PLoS ONE: Overekspression af YAP og TAZ er en uafhængig Predictor af Prognose i kolorektal cancer og relaterede til spredning og metastaser af Colon Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund og Formål

Ja-associeret protein (YAP) og transkriptionel co-aktivator med PDZ-bindende motiv (TAZ) er nukleare effektorer af Hippo vej. Selv om de rigeligt udtrykkes i cytoplasmaet og kerner af menneskelig kolorektal cancer (CRC), og relateret til tumor spredning status, har der været få undersøgelser af prædiktive rolle YAP og TAZ udtryk på samlet overlevelse af patienter med CRC. Dette studie undersøgte YAP og TAZ udtryk i både CRC patienter og tyktarmskræft cellelinjer, og vurderet deres prognostiske værdi.

Metoder

paraffinindlejrede prøver fra 168 egnede patienter blev brugt til at undersøge YAP og TAZ udtryk ved immunhistokemi, og sammenlignet med eksperimentelle resultater i tyktarmskræft HCT116 cellelinie at udforske deres kliniske betydning i CRC.

resultater

statistisk signifikante positive korrelationer blev fundet mellem protein udtryk for YAP og TAZ i CRC væv. Patienter med højere YAP eller TAZ udtryk viste en tendens til kortere overlevelsestid; vigtigere, vores kohorte undersøgelse viste, at patienter med både YAP og TAZ overekspression præsenterede de værste resultater. Dette blev støttet af multivariat analyse. I HCT116 kolon kræftceller, blev evnen til spredning, metastaser, og invasion dramatisk reduceret med knockdown af YAP og Taz udtryk ved siRNA.

Konklusioner

Co-overekspression af YAP og TAZ er en uafhængig prædiktor for prognosen for patienter med CRC, og kan forklare den højere spredning, metastaser og dårlig overlevelse resultatet af disse patienter

Henvisning:. Wang L, Shi S, Guo Z, Zhang X, Han S, Yang A, et al. (2013) Overekspression af YAP og TAZ er en uafhængig Predictor af Prognose i kolorektal cancer og relaterede til spredning og metastaser af Colon Cancer Cells. PLoS ONE 8 (6): e65539. doi: 10,1371 /journal.pone.0065539

Redaktør: Wanjin Hong, Institut for Molekylær og Cell Biology, Singapore

Modtaget: Februar 4, 2013; Accepteret dateret 25. april 2013; Udgivet: 10 juni 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.072.117). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hippo vej er en vigtig regulator af cellevækst, proliferation og apoptose. Det blev først opdaget af genetisk mosaik skærme i

Drosophila melanogaster

[1], [2]; men der er stadig flere beviser for, at Hippo vej begrænser også orgel størrelse i mammale systemer [3], [4] ved at hæmme celledeling og fremme apoptose. Komponenter af denne vej er stærkt konserverede i pattedyr, og omfatter MST1 /2; WW45; Lats1 /2; Mob1; YAP; TAZ; NF; FRMD6; og Fat4 [2]. MST1 /2 og Last1 /2 er kinaser, og WW45 og Mob1 fungere som adaptere /aktivatorer i pattedyr, sammen disse udgør kernen kinase kassette af Hippo-vejen. De Yki homologer: Ja-associeret protein (YAP) og dens paralog, transkriptionelle co-aktivator med PDZ-bindende motiv (TAZ), er de vigtigste mål for de centrale Hippo kinase kaskade, og anses for at være de nukleare effektorer af Hippo vej [5].

Tidligere undersøgelser har rapporteret, at afvigende ændring af de vigtigste komponenter i Hippo sti fører til ukontrolleret cellevækst, og er forbundet med udvikling af kræft [6], [7]. Dette indebærer, at Hippo pathway spiller en kritisk rolle i at undertrykke tumorvækst [8]. Aberrant aktivering af YAP er blevet forbundet med dårlig prognose i multiplum af humane cancere [5], [9] – [11], herunder hepatocellulær, ovarie- og malignt mesotheliom, og kan virke som et onkogen i brystcancer [15]. Som sådan har YAP blevet foreslået som kandidat onkogen. Endvidere blev overekspression af YAP sig at forøge leverstørrelse og eventuelt føre til tumorudvikling i betingede transgene musemodeller [5], [12], [13]. Yderligere undersøgelser har vist, at TAZ, og TAZ-afhængig sekretion af amphiregulin (AREG), spiller også en væsentlig rolle i bryst tumorgenese og metastase: ved overekspression TAZ væltes i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), dens spredning og onkogene egenskaber undertrykkes [16].

Selvom både YAP og TAZ har vist sig at være involveret i progressionen af ​​cancere stammer fra forskellige væv, er det nødvendigt at undersøge den vævsspecifikke rolle YAP og TAZ ekspression for at undersøge den rolle, YAP og TAZ i human colorectal cancer (CRC) og yderligere at forstå funktionen af ​​Hippo pathway. Nyligt offentliggjorte data antyder, at overudtrykt YAP kan samspil med β-catenin at drive proliferation af colon cancerceller, hvilket indebærer, at YAP kunne spille en rolle i behandlingen af ​​kræft [17]; dog, at vores viden, forskning i den kliniske betydning af YAP og TAZ, og den prognostiske værdi af YAP og TAZ, har været begrænset, og betydningen af ​​YAP og TAZ co-overekspression i CRC, forbliver undvigende.

i denne undersøgelse undersøgte vi den prognostiske værdi af både YAP og TAZ i en retrospektiv kohorteundersøgelse med en fem års opfølgning, for at bestemme den uafhængige forudsigende rolle YAP og TAZ hos patienter med CRC. Vi identificerede en synergi mellem disse to proteiner og en potentiel mekanisme, hvormed Hippo vej modulerer human CRC progression.

Materialer og metoder

Patienter og Opfølgende

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i den fjerde Military Medical University (FMMU, Xi’an, Kina), og alle deltagende patienter gav deres skriftligt informeret samtykke. Den retrospektive kohorte omfattede 168 patienter diagnosticeret med potentielt resektabel CRC fra februar 2006 og december 2007 Institut for Gastrointestinal kirurgi af Xijing Hospital, FMMU. Patienter med følgende kriterier blev udelukket fra deltagelse: havde fået adjuverende kemoterapi før kirurgi; var blevet diagnosticeret med gastrointestinal stromal tumor eller lymfom; havde yderligere kræftformer diagnoser; eller nægtet samtykke. Alle kliniske prøver blev hentet fra vævet arkiv af Patologisk Institut, Xijing Hospital, FMMU. Opfølgning blev opdateret hver tredje måned, fra alle deltagere, telefonisk. Samlet overlevelse blev defineret som den tid der er gået fra kirurgi til tidspunktet for patientens død. Patient død blev etableret fra deres familie

Immunhistokemi og Scoring

Paraffin-indlejrede sektioner af normale og tumorvæv blev farvet for YAP (H-125:. Sc-15407; Santa Cruz Biotechnology, USA ) og TAZ (NP_056287: ab118373, Abcam, UK) udtryk. Da antistof mod YAP anvendt i dette studie er et polyklonalt antistof, vi brugte Western blotting for at identificere antistof specificiteten af ​​YAP (fig S1). Immunhistokemi (IHC) for YAP og TAZ blev udført som tidligere beskrevet [7] med mindre modifikationer. Kort fortalt blev objektglassene afparaffiniseret i xylen og rehydreret gennem en gradueret alkohol serie, før endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 3% H

2O

2 i methanol. Efter blokering mod uspecifik proteinbinding blev prøver inkuberet natten over med YAP eller Taz primære antistoffer, fortyndes til de anbefalede koncentrationer (1:500), i et fugtigt kammer ved 4 ° C. Prøver blev vasket tre gange med phosphatbufret saltvand (PBS), før biotinyleret sekundært antistof blev anvendt i 30 minutter ved stuetemperatur. Visualisering blev udført ved anvendelse af 3,3 ‘diaminobenzidin (DAB) chromogen i 2-3 min. Negative kontroller blev fremstillet ved at erstatte det primære antistof med præimmunt kaninserum. YAP og TAZ farvning blev scoret af to uafhængige patologer, blindet til de kliniske karakteristika for patienterne. Pointsystemet anvendt til klassificering udtryk for YAP og TAZ er beskrevet i tabel 1.

Cell Culture

Følgende menneskelige tyktarmskræft cellelinjer: HCT116, LS174T, LoVo, SW480 og SW480 blev anvendt i denne undersøgelse. Alle cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). HCT116 og LoVo celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Invitrogen, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; HyClone); SW480 og LS174T-celler blev dyrket i RPMI1640 (Invitrogen, CA, USA) medium suppleret med 10% FBS; SW620-celler blev dyrket i Leibovitz L-15 (Invitrogen, CA, USA) medium med 10% FBS. Alle cellerne blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2.

Transfektion og gendæmpning

I lille interfererende RNA (siRNA) transfektion følgende siRNA rækkehuse blev syntetiseret (Genepharma, Shanghai, Kina) (5′-GGUGAUACUAUCAACCAAATT-3 ‘), rettet mod YAP gen; (5’-GGAUACAGGAGAAAACGCATT-3 ‘), rettet mod TAZ genet; og den negative kontrol duplex, (5’-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3 ‘). Disse siRNA-duplexer (100 nmol /L) blev transficeret ind HCT116 celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. HCT116 celler blev høstet 48 timer efter transfektion for gen eller protein analyse.

kvantitativ real-time Reverse-transkriptase polymerasekædereaktion

Totalt RNA blev ekstraheret fra cellelinjer under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) og efterfølgende syntese af cyklisk DNA (cDNA, TaKaRa, Japan), blev udført ifølge fabrikanternes protokoller. Real-time kvantitativ revers-transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR) blev udført under anvendelse af CFX96TM Real-Time PCR systemet (BioRad, CA, USA) med SYBR Green II kit (# DRR041A; TaKaRa, Japan) ifølge fabrikanterne anvisninger. QRT-PCR-analyse blev udført i et totalt volumen på 20 pi med følgende amplifikationstrin: et indledende denatureringstrin ved 95 ° C i 10 min; efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 15 s; og derefter forlængelse ved 55 ° C i 30 s. Udtrykkene blev normaliseret til det humane β-actin-gen. De følgende primersekvenser blev anvendt: 5′-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3 ‘(sense) og 5′-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3′ (antisense) for YAP; 5’-GTCACCAACAGTAGCTCAGATC-3 ‘(sense) og 5′-AGTGATTACAGCCAGGTTAGAAAG-3′ (antisense) for TAZ; 5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3 ‘(sense) og 5′-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’ (antisense) for β-actin.

Western blot-analyse Salg

Celler blev høstet i radioimmunudfældning assaybuffer (Santa Cruz Biotechnology). Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner (Millipore, MA, USA). Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri mælk i PBS-buffer i 2 timer ved stuetemperatur, før den blev målrettet iende følgende antistoffer ifølge producentens anvisninger: anti-Yap (1:500); anti-TAZ (1:500); og anti-actin (1:5,000; AC40: A4700; Sigma-Aldrich, USA). Membraner blev inkuberet med deres tilknyttede peberrodsperoxidasekonjugeret (HPC) sekundære antistoffer, og de antistof-bundne proteiner blev visualiseret ved kemiluminescens (New England Nuclear, MA, USA).

Cell Growth Assay (MTT)

Celleproliferation

in vitro

blev analyseret under anvendelse tetrazoliumsalt 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT); fordi gult MTT farvestof reduceres til en blå formazan ved respiratoriske enzymer, som kun er aktive i levedygtige celler, graden af ​​farveændring indikerer celleproliferation. HCT116-celler blev transficeret i 48 timer uden siRNA (parental); specifikke siRNA’er (si-Con, si-YAP eller si-TAZ); eller cotransficeret med si-YAP og si-TAZ (si-YAP-TAZ), og suspenderet i DMEM med 10% FBS. Kort fortalt, 2000 celler af hver klon (parental, si-Con, si-YAP, si-TAZ, og si-YAP-TAZ) blev udpladet i fem 96-brønds plader i 200 pi DMEM-medium. Til analyse: 20 pi MTT substrat (fra en 2,5 mg /ml stamopløsning i PBS) blev tilsat til hver brønd; pladerne blev returneret til inkubatoren i yderligere 4 timer ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2; blev mediet fjernet; cellerne blev solubiliseret i 150 pi dimethylsulfoxid; og kolorimetrisk analyse blev udført (bølgelængde, 490 nm). Én plade blev analyseret umiddelbart efter at cellerne klæbede (ca. 4 timer efter plating), og de resterende plader blev analyseret i løbet af de næste fire dage i træk.

flowcytometrisk analyse af apoptotiske celler

HCT116 celler blev transficeret i 48 timer uden siRNA (parental); specifikke siRNA (si-Con, si-YAP eller si-TAZ); eller cotransficeret med si-YAP og si-TAZ (si-YAP-TAZ), før de blev suspenderet i PBS med en tæthed på 1 × 10

6 celler /ml. Apoptotiske celler blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse af en Cytomics FC 500 flowcytometer (Beckman Coulter), efter inkubation af cellerne med et reagens indeholdende Annexin V-FITC og propidiumiodid (BD Bioscience, CA, USA) i 15 minutter i mørke ved stuetemperatur .

Analyse er invasiv og mobilitet (migration og invasion analyser)

Cell invasion og migration potentialer blev målt

in vitro

af Transwell assays (Millipore, Billerica, MA) som følger: HCT116-celler blev transficeret i 48 timer uden siRNA (parental); specifikke siRNA (si-Con, si-YAP eller si-TAZ); eller cotransficeret med si-YAP og si-TAZ (si-YAP-TAZ); Cellerne blev suspenderet i DMEM med 10 g /l BSA ved en tæthed på 50 celler /pl; 200 pi cellesuspensioner blev podet i de øvre kamre i Transwells, hvori den porøse membran blev enten overtrukket med Matrigel (BD Bioscience) for invasionen assays eller venstre ucoatet for migrationen assays. DMEM med 10% serum (500 pi) blev tilsat til den nederste kammer som en kemoattraktant. Efter migration i 24 timer, eller invasion i 48 timer blev celler, der var trængt filtrene fikseret i methanol og farvet i 4G /l krystalviolet. Antallet af migrerede og invasive celler blev bestemt ud fra fem tilfældige felter under et Olympus mikroskop (Olympus) ved × 10 forstørrelse.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev foretaget ved hjælp af IBM SPSS Statistisk software (version 20,0). Spearmans rank test blev anvendt til at vurdere sammenhængen imellem YAP og Taz udtryk; overlevelseskurver blev estimeret ved anvendelse af Kalplan-Meier-metoden; og fordelinger blev evalueret ved den lange rank test. Cox ‘proportionale farer modellering af faktorer potentielt relateret til overlevelse blev udført for at beregne hazard ratio (HR), og identificere, hvilke faktorer kan have en betydelig indflydelse på overlevelse. Forskelle i karakteristika mellem de to grupper blev undersøgt af Pearsons chi-square (χ

2) test og Fishers eksakte test. Alle

P

værdier blev bestemt ud fra 2-sidede test og forskelle med en

P

-værdi. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

kliniske betydning af YAP og TAZ Overekspression i kolorektal cancer Tissue

for at bestemme forekomsten og kliniske betydning af YAP og TAZ i CRC, vurderede vi udtryk for YAP og TAZ protein ved IHC i tumor- vævsprøver fra vores retrospektiv kohorte af 168 fra CRC patienter efter tumorresektion. Blandt de 168 patienter, 122 (72,6%) var positive for YAP ekspression, enten nukleare eller cytoplasmatisk (figur 1A); mens 46 (27,4%) var negative for YAP udtryk (figur 1B); 97 (57,8%) prøver var positive for TAZ ytringsfrihed; og 71 (42,2%) var negative for TAZ ekspression (figur 1 E og F, henholdsvis). I modsætning hertil blev der kun 3 (18,75%) og 2 (12,5%) ud af 16 tilstødende normale vævsprøver de fundet positive for YAP og TAZ udtryk, henholdsvis (figur 1C, D, G og H). Desuden var der en signifikant positiv sammenhæng mellem YAP og TAZ (r = 0,630,

P

0,001; Tabel S1)., Hvilket indikerer en potentiel sammenhæng mellem disse proteiner i CRC

( A) YAP-positive tumor; (B) YAP-negativ tumor; (C) YAP-positive normale væv; (D) YAP-negative normalt væv; (E) TAZ-positive tumor; (F) TAZ-negativ tumor; (G) TAZ-positive normale væv; (H) TAZ-negative normalt væv. Repræsentative billeder blev taget under et mikroskop (x10). Disse resultater indikerer den kliniske betydning af YAP og TAZ overekspression i CRC væv.

Som et resultat af disse observationer, vi vurderet forholdet mellem YAP og TAZ udtryk og de kliniske funktioner i CRC patienter ved Pearsons chi -square test eller Fishers eksakte test. Vores resultater viste, at ekspressionen af ​​YAP og TAZ markant var forbundet med den lymfeknude status i kolorektale tumorer (

P

= 0,001 og

P

= 0,013, henholdsvis), men blev ikke signifikant korreleret til køn, tumorplacering, tumorstørrelse, celledifferentiering, eller TNM fase (tabel 2). Den høje prognostiske virkning af lymfeknudemetastaser, og det samlede antal lymfeknuder, der skal resektion, er veletableret. En nylig undersøgelse viste, at de afskæringsværdier for lymfeknude-forholdet (forholdet mellem tumor-infiltreret noder til resektion lymfeknuder) er stærke uafhængige prognostiske faktorer for CRC patienter, baseret på analyser af kliniske og histopatologiske data fra 3026 patienter på en enkelt kirurgisk center i løbet af en periode på 25 år [18]. Disse resultater førte os til at undersøge den rolle, YAP og TAZ i prognosen for CRC patienter.

YAP og TAZ Co-overekspression blev forbundet med dårlig Samlet overlevelse

For at bestemme den prognostiske betydningen af ​​YAP og TAZ udtryk i CRC patienter, vi har forsøgt at relatere YAP og TAZ udtryk for de kliniske resultater. Den samlede mediane overlevelsestid blandt patienterne i vores retrospektiv kohorte var 43 måneder (interval: 1-56 måneder), og i slutningen af ​​opfølgningsperioden (60 måneder), 70 af de 168 patienter var i live, og 98 patienter var døde. Sammenhængen mellem YAP og TAZ proteinekspression og samlet overlevelse af CRC patienter blev undersøgt ved hjælp af Kaplan-Meier analyse og log-rank test for signifikans skøn. Patienterne blev delt i to grupper: dem med positivt udtryk for YAP eller TAZ, og dem med negative udtryk for YAP eller TAZ. En statistisk signifikant forskel blev fundet mellem det samlede overlevelse af de to grupper (lang-rank test:

P

0,02 og

P

0,001 henholdsvis). Patienter med højere udtryk for YAP eller TAZ tendens til at have en højere risiko for at dø sammