PLoS ONE: Identifikation af Cancer Cell Proliferation og OVERLEVELSESFUNKTIONER af proHB-EGF ved hjælp af en anti-HB-EGF Antibody

Abstrakt

Formål

Heparin-bindende epidermal vækstfaktor-lignende vækstfaktor (HB-EGF) er et medlem af epidermisvækstfaktor familie. Den membranbundne proHB-EGF er kendt for at være en forløber for den opløselige form af HB-EGF (SHB-EGF), som fremmer celleproliferation og overlevelse. Mens funktioner SHB-EGF er blevet grundigt undersøgt, er det endnu ikke fuldt forstået, hvis proHB-EGF også er involveret i cellulære signaleringsbegivenheder. I denne undersøgelse anvendte vi de anti-HB-EGF monoklonale antistoffer Y-142 og Y-073, som har differentielle specificiteter mod proHB-EGF, med henblik på at belyse proHB-EGF funktioner i cancerceller.

Eksperimentel design

De biologiske aktiviteter af proHB-EGF blev vurderet i celleproliferation, caspaseaktivering og juxtacrine aktivitetsassays ved hjælp af en 3D sfæroid kultur af NUGC-3-celler.

Resultater

Y-142 og Y-073 udstillede lignende bindende og neutraliserende aktiviteter for SHB-EGF. Det er dog kun Y-142 bundet til proHB-EGF. Vi kunne detektere funktionen af ​​endogent udtrykte proHB-EGF i en 3D klumpformet kultur. Blokering proHB-EGF med Y-142 reducerede sfæroid dannelse, undertrykt celleproliferation, og øget caspaseaktivering i 3D klumpformet kultur af NUGC-3-celler.

Konklusioner

Vores resultater viser, at proHB- EGF fungerer som en celleproliferation og celleoverlevelse faktor i cancerceller. Resultaterne tyder på, at proHB-EGF kan spille en vigtig rolle i tumor progression

Henvisning:. Sato S, Kamada H, Watanabe T, Tsuji I, Fan J (2013) Identifikation af Cancer Cell Proliferation og OVERLEVELSESFUNKTIONER af proHB-EGF ved hjælp af en anti-HB-EGF antistof. PLoS ONE 8 (1): e54509. doi: 10,1371 /journal.pone.0054509

Redaktør: Emilio Hirsch, University of Torino, Italien

Modtaget: August 29, 2012; Accepteret: 12. december, 2012; Udgivet: 21 januar 2013

Copyright: © 2013 Sato et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Alle forfattere er /var medarbejdere i Takeda Pharmaceutical Company Limited eller Takeda San Francisco, Inc. og blev betalt som sådan. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

HB-EGF er medlem af epidermal vækstfaktor (EGF) -familien af ​​vækstfaktorer [1]. Det syntetiseres som et transmembrant protein, proHB-EGF, sammensat af et signalpeptid; et pro-peptid; og heparinbindende EGF-lignende, juxtamembran, transmembrane og cytoplasmatiske domæner [2]. Under cellulært stress, proHB-EGF undergår ektodomæne udgydelse som frigiver den opløselige form, SHB-EGF, og den intracellulære C-terminale fragment (CTF) [3], [4]. SHB-EGF udøver en potent mitogen og /eller kemotaktisk aktivitet gennem aktivering af dets receptorer EGFR og ErbB4 [1], [5], [6]. CTF translokerer til kernen og inducerer genekspression af cyclinA og cyclinD2 ved at undertrykke funktionen af ​​PLZF og BCL6 henholdsvis [7], [8].

