antal invaderede celler pr 10X felt mikrograf for hver prøvebrønd i forhold til migration gennem styring membran og normaliseret til den ubehandlede kontrol. Stjernen angiver statistisk signifikante forskelle (

s

0,05). Mellem de angivne prøver

DIM undertrykker østrogen induceret MMP-sekretion

MMP’er er pålidelige markører for tumor celle invasion og migration. Desuden er maligne tumorer kendt for at have øget MMP udtryk sammenlignet med benigne tumorer, som forårsager nedbrydning af den ekstracellulære matrix, hvilket resulterer i øget invasion og migrering af tumorceller [29], [30]. Fytokemikalier såsom genistein og I3C er blevet vist at målrette aktiviteten og sekretion af MMP’er i østrogen-responsive cancere [31]. Actin blev anvendt som en loading kontrol.