PLoS ONE: endocytotisk Optagelse af zoledronsyre ved Tubular Celler kan forklare dens Nyrer effekter i kræftpatienter får høje doser af forbindelse

abstrakt

Zoledronsyre, et højpotent nitrogenholdig bisphosphonat anvendes til behandling af patologisk knogletab, udskilles umetaboliseret via nyrerne, hvis ikke bundet til knoglen. Hos cancerpatienter høje doser af forbindelsen renal ekskretion kan være forbundet med akut tubulær nekrose. Spørgsmålet om, hvordan zoledronsyre internaliseres af tubulære celler er ikke blevet besvaret indtil nu. I den nuværende arbejde, ved anvendelse af en primær human rørformet cellekultursystem blev vejen af ​​cellulær optagelse af zoledronsyre (fluorescens /radioaktivt mærket) og dens cytotoksicitet undersøgt. Tidligere undersøgelser i vores laboratorium har vist, at denne primære cellekultur model konsekvent efterligner fysiologiske egenskaber molekylær optagelse /transport af epitelet

in vivo

. Zoledronsyre blev fundet at blive taget op af rørformede celler via væske-fase-endocytose (fra apikale og basolaterale side) som det fremgår af dets co-lokalisering med dextran. Cellulær optagelse og den resulterende intracellulære niveau var dobbelt så højt fra den apikale side sammenlignet med den basolaterale side. Desuden blev den intracellulære zoledronsyre niveau fundet at være afhængig af den administrerede koncentration og ikke mættelig. Cytotoksiske virkninger blev dog kun set ved højere administrationsdoser og /eller efter længere inkubationstider. Selvom zoledronsyre er taget op af rørformede celler, kunne ingen netto tubulære transport måles. Det konkluderes, at væske-fase-endocytose af zoledronsyre og cellulære akkumulering ved høje doser kan være ansvarlig for den akut tubulær nekrose observeret hos nogle kræftpatienter får høje doser af stoffet

Henvisning:. Verhulst A, Sun S, McKenna CE, D’Haese PC (2015) endocytotisk Optagelse af zoledronsyre ved Tubular Celler kan forklare den renale effekter i kræftpatienter får høje doser af stoffet. PLoS ONE 10 (3): e0121861. doi: 10,1371 /journal.pone.0121861

Academic Redaktør: Franziska Theilig, Anatomi, SCHWEIZ

Modtaget: August 28, 2014 Accepteret: 16 februar 2015; Udgivet: Marts 10, 2015

Copyright: © 2015 Verhulst et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. AV er en post.doc af fonden for videnskabelig forskning Flandern (www.fwo.be). PD modtaget en forskningsbevilling fra Novartis. Medarbejdere af Novartis læste manuskriptet og gav tilladelse til offentliggørelse af data, men havde ikke nogen yderligere rolle i undersøgelsen design, dataindsamling og analyse eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Dette arbejde var finansieret af en forskningsbevilling fra Novartis. SS er Chief Operating Officer i BioVinc LLC startende fra 1. januar 2014. CMK er stiftende medlem og formand for den videnskabelige bestyrelse BioVinc LLC og ejer et patent US8431714 B2 licens til BioVinc, LLC. US8431714 B2 licens til BioVinc, LLC. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke vores tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere

Introduktion

Zoledronsyre eller zoledronat (Zometa;. Novartis Pharma AG , Basel, Schweiz) er et tredje generations, højpotente nitrogen (N) -holdige bisphosphonat, har vist fordelagtige virkninger i behandlingen af ​​malign hypercalcæmi og knoglemetastaser hos patienter med myelomatose, lunge, bryst og prostata cancer [1- 3].