Ud over at være en forløber for SHB-EGF og CTF, proHB-EGF har unikke egenskaber som difteri toksin-receptor [9], en celleadhæsionsmolekyle [10], og en juxtacrine faktor [11]. Difteri toksin binding til proHB-EGF forstærkes af CD9 eller heparinlignende molekyler [12], [13], og binding forårsager inhibering af proteinsyntese gennem internalisering af komplekset i difteritoksin-proHB-EGF. Som celleadhæsionsmolekyle, proHB-EGF bidrager til blastocyst adhæsion til livmoderen under implantation i mus [10]. Den juxtacrine aktivitet af proHB-EGF blev først bemærket i en cokultur-systemet, hvor proHB-EGF-overudtrykkende celler blev podet på EGFR-overudtrykkende celler [11]. At isolere og vurdere signalering initieret af proHB-EGF særskilt fra initieret af SHB-EGF blev proHB-EGF-overudtrykkende celler fikseret med formalin og forhindrer derved frigivelsen af ​​SHB-EGF. I denne cokultur system, proHB-EGF-overudtrykkende celler fremmes DNA-syntese og forhindrede apoptose i EGFR-overudtrykkende celler i nogle af de undersøgelser, hvor den blev brugt [11], [14], [15]. I modsætning hertil, når de intakte proHB-EGF-overudtrykkende celler ikke blev fikseret med formalin, de inhiberede DNA-syntese og fremmet apoptose i EGFR-overudtrykkende celler i et modificeret cokultur betingelse [16]. Funktionerne af proHB-EGF blev også vurderet ved at analysere virkningerne af proHB-EGF overekspression om autonome cellulære begivenheder. Den proHB-EGF overekspression undertrykt eller fremmet celledeling i forskellige cellelinjer [17], [18]. Således har rollerne for proHB-EGF ikke været konsekvent eller klart belyst.

I denne undersøgelse har vi vurderet funktionerne for proHB-EGF i cancerceller ved hjælp af 2 anti-HB-EGF monoklonale antistoffer, der har forskellige særlige mod proHB-EGF. Vores resultater tyder på, at proHB-EGF spiller roller i spredning og overlevelse af kræftceller.

Materialer og metoder

Materialer

Den anti-HB-EGF monoklonale antistoffer Y- 073 og Y-142 og SHB-EGF blev tidligere dannet [19]. Kort fortalt, blev Y-142 fremstilles ved immunisering BALB /c-mus (Japan Clea) med subkutane injektioner af keyhole limpet hæmocyanin-konjugeret SHB-EGF og abdominale injektioner af 293F-celler (Invitrogen) transient transficeret med en proHB-EGF-ekspressionsplasmid. Y-073 blev opnået ved immunisering af BALB /c-mus med subkutane injektioner af keyhole limpet hæmocyanin-konjugeret SHB-EGF. Begge antistoffer blev oprenset fra deres hybridomkultursupernatant med rProteinA Sepharose (GE Healthcare). SHB-EGF blev fremstillet fra kultursupernatanten af ​​293F celler (Invitrogen) transficeret med en SHB-EGF ekspressionsplasmidet [19]. Vi brugte også følgende reagenser: musen kontrol IgG og peberrod peroxidase-mærket (HRP-mærket) anti-muse IgG antistof fra Jackson ImmunoResearch Laboratories; Alexa488-mærket anti-muse-IgG-antistof, HRP-mærket anti-gede-IgG-antistof, og HRP-mærket anti-kanin-IgG-antistof fra Invitrogen; anti-amphiregulin (anti-ARG) monoklonalt antistof, anti-HB-EGF polyklonale antistof, anti-EGFR polyklonalt antistof, og biotinyleret anti-EGFR polyklonalt antistof fra R anti-β-actin antistof fra Cell Signaling Technology; erlotinib fra Selleck Chemicals; biotinyleret antiphosphotyrosinantistof fra Millipore; sulfotagged streptavidin fra Meso Scale Discovery; og phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) fra Wako.

Cell Culture

NUGC-3 mave kræftceller (japansk Indsamling af Research Bioressourcer), 5637 blærekræft celler (American Type Culture Collection), og BxPC-3 bugspytkirtelkræftceller (American Type Culture Collection) blev holdt i RPMI1640-medium suppleret med 10% serum. EFO-27 ovariecancerceller (DMSZ) blev holdt i RPMI1640 medium med 20% serum. Cellerne blev holdt i 2D cellekulturplader, og til 3D kugleformet kultur eksperimenter blev de overført til en Celltight Sfæroide dyrkningsplade (Sumitomo Bakelite).

flowcytometri

Celler blev løsnet fra en dyrkningsskål med celledissociering buffer (Invitrogen) og inkuberet med anti-HB-EGF monoklonalt antistof eller anti-ARG-monoklonalt antistof i 1 time ved 4 ° C. Efter vask med PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA), blev cellerne inkuberet med Alexa488-mærket sekundært antistof i 1 time ved 4 ° C. Proteinekspression blev målt under anvendelse af en FACS CantoII instrument (Becton Dickinson), og dataene blev derefter analyseret med FlowJo software (Tree stjerne). For at generere en positiv kontrol for binding af anti-ARG-antistof, blev EFO-27 celler transficeret med en ARG ekspressionsplasmid ved anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen).

SHB-EGF-binding assay

bindingsaktiviteten af ​​anti-HB-EGF monoklonalt antistof mod SHB-EGF blev påvist som tidligere beskrevet [19]. SHB-EGF eller BSA blev immobiliseret ved 1 ug /ml på en plade med 96 brønde natten over ved 4 ° C. Efter uspecifik binding blev blokeret med PBS indeholdende 1% BSA, blev anti-HB-EGF monoklonalt antistof inkuberet ved forskellige koncentrationer i pladen. HRP-mærket anti-muse-IgG-antistof blev derefter omsat i 1 time ved stuetemperatur. TMB Peroxidase EIA Substrate (Bio-Rad) blev derefter tilsat til hver brønd. Antistofbinding til SHB-EGF blev påvist ved måling af absorbansen ved 450 nm ved anvendelse af en SPECTRA MAX-pladelæser (Molecular Devices).

EGFR Phosphorylering Assay

Den inhiberende aktivitet af anti-HB- EGF monoklonalt antistof mod SHB-EGF-induceret EGFR-phosphorylering blev påvist som tidligere beskrevet [19]. NUGC-3-celler blev podet ved 1 × 10

4 celler /brønd i RPMI1640 medium med 1% serum. Efter en 1-d inkubationsperioden blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af anti-HB-EGF-antistof og 10 nM SHB-EGF i 15 minutter ved 37 ° C. Cellelysater blev fremstillet med cellelyse-buffer (Cell Signaling Technology) indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Roche Applied Science) og en phosphatase-cocktail (Sigma Aldrich) og blev anvendt til analyse med et pEGFR detektion ELISA-kit (R Y-142, sort histogram; Y-073, grå histogram. B. Ekspression af amphiregulin (ARG) i kræftceller. Celler blev inkuberet med anti-ARG-antistof, efterfulgt af inkubation med Alexa488-mærket anti-muse-IgG-antistof. Bindingen af ​​anti-ARG-antistof blev bekræftet under anvendelse EFO-27 celler transficeret med en ARG ekspressionsplasmid. Ingen IgG, sort streg; anti-ARG-antistof, grå histogram.

EGFR-ligander omfatter HB-EGF, amphiregulin (ARG), tumor vækstfaktor α, neuregulin β1, EGF, og betacellulin, og vores tidligere undersøgelse viste, at Y- 142 recognizesARG foruden HB-EGF [21]. Begge ligander er udtrykt som membranbundne former på celleoverfladen [22]. Derfor, for at bekræfte, at Y-142-binding til celler skyldtes dens anerkendelse af proHB-EGF, og ikke til Arg, blev ARG ekspression undersøgt ved flowcytometri, og ingen ARG ekspression blev detekteret (fig. 1B). For at udelukke den mulighed, at anti-ARG-antistof ikke havde bindingsaktivitet for ARG anvendte vi transficeret ARG som en positiv kontrol. Dette resultat yderligere bekræftet, at bindingen af ​​Y-142 til de testede cancer cellelinjer var tilskrives dens anerkendelse af proHB-EGF. Vi testede også EGFR-ligand specificitet Y-073 og Y-073 specifikt bundet til HB-EGF (data ikke vist).

For yderligere at undersøge karakteristika antistofferne testede vi deres bindende aktivitet til SHB -EGF ved ELISA. Interessant, Y-142 og Y-073 bundet til SHB-EGF med sammenlignelig EF

50 værdier på 56 pM og 110 pM, henholdsvis, og ingen af ​​dem bundet til den negative kontrol BSA (fig. 2A). Derudover undersøgte vi deres neutraliserende aktivitet på SHB-EGF-induceret EGFR phosphorylering. Den NUGC-3 mavekræft cellelinie anvendtes til påvisning EGFR phosphorylering grund af dens høje EGFR. Som vist i fig. 2B, både af antistofferne inhiberede phosphorylering af EGFR i en koncentrationsafhængig måde med lignende IC

50 værdier (Y-142 = 3,8 nM; Y-073 = 4,1 nM). Disse resultater viste, at kun Y-142 havde evnen til at binde til proHB-EGF, selv om begge Y-142 og Y-073 havde lignende bindings- og neutraliserende aktiviteter mod SHB-EGF.

A. Bindingsaktivitet af Y-142 og Y-073 mod SHB-EGF. Anti-HB-EGF-antistof blev inkuberet ved forskellige koncentrationer i en SHB-EGF-overtrukket eller et BSA-overtrukket plade. Antistofbinding blev påvist med et HRP-mærket anti-muse-IgG-antistof. Y-142 binding til BSA, hvid square; Y-073-binding til BSA, hvid cirkel; Y-142 binding til SHB-EGF, sorte firkant; Y-073 binding til SHB-EGF, sort cirkel. Datapunkterne angiver middelværdi ± standardafvigelse (SD) af værdier erhvervet i to eksemplarer. B. neutraliserende aktivitet af Y-142 og Y-073 mod SHB-EGF-induceret EGFR phosphorylering. Anti-HB-EGF antistof blev inkuberet ved de angivne koncentrationer i nærvær af 10 nM SHB-EGF med NUGC-3-celler i 15 minutter ved 37 ° C. Cellelysater blev inkuberet på et anti-EGFR-antistof-coatede plade, efterfulgt af inkubation med HRP-mærket anti-phosphotyrosin-antistof. Ingen SHB-EGF, hvid cirkel; SHB-EGF og kontrol IgG, hvid square; SHB-EGF og Y-142, sort firkant; SHB-EGF og Y-073, sort cirkel. Datapunkterne repræsenterer middelværdien ± SD af værdier erhvervet i tre eksemplarer.

Cell Proliferation og Survival funktioner proHB-EGF

En tidligere undersøgelse har vist, at proHB-EGF er involveret i celle-celle-kontakt [10]. I en 3D-kugleformet kultur, kræftceller undergår mere omfattende celle-celle kontakter end i en 2D kultur [23]. Vi spekuleret på, at celle-celle-kontakt-medieret effekt proHB-EGF kan være mere udtalt og lettere at opdage i 3D klumpformet kultur. Til dette formål har vi etableret en 3D klumpformet kultur cellebaserede assay ved hjælp NUGC-3 celler. Når NUGC-3-celler blev podet i en sfæroid kulturplade, dannede de en sfæroid med en lille cellemasse i centrum kerne og løst fordelte celler, der omgiver kernen (mørkegrå og lysegrå henholdsvis i PBS-kontrol i fig. 3A ). Interessant, under Y-142 behandling blev cellerne mere diffus og havde en mindre midterkerne og en større halo. Den morfologisk ændring forårsaget specifikt af Y-142 foreslog, at denne ændring i klumpformet morfologi henføres til modulering af proHB-EGF-funktioner. Vi nærmere de proHB-EGF funktioner ved hjælp af 3D-klumpformet kultur assay. I celleproliferationsassay, Y-142 inhiberede signifikant proliferation af NUGC-3 i en koncentrationsafhængig måde (fig. 3B). Inhiberingen af ​​celleproliferation nåede 72% ved den maksimale koncentration antistof. I modsætning hertil Y-073 havde ingen virkning på proliferation. Lignende resultater blev opnået i de andre testede cellelinjer, dvs. 5637 og BxPC-3 (fig. 3B). Da Y-073 inhiberede funktioner SHB-EGF og havde ingen virkning på nogen af ​​de proHB-EGF cellelinier i sfæroidet kultur, blev det foreslået, at funktionen af ​​endogent proHB-EGF var dominerende i sfæroid kultur, sammenlignet med den funktion af endogene SHB-EGF. Disse resultater viste, at proHB-EGF fungerede som en vigtig celledeling faktor i kræftceller.

Sfæroide dannelse og celledeling efter funktion proHB-EGF blev vurderet under Y-142 behandling. Cellerne blev podet i en sfæroid kulturplade i nærvær af 1% serum. Efter en 1-d inkubationsperioden blev cellerne behandlet med de angivne koncentrationer af anti-HB-EGF-antistof og dyrkes i 3 dage. A. Sfæroide dannelse af NUGC-3-celler. Baren i hvert billede indikerer 500 um. B. Inhibering af proHB-EGF-afhængig celleproliferation med Y-142. Celleproliferation blev målt ved CellTiter-Glo og er vist som procentdelen af ​​spredningen af ​​PBS-behandlede celler. Kontrol IgG, hvid square; Y-142, sort firkant; Y-073, sort cirkel. Datapunkterne repræsenterer middelværdien ± SD af værdier erhvervet i tre eksemplarer. C. Reduktion i HB-EGF protein ved HB-EGF siRNA. Cellelysater af siRNA-transficerede NUGC-3-celler blev underkastet SDS-PAGE. HB-EGF blev detekteret ved western blotting, med β-actin som intern kontrol. D. Bekræftelse af proHB-EGF-afhængig celledeling af HB-EGF siRNA. NUGC-3 celler blev transficeret med HB-EGF siRNA før sfæroide kultur. En dag efter siRNA transfektion blev cellerne podet i en sfæroid dyrkningsplade. Celleproliferation blev målt ved CellTiter-Glo og vist som en procentdel af celleproliferation af PBS-behandlede celler. Datapunkterne repræsenterer middelværdien ± SD af værdier erhvervet i tre eksemplarer.

For yderligere at bekræfte, at hæmning af celleproliferation var forårsaget af den forstyrrelse af funktionen proHB-EGF, vi evaluerede effekten af ​​HB- EGF siRNA på celleproliferation i sfæroid assay for NUGC-3-celler. Reduceret ekspression af proHB-EGF grund HB-EGF siRNA blev bekræftet ved Western blotting (fig. 3C). I overensstemmelse med knockdown af proHB-EGF-ekspression, HB-EGF siRNA medført nedsat celleproliferation (fig. 3D). Vi fandt, at omfanget af inhibering af celleproliferation med HB-EGF siRNA var den samme som observeret med Y-142. Disse resultater er i overensstemmelse med den opfattelse, at Y-142 hæmmer proHB-EGF-funktion, som kan føre til reduceret celleproliferation.

At udforske den molekylære mekanisme bag de funktioner proHB-EGF i celle overlevelse, vi målte caspase aktivering, en central begivenhed i apoptose [24], i NUGC-3-celler. Som angivet i fig. 4, Y-142 fremmet aktiveringen af ​​caspase-3/7 (fig. 4), mens Y-073 havde ingen virkning. Dette resultat indikerede, at proHB-EGF har celleoverlevelse aktivitet i cancerceller, og at inhibering proHB-EGF udløser caspase-medieret apoptose.

celleoverlevelse aktivitet af proHB-EGF blev testet ved at måle caspaseaktivering. NUGC-3-celler blev podet i en sfæroid kulturplade i nærvær af 1% serum. Efter en 1-d inkubationsperioden blev cellerne behandlet med Y-142 og dyrket i 1 d. Caspaseaktivering blev målt ved caspase-Glo 3/7. Kontrol IgG, hvid square; Y-142, sort firkant; Y-073, sort cirkel. Datapunkterne repræsenterer middelværdien ± SD af værdier erhvervet i tre eksemplarer.

Hæmning af proHB-EGF Juxtacrine Aktiviteter af Y-142

I modsætning til SHB-EGF, som virker ved autokrine og parakrine mekanismer, juxtacrine signalering er en mekanisme unik for proHB-EGF [11]. Vi antager, at virkningen af ​​Y-142 kan medieres specifikt gennem inhibering af proHB-EGF juxtacrine signalering. Fordi juxtacrine aktivitet blev rapporteret at være EGFR-medieret [11], målte vi phosphorylering af EGFR samt af dens downstream proteiner ERK1 /2 og AKT, som er involveret i celleproliferation og caspase-medieret apoptose i henholdsvis NUGC -3 celler. EGFR inhibitor erlotinib, anvendt som en positiv kontrol, inhiberede phosphorylering af EGFR, ERK1 /2, og AKT (fig. 5). Svarende til effekten af ​​erlotinib, Y-142 nedsatte phosphorylering af EGFR, ERK1 /2, og AKT, hvorimod Y-073 samt kontrol IgG ikke gjorde. Inhiberingen af ​​deres phosphorylering med Y-142 var signifikant 15 min efter behandlingen og varede i op til 3 d, hvilket antyder, at juxtacrine signal konstitutivt var tændt i sfæroid. Disse data antydede, at proHB-EGF juxtacrine aktivitet fører til celleproliferation samt celleoverlevelse aktivitet.

proHB-EGF juxtacrine aktivitet blev målt ved anvendelse af Y-142. NUGC-3-celler i en sfæroid dyrkningsplade blev behandlet med 200 nM kontrol-IgG, 200 nM Y-142, 200 nM Y-073, eller 1 nM erlotinib i de angivne tidsrum. A. Phosphorylering af EGFR. B. Phosphorylering af ERK1 /2. C. Phosphorylering af AKT. Phosphorylering blev beregnet som procentdelen af ​​phosphoryleringen af ​​PBS-behandlede celler. Datapunkterne repræsenterer middelværdien ± SD af værdier erhvervet i tre eksemplarer. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af uparret t-test (one-tailed, vs PBS-behandlede prøve på det tilsvarende tidspunkt). *, P 0,05; **, P 0,005; ***, P. 0,0005

Ingen Effekt af Y-142 på CTF Generation

CTF, som produceres sammen med SHB-EGF ved ectodomænet udgydelse, driver celledeling [ ,,,0],25]. At vurdere bidraget af CTF til inhibering af celleproliferation med Y-142, blev CTF beløb undersøgt i NUGC-3-celler. PMA [26] blev anvendt som kontrol for at stimulere ektodomænet udgyde og CTF produktion. Som vist i fig. 6, mængden af ​​CTF genereret i nærvær og fravær af Y-142 var ikke væsentligt forskellige, hvilket tyder på, at Y-142 havde nogen indflydelse på dannelsen af ​​CTF.

Virkningen af ​​CTF på den observerede inhibering af celleproliferation (fig. 3B) undersøgt ved at måle mængden af ​​CTF. Cellelysater af PMA-, kontrol IgG, Y-142- eller Y-073-behandlede NUGC-3-celler blev underkastet SDS-PAGE. CTF blev påvist med anti-CTF polyklonale antistof i Western blotting.

Discussion

HB-EGF består af en membranbundne form (proHB-EGF), en opløselig form (SHB -EGF), og et C-terminalt fragment (CTF), og hver har en unik biologisk aktivitet. Blandt disse 3 former, har funktionen af ​​SHB-EGF blevet bredt vurderet ved anvendelse af rekombinante proteiner. Til dato har den biologiske aktivitet af proHB-EGF blevet foreslået på grundlag af virkningen af ​​transficerede proHB-EGF på proliferationen og overlevelsen af ​​EGFR-udtrykkende celler [11], [14] – [16] eller på basis af virkningen af ​​proHB-EGF overekspression på autonom celleproliferation [17], [18]. Men oplysninger om funktionen proHB-EGF har været sparsomme og usammenhængende, muligvis på grund af manglen på en metode til specifikt at aktivere eller hæmme proHB-EGF. I nogle andre undersøgelser, uncleavable mutant proHB-EGF (UC-proHB-EGF), som har 2 aminosyreerstatninger (Leu148 og Pro149) i spaltningsstedet, blev anvendt til at evaluere proHB-EGF funktion [26]. uc-proHB-EGF er blevet vist at have juxtacrine aktivitet i formalin-fikserede EGFR-udtrykkende celler [27]. Hvis uc-proHB-EGF fulde repræsenterer vildtype proHB-EGF-funktioner, selv i levende celler, kan denne mutant være nyttig til at identificere proHB-EGF funktioner i sfæroide kultur. For nylig blev en anden version af UC-proHB-EGF, hvis spaltningsstedet blev slettet, bruges til at studere proHB-EGF-funktioner. Denne uc-proHB-EGF forhindrede anoikis af Madin-Darby hunde nyre celler [28]. Men i sammenligning med disse tilgange hidtil anvendte, er der nogle fordele ved vores tilgang ved hjælp af en 3D-klumpformet kultur og en funktionel anti-HB-EGF antistof: funktioner endogent udtrykt kan påvises proHB-EGF og formalin fiksering, som det kan forårsage, er ikke nødvendig, fordi der ikke er nogen endogen funktion SHB-EGF.

Akkumuleret rapporter viste, at sfæroid kultur efterligner kræft miljø bedre end en 2D kultur i form af celle-celle kontakter, resistens, narkotika penetration, og næringsstoffer effektivitet [23], [29]; derfor, funktioner endogent udtrykte proHB-EGF findes i 3D klumpformet tyder på, at proHB-EGF kan spille vigtige roller i tumor progression. I denne undersøgelse anvendte vi 3 kræftceller endogent udtrykker proHB-EGF. Y-142 inhiberede proliferationen af ​​NUGC-3-celler med 72%, 5637-celler med 55%, og BxPC-3-celler med 24% ved den maksimale koncentration (fig. 3B). Som vist i fig. 1A, de 3 cellelinjer har forskellige niveauer af proHB-EGF-ekspression (NUGC-3 celler 5637 celler BxPC-3-celler), hvilket kan forklare den relative effekt af Y-142 på proliferation. De 3 cellelinier er afledt af mave, blære, og pancreas-cancer væv, som vides at overudtrykke HB-EGF [30] – [32]. HB-EGF er blevet rapporteret at være opreguleret i andre typer cancer, såsom bryst- og ovariecancere og glioblastoma [33] – [35]; derfor kan proHB-EGF udøver sine funktioner i et bredt område af cancertyper.

I sfæroidet kultur, behandling med Y-142 øgede antallet af celler, der diffunderer ud af sphæroidkernen (fig. 3A) . Inhiberingen af ​​proHB-EGF juxtacrine aktivitet blev detekteret selv 3 d efter Y-142 behandling (fig. 5), når celle diffusion blev set. Vi spekulere, at proHB-EGF-medieret celle-celle kontakt direkte forbundet med dets proHB-EGF juxtacrine aktivitet. Resultaterne af en tidligere undersøgelse med uc-proHB-EGF-støttede denne spekulation i, at resultaterne viste en cytobeskyttende rolle proHB-EGF ved at øge EGFR-medieret celle-celle kontakt og viste, at caspaseaktivering blev hæmmet af proHB-EGF /EGFR /AKT-vejen [28]. Vi har registreret også caspaseaktivering og inhiberede EGFR og AKT phosphorylering af Y-142 behandling i klumpformet kultur (fig. 4, 5A og 5C). Vores resultater kan afledes af inhiberingen af ​​den cytobeskyttende rolle proHB-EGF. Vi spekulere, at den anti-caspase funktion af proHB-EGF bidrager til cancer celleoverlevelse ved at inhibere apoptose signaler såsom de aktiveres i celler udsat for kemoterapeutiske midler, strålebehandling, hypoxi og immun cellemedieret cytotoksicitet. En tidligere undersøgelse rapporteret, at anti-apoptotiske protein BAG-1 medierer proHB-EGF celleoverlevelse virkning [36]. BAG-1-medieret celleoverlevelse effekt af proHB-EGF blev bemærket i CHO-celler, som mangler EGFR, hvilket antyder, at proHB-EGF /BAG-1-vejen bruger EGFR-uafhængig celleoverlevelse signalering. proHB-EGF kan anvende både de EGFR-afhængige og EGFR-uafhængige veje til at udøve sine celle overlevelse effekter. Desuden har vi bemærkede inhiberingen af ​​ERK1 /2 phosphorylering med Y-142 (fig. 5B), hvilket antyder, at celleproliferationen signal fra proHB-EGF medieres gennem ERK1 /2-vejen. Mens måle juxtacrine aktivitet proHB-EGF i en 3D kugleformet kultur, vi bemærkede hæmning af EGFR-signalering af Y-142 (fig. 5), hvilket tyder på, at proHB-EGF udøver anti-apoptotiske og celleproliferation funktioner på tilstødende celler gennem deres EGFR pathway. I tilfælde, hvor cancerceller udtrykker både proHB-EGF og EGFR, kan den samme celle fungere som donor og acceptor af celle overlevelse og spredning signaler. Tilsammen, forudser vi, at proHB-EGF effektivt inducerer tumorprogression ved direkte at fremme kræft celledeling og ved at hæmme apoptose. Som vist i fig. 6, har Y-142 ikke hæmme ektodomæne udgydelse, hvilket fører til CTF produktion. Derfor konkluderede vi, at den biologiske aktivitet af Y-142 findes her ikke kan tilskrives inhibering af CTF produktion.