N-holdige bisphosphonater, herunder zoledronsyre, alle viser en høj affinitet til knoglemineraler hydroxyapatit (HAP). Derfor disse lægemidler, når der cirkulerer i blodet rum, hurtigt at binde til knoglevæv, (± 60% af den administrerede dosis af zoledronsyre tilbageholdes i knoglen) [4], og som formodentlig frigives fra det under processen med knogleresorption. Når adsorberet ind i knoglemineraltætheden, er N-holdige bisphosphonater internaliseres via væskefase endocytose af osteoklast hvor de menes at inhibere farnesyldiphosphat-synthase, isoprenoid biosyntetisk enzym i cholesterolbiosyntese pathway [5]. Afbrydelse af en gren pathway af cholesterolbiosyntese pathway dvs. isoprenylering resulterer derefter i den farmakologiske aktivitet af N-holdige bisphosphonater [6]. Isoprenylering indebærer kovalent binding af farnesyldiphosphat eller geranylgeranyldiphosphat til carboxyterminalen af ​​regulerende proteiner, herunder de små GTPaser Ras, Rac, Rho og Cdc42. Sidstnævnte tre, samt talrige andre, geranylgeranylerede og spille en hastighedsbegrænsende rolle i den resorberende aktivitet af osteoklaster [7-9].

Zoledronsyre ikke er bundet til mineraliseret knogle udskilles, umetaboliseret ved nyren, hovedsageligt inden for de første timer efter administration [4; 10]. Kræftpatienter ofte modtager en månedlig dosis på 4 mg zoledronsyre infunderes intravenøst ​​i 100 ml væske i løbet af 15 minutter. I nogle af disse patienter renal udskillelse med høje cirkulerende mængder kan være forbundet med akut tubulær nekrose, kendetegnet ved tubulær celle degeneration, tab af børste grænse, og apoptose [11]. der er sammenhæng mellem peak niveauer af zoledronsyre i blodet og renal toksicitet siden nyreskade falder, når dosis reduceres eller infusionen tiden forlænges [1]. Den omstændighed, at renal toksicitet ikke er observeret i postmenopausale kvinder, der får kun en årlig dosis på 5 mg zoledronsyre under behandling af osteoporose er i tråd hermed [12].

Det er ikke endnu forstået af hvilken vej zoledronsyre optages af den renale tubulære celler. På den anden side er det kendt, at graden af ​​hvilken zoledronsyre og andre N-holdige bisphosphonater optages af forskellige celletyper er proportional med deres evne til væskefase endocytose [13-15]. Endvidere er det også muligt, at zoledronsyre anvender veje for transcellulær organisk anion transport involveret i den renale udskillelse af mange andre lægemidler [16-18].

er der udviklet en cellekultursystem af primære humane rørformede nyreceller i vores laboratorium. In vitro model blev karakteriseret udførligt både på det fysiologiske og patofysiologiske niveau og blev præsenteret evidens for disse kulturer til konsekvent efterligne de vigtigste fysiologiske egenskaber molekylær optagelse /transport af rørformede epitel

in vivo

[19-23 ]. Som vi tidligere beskrevet, disse kulturer viser både væske fase og receptor endocytotisk optagelse af molekyler [22; 24]. Derudover de besidder den fulde kapacitet for kontrolleret transport af molekyler, som både anioniske og kationiske transportproteiner molekyler over slimhinder [18], som de udtrykker en bred palet af transportere på mRNA og proteinniveauet. På det funktionelle plan, de primære humane rørformede cellemonolag bevarer de nødvendige maskiner til at mægle netto sekretion af det prototypiske substrater dvs den organiske kation, para-amino hippursyre (PAH), og den organiske anion kreatinin.

for bedre at forstå den observerede renal toksicitet zoledronsyre er formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge mulige optagelse ruter og farmakologiske håndtering af zoledronsyre ved tubulære epitelceller ved hjælp af ovenstående beskrevne primære humane cellekultur model.

Materialer og metoder

Primære humane rørformede nyrecellekulturer

humane tubulære epitelceller blev isoleret fra normalt humant nyrevæv, som blev tilgængelige gennem nefrektomi udføres på onkologisk indikation. Brugen af ​​dette væv med henblik på cellekultur blev godkendt (P2013 /268) af den etiske komité for Erasme Hospital (Bruxelles, Belgien) er involveret i væv samling. Skriftligt informeret samtykke blev opnået. Makroskopisk normalt væv blev opsamlet og bearbejdet på en steril måde. Cortex og ydre stribe af ydre medulla blev dissekeret, Decapsulated og skæres i stykker af ca. 1 mm

3. Bagefter blev vævsfragmenterne spaltet i collagenase D-opløsning (Roche, Ottweiler, Tyskland) i 2 t ved 37 ° C under kraftig omrystning, og sigtes gennem en 120μm sigte. Den resulterende cellesuspension blev fyldt på toppen af ​​en diskontinuerlig Percoll (GE Healthcare, Diegem, Belgien) gradient med densiteter på 1,04 og 1,07 g /ml. Efter centrifugering (25 min, 1620 rcf) blev celler fra krydset omhyggeligt aspireret, vasket og bragt i kultur som en blandet population af proksimal tubulær, distale, rørformede og samlerørene celler. Tubulære celler blev dyrket indtil konfluens (10 til 14 dage) på permeable, polycarbonat filter understøtninger (Costar, Corning, NY, USA) ved en tæthed på 50.000 celler /filter, i a-MEM (Life Technologies, Gent, Belgien) modificeret ifølge til Gibson d’Ambrosio [25] suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS). Cellekulturer dyrkes på 6,5 mm permeable (0.4μm porestørrelse) filter understøtninger (Costar) får lov til at polarisere og har en adskilt apikale og basolaterale rum.

For at undgå brugen af ​​utæt (ikke-sammenflydende) kulturer, sammenløbet af cellekulturer blev vurderet ved måling af transepitel resistens (TER) af monolagene. Monolag blev ikke anvendt til yderligere eksperimenter, hvis transepitel modstand af monolaget, korrigeret for modstanden i filteret, var mindre end 55 Ω.cm

2 ( 2 x SD under middelværdien TER ved begyndelsen af ​​forsøgene). TER blev målt ved anvendelse af en epitelial voltohmmeter udstyret med en stx2 elektrode (World Precision Instruments, Hitchin, UK). FCS-holdigt medium blev erstattet med serumfrit medium eller Krebs-opløsning før eksperimenterne beskrevet i de følgende afsnit

Målinger af cellelevedygtighed /monolag integritet

TER blev målt før og efter en 2h inkubationstiden med forskellige zoledronsyres koncentrationer (0, 0,1, 1, 10 og 100 uM). Cellelevedygtighed blev derefter evalueret under anvendelse af en MTT assay (Let for dig, Biomedica Gruppe, Wien, Østrig), ifølge producentens instruktioner. Cellelevedygtighed blev også registreret 4, 24 og 48 timer efter 2h inkubationsperioden med forskellige zoledronsyres doser (0, 1, 5 og 100 uM) og følgende 4, 24 og 48 timer inkubation med zoledronsyre (0, 1, 5 og 100 uM). Eksperimenter, der måler cellelevedygtighed /monolag integritet blev udført på monolag oprindelse fra 4 forskellige nyre prøver. For hvert forsøg /tilstand blev brugt mindst 4 monolag.

Optagelse af fluorescensmærkede zoledronsyre i primære humane rørformede nyre cellekulturer

Zoledronsyre blev fluorescens mærket med 5-carboxyfluorescein [5-FAM ] eller Alexa Fluor 647 [AF647]. 5-FAM og AF647 blev opnået fra Invitrogen. Fluorescerende mærkning blev udført ved stabil konjugation af succinimidylesteren af ​​fluoroforen til imidazolnitrogenet af zoledronsyre via linkeren strategi, som beskrevet tidligere af McKenna [26; 27]. Den mærkede zoledronsyre blev oprenset ved HPLC og karakteriseret ved UV, fluorescens,

1 H og

31P NMR og ved MS som beskrevet tidligere [26; 27] og efterfølgende opløst i PBS

Sammenflydende monolag. af primære humane rørformede nyreceller blev inkuberet enten på den apikale eller basolaterale side med 5-FAM /AF647 mærket zoledronsyre (50 uM) i 1 time ved enten 37 eller 4 ° C. Monolag blev derefter fikseret i formalin og modfarvet med Hoechst 33258. Dette forsøg blev udført på monolag oprindelse fra to forskellige nyre prøver.

For at kontrollere for, at zoledronsyre signal faktisk blev lokaliseret inde i cellerne, den cellemembranen i proximale tubulære celler blev mærket efter inkubation med zoledronsyre og fomalin fiksering. Til dette formål blev monolagene inkuberet i 20 min med normal æsel serum (20%), og i 2 timer med et monoklonalt muse-antistof til human leucinaminopeptidase, en specifik proksimal tubulær cellemarkør [19; 28; 29]. Efterfølgende en AF488-mærket æsel anti muse-sekundært antistof (Life technologies, Gent, Belgien) blev anvendt, og monolag blev modfarvet med Hoechst 33258.

Fluorescenssignaler blev evalueret ved hjælp af konfokal mikroskopi (Perkin Elmer, Zaventem, Belgien) og anvendelse af Volocity software (Perkin Elmer).

Identifikation af zoledronsyre-holdige intracellulære vesikler

for at undersøge, om den cellulære optagelse af zoledronsyre foregik ved væskefase endocytose og /eller receptor endocytose, sammenflydende monolag blev co-inkuberet med AF647-mærket zoledronsyre (50 uM) og FITC-mærket dextran eller FITC-mærket albumin, enten den apikale eller basolaterale side ved 37 ° C i 1 time. FITC- mærket dextran og FITC-mærket albumin etableres markører for flydende fase og receptor-medieret endocytose, henholdsvis [14; 30; 31]. Dette forsøg blev udført på monolag oprindelse fra to forskellige nyre prøver.

Desuden blev sammenflydende monolag af humane rørformede nyreceller inkuberet med cytochalasin B (45 min, 30 pM) før udsætter cellerne for AF647-mærket zoledronsyre, eller FITC-mærket dextran eller FITC-mærket albumin. Cytochalasin B, en celle-gennemtrængelig mykotoksin som stærkt hæmmer netværksdannelse ved actinfilamenter, generelt er anerkendt som en hæmmer af endocytose. Men cytochalasin B ikke påvirke [32-34] optagelsen af ​​FITC-dextran ved væskefase endocytose.

Fluorescenssignaler blev evalueret ved hjælp af konfokal mikroskopi (Perkin Elmer, Zaventem, Belgien) og anvendelse af Volocity software ( Perkin Elmer).

Måling af intracellulære niveauer af radioaktivt mærket zoledronsyre

Den intracellulære koncentration af zoledronsyre blev kvantificeret efter oprettelse stabile forhold. blev opnået stabile betingelser som beskrevet tidligere (Simmons, 1990), ved at tilføje de samme koncentrationer (5 uM) af zoledronsyre i forvarmet Krebs buffer til både det apikale og basolaterale side af de polariserede cellekulturer. Efter 1 times inkubering

14C mærket zoledronsyre (specifik aktivitet 2,04 GBq /mmol, leveret af Novartis Pharma AG, Basel) blev tilsat ved en koncentration på 1 pCi /ml til cellekulturmediet, enten den apikale eller basolaterale side af monolaget. Efter en yderligere inkubationsperiode på 1 time de permeable bærere blev skåret ud, og antallet af disintegrationer per minut blev målt i en scintillationstæller. Intracellulære niveauer af zoledronsyre præsenteres som pmol /cm

2. Eksperimentet blev udført 4 gange i monolag oprindelse fra 4 forskellige nyre prøver. For hvert forsøg /tilstand blev anvendt mindst 5 monolag.

Sammenligning af intracellulære radioaktivt mærket zoledronsyre niveauer syre til intracellulære radioaktivt mærkede mannitol niveauer

På monolag af en nyre (5 monolag /tilstand), intracellulære niveauer af zoledronsyre blev sammenlignet med dem af mannitol, et molekyle, som ikke internaliseres af tubulære celler [18; 35]. Cellulær ophobning af mannitol blev undersøgt ved at udføre et eksperiment er identisk med den beskrevet for zoledronsyre på parallelle monolag af samme nyre.

3H-mærket mannitol blev opnået fra Perkin Elmer (specifik aktivitet 432,9 GBq /mmol).

Virkningen af ​​et overskud af para-ammino hippursyre, østron-3-sulfat eller pamidronat på intracellulær niveauer af radioaktivt mærket zoledronsyre

effekten af ​​organisk aniontransporter substrater (PAH og østron-3-sulfat (E-3S), og en ekstra N-holdige bisphosphonat (pamidronat) på cellulære optagelse af zoledronsyre var undersøges ved co-inkubering af

14C mærket-zoledronsyre med en overskydende mængde af disse molekyler (50 uM) som beskrevet tidligere [18; 35]. eksperimentet blev udført i monolag oprindelse fra 2 forskellige nyre prøver med mindst 5 monolag /tilstand.

måling af transepitelial transport af radioaktivt mærket zoledronsyre og sammenligning med transepitel transport af radioaktivt mærket mannitol

for at måle transport af zoledronsyre gennem monolag af humane tubulære epitelceller en stabil tilstand blev skabt ved inkubering monolagene i 1 time med 5 uM af molekylet i forvarmet Krebs-puffer ved både den apikale og basolaterale side. Apikale til basolaterale og basolaterale til apikale flusmidler blev derefter målt i forskellige monolag. den

14C-mærket molekyle Derfor blev tilføjet til enten den apikale eller basolaterale side af kulturerne. En prøve blev derefter taget ved den modsatte side efter 1 times inkubation (medmindre andet er nævnt). Eksperimentet blev udført 4 gange i monolag oprindelse fra 4 forskellige nyre prøver. For hvert eksperiment mindst 5 monolag /tilstand blev anvendt.

Transport af zoledronsyre blev sammenlignet med den af ​​mannitol i monolag oprindelse fra 2 nyrer (for hvert eksperiment mindst 5 monolag /tilstand). Apikale til basolaterale og basolaterale til apikale mannitol flusmidler blev målt ved at udføre et eksperiment er identisk med den beskrevet for zoledronsyre på parallelle monolag af samme nyre.

3H-mannitol var fra Perkin Elmer (specifik aktivitet 432,9 GBq /mmol).

Effekt af indgivet koncentration om de intracellulære niveauer og transepitel transport af zoledronsyre

Effekten af den indgivne zoledronsyre koncentrationen på intracellulære niveauer og transepitel transport af forbindelsen blev undersøgt ved anvendelse af steady state opsætning som beskrevet i de respektive afsnit ovenfor. Zoledronsyre blev administreret i de følgende koncentrationer 0,25, 1, 5, 25 og 100 uM. Dette forsøg blev udført to gange på monolag originiating fra 2 forskellige nyre prøver og for hvert forsøg mindst 5 monolag /tilstand).

Statistik

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af IBM SPSS statistik 20. data blev analyseret ved hjælp af ikke-parametrisk statistik (Mann-Whitney U test) med Bonferroni-korrektion for multiple sammenligninger.

Resultater

Epithelial integritet og cellulær levedygtighed

Inkubation af monolag i 2 timer med forskellige koncentrationer af zoledronsyre (0,1 til 100 uM) havde ikke en direkte effekt på epitel integritet (fig. 1A) eller cellulær levedygtighed (fig. 1B). Vedligeholdelse af epitelial integritet er afgørende for at studere transcellulær transport af bestemte forbindelser som med alt for utætte monolag man ville ikke være i stand til at kvantificere transcellulære transport, da det ville være maskeret af den meget højere paracellulære transport.

(A) og levedygtighed (vurderet ved måling MTT produktion) (B) sammenflydende monolag af primære humane tubulære celler. TER blev målt før og efter en 2 timers inkubationsperiode med zoledronsyre (0 til 100 uM), hvorefter levedygtighed blev målt. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af 4 eksperimenter, udført på cellekulturer stammer fra 4 forskellige nyre prøver. Under hver af de fire forsøg mindst 4 monolag /betingelser blev anvendt. (C og D) Effekt af zoledronsyre inkubation på levedygtigheden af ​​sammenflydende monolag af primære humane rørformede celler på længere sigt. Sammenflydende monolag af primære humane rørformede celler blev inkuberet med forskellige (0 til 100 uM) koncentrationer af zoledronsyre i 2 timer og cellulær levedygtighed blev målt 4, 24 og 48 timer senere (C). Sammenflydende monolag af primære humane rørformede celler blev inkuberet med forskellige koncentrationer af zoledronsyre til 4, 24 eller 48 timer, hvorefter cellulær levedygtighed blev målt (D). Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af 2 eksperimenter, udført på cellekulturer stammer fra 2 forskellige nyre prøver. Under hver af de 2 eksperimenter blev anvendt mindst 4 monolag /tilstand. * P. 0,05 vs 0 uM

Måling af cellulær levedygtighed ved 4h, 24 og 48 timer efter en 2 timers inkubation med forskellige koncentrationer af zoledronsyre (0 til 100 uM), afslørede en signifikant reduceret levedygtighed for den højeste zoledronsyre koncentrationen (100 uM), 48h post-inkubation (p 0,0005) (fig 1C.). Når celler blev inkuberet i 4 timer, 24 timer eller 48 timer med de samme koncentrationer af zoledronsyre, blev en signifikant, dosisafhængig reduktion i levedygtighed ses efter 48h (Fig. 1D).

cellulære optagelse af zoledronsyre

Inkubation af primære humane rørformede monolag ved 37 ° C med fluorescerende (enten 5 (6) -FAM eller AF647) mærket zoledronsyre på den apikale membran resulterede i et distinkt vesikulær fluorescerende signal inde i cellerne (fig. 2). Den intracellulære lokalisering af forbindelsen blev yderligere vist ved co-immunfarvning af den proximale tubulære cellemembranen med leucinaminopeptidase (fig. 3). Ingen forskel kunne observeres i lokaliseringen af ​​det fluorescerende signal, når fluorescensmærkede zoledronsyre blev indgivet ved den basolaterale stedet for den apikale side af monolagene. Endvidere intet signal kunne iagttages, når cellerne blev inkuberet ved 4 ° C (fig. 2C-D).

Monolayer A og B blev inkuberet ved 37 ° C, Cand D ved 4 ° C.

for at undersøge ved som optages i cellerne pathway zoledronsyre, cellulære monolag blev co-inkuberet med enten FITC mærket dextran (etableret markør for væskefase endocytose eller FITC-mærket albumin (etableret markør for receptor-medieret endocytose) og AF647 mærkede zoledronsyre indgives ved den apikale eller basolaterale side. som vist på fig. 4 (optagelse fra apikale side), zoledronsyre og dextran er klart co-lokaliseret i de intracellulære vesikler, der beviser cellulær optagelse af væske fase endocytose. Et lignende billede blev set efter samtidig inkubation af fluorescensmærket zoledronsyre og dextran på den basolaterale side. Som vist på fig. 5 (optagelse fra apikale side), zoledronsyre indeholdende vesikler ikke co-lokalisere med vesikler indeholdende albumin , implicerer, at zoledronsyre ikke optages af receptor-medieret endocytose, som yderligere ses af det faktum, at i modsætning til zoledronsyre, albumin er næsten ikke taget op fra den basolaterale side (data ikke vist).

pile viser klart co-lokalisering af zoledronsyre (rød signal) og dextran (grøn signal) i de samme vesikler, farvning gul i det fusionerede figur.

zoledronsyre (rød signal) og albumin (grøn signal) klart ikke colocalized.

endvidere opnåede resultater efter inkubation celler med cytochalasin B yderligere bekræfter en fælles optagelse vej for zoledronsyre og dextran. Mens cytochalasin B resulterede i en klar hæmning af albumin optagelse ingen effekt blev set for dextran /zoledronsyre (fig. 6). Efter cytochalasin B inkubation den grønne mærkede albumin ligger langs den cellulære membran og ikke som vesikler i cellerne. Disse resultater viser, at dextran og zoledronsyre optages af en fælles, optagelse rute, dvs. væskefase endocytose mens albumin er taget op af en anden (receptormedieret) endocytotisk proces, inhiberet af cytochalasin B.

Kvantificering af cellulær optagelse /intracellulære niveauer af zoledronsyre

fig. 7 viser de intracellulære niveauer af

14C-mærket-zoledronsyre i primære cellekulturer afledt af 4 forskellige nyre prøver. Igen, disse forsøg indikerer, at zoledronsyre optages fra både det apikale og basolaterale side og viser endvidere, at intracellulære niveauer bliver signifikant (p 0,0005) højere, når det indgives på den apikale side (28,7 ± 11,8 pmol /cm

2 ) sammenlignet med den basolaterale side (13,2 ± 5,9 pmol /cm

2). Til sammenligning de intracellulære niveauer af mannitol var kun 3,3 og 4,0 ± 1,0 pmol /cm

2, når de indgives til enten den apikale eller basolaterale side, henholdsvis.

Denne figur viser resultaterne af 4 eksperimenter på monolag oprindelse fra 4 forskellige nyre prøver (for hvert eksperiment mindst 5 monolag /tilstand). Intracellulære koncentration blev beregnet som pmol /cm

2

Effekt af organisk aniontransporter substrater og pamidronat på intracellulære niveauer af zoledronsyre

Et overskud af organisk aniontransporter substrater PAH /E-3S blev anvendt for at undersøge, om zoledronsyre optagelse i renale tubulære celler medieres af organisk anion transportører. Et overskud af pamidronat, en anden N-holdig bisphosphonat, blev anvendt for at kontrollere, om en fælles optagelse pathway begge bisphosphonat molekyler. Da intracellulære niveauer af zoledronsyre ikke ændrede i nærvær af et overskud af den organiske anion transporter substrater PAH og E-3S (fig. 8), heller ikke administration af pamidronat udøve nogen virkning på de intracellulære niveauer af zoledronsyre (Fig . 8) ingen argumenter blev opnået for zoledronsyre optagelse af organisk anion transportører eller for en fælles optagelse rute begge bisfosfonater.

Hver tal repræsenterer resultaterne af en repræsentant eksperiment på celler, der stammer fra en nyre (mindst 5 monolag /tilstand). Intracellulær zoledronsyre koncentrationen blev beregnet som pmol /cm

2.

transepithelial transport af zoledronsyre

Vi næste undersøgt, om cellulær ophobning af zoledronsyre gik sammen med netto transcellulær zoledronsyre syre flux. Fluxe rettet fra enten den apikale til den basolaterale side (Ja-bl) eller den basolaterale til apikale side (JBL-a) blev målt i monolag oprindelse fra 4 forskellige nyre prøver. Resultaterne viste fluxe i begge retninger for at være næsten lig med hinanden (fig. 9), hvilket antyder, at zoledronsyre transporten sker ad den paracellulære vej. Dette blev yderligere bekræftet af den konstatering, at de transepiteliale fluxe af zoledronsyre var ikke højere end mannitol (fig. 10).

Denne figur viser resultaterne af 4 eksperimenter på monolag oprindelse fra 4 forskellige nyre prøver ( for hvert eksperiment mindst 5 monolag /tilstand). Transepitelial fluxe i begge retninger ikke signifikant forskellig fra hinanden.

Dette tal repræsenterer resultaterne af en repræsentant eksperiment på celler, der stammer fra en nyre (mindst 5 monolag /tilstand).

koncentration afhængighed af rørformede håndtering af zoledronsyre

for at kontrollere den mulige effekt af zoledronsyre koncentrationen på transport og intracellulære akkumulering cellekulturer blev inkuberet med forskellige koncentrationer af forbindelsen, der spænder fra 0,25 til 100 uM (fig. 11). Resultater i fig. 10A viser, at flusmidler fra den apikale til den basolaterale side (Ja-bl) og fra den basolaterale til apikale side (JBL-a) adskilte sig ikke fra hinanden over hele koncentrationsområdet. Desuden konstateringen af, at der ikke plateau er nået, giver en ekstra indikation af, at transporten udelukkende finder sted ved den paracellulære måde.

Virkningen af ​​zoledronsyre koncentrationen på intracellulære niveau er vist i fig. 11B. Igen, tillader det intracellulære akkumulering ikke nå et plateau inden for det brede koncentrationsområde undersøgt. Sidstnævnte fund er vejledende for det faktum, at cellulære ophobning af zoledronsyre ikke er reguleret af membranagtige protein transport molekyler, da disse med rimelighed ville blive mættet ved de høje koncentrationer, der anvendes i det foreliggende forsøg.

(A) og intracellulær zoledronsyre koncentrationen (B). Zoledronsyre transport og intracellulær akkumulering blev målt i sammenflydende monolag af primære humane rørformede celler ved anvendelse af steady state set-up. Dette tal repræsenterer resultaterne af en repræsentant eksperiment på celler, der stammer fra en nyre (mindst 5 monolag /tilstand).

Diskussion

Zoledronsyre er et velkendt terapeutisk middel, der anvendes at mindske knogleresorption hos patienter med osteoporose (Reid

et el

., 2002). Desuden forbindelsen anvendes også ved relativt højere doser hos patienter med myelomatose, lunge, bryst og prostata cancer [1-3]. Grund af dets høje affinitet til hydroxyapatit, er størstedelen af ​​den indgivne zoledronsyre formodes at akkumulere i knoglen. Den zoledronsyre der ikke binder til knoglen udskilles, umetaboliseret af nyrerne, hovedsageligt inden for de første timer efter administration [4; 10]. Da administration af høje doser af zoledronsyre kan være forbundet med akut tubulær nekrose hos en række patienter [11], zoledronsyre optagelse /akkumulering af tubulære celler sandsynligvis forekommer. Faktisk fluorescensmærket risedronat, som strukturelt ligner zoledronsyre, er blevet detekteret i knogler, men også i nyrevæv efter administration til mus [14].

Brug af tidligere beskrevne primære humane rørformede cellekultur opsætning , vigtige aspekter af rørformede zoledronsyre håndtering blev undersøgt. En zoledronsyre koncentrationsinterval på 0,0, 0,25, 1,0, 5,0, 25 og 100 pM (svarende til 0, 67,5, 270, 1350, 6750 og 27.000 ng /ml) blev anvendt. Da serum zoledronsyre Cmax niveauer i patienter efter en 15 min intravenøs infusion af 4 mg zoledronsyre er omkring 300 ng /ml [10], de laveste koncentrationer, der anvendes i vores eksperimentelle set-up svarer således perfekt til serumniveauer i zoledronsyre syre behandlede patienter. Ved at bruge de højere zoledronsyre koncentrationer (25 og 100 uM) var vi i stand til at påvise, at zoledronsyre optagelse /transport var ikke satiable.

Det kunne tydeligt påvises, at zoledronsyre optagelse af tubulære celler sker ved væskefase endocytose . Dette er i overensstemmelse med observationen af ​​Roelofs et al. viser, at cellulære optagelse af zoledronsyre og dens analoge risedronat fortrinsvis sker i celletyper med en høj flydende fase endocytotisk kapacitet såsom osteoklaster og monocytter /makrofager [13; 14].

For at udelukke en mulig effekt af den store kromofor på optagelsen af ​​mærkede zoledronsyre blev to forskellige fluorescerende mærker valgt, som viste ensartede resultater således indikerer, at optagelsen af ​​zoledronsyre ved de rørformede celler blev bestemt overvejende af moderlægemidlet snarere end de konjugerede fluorescerende farvestoffer. Dette understøttes yderligere af, at radioaktivt mærket zoledronsyre også tages op i de primære humane rørformede celler. Kvantificering af optagelsen af ​​radioaktivt mærket zoledronsyre afslørede en signifikant højere (± 2 gange) optagelse fra den apikale side sammenlignet med den basolaterale én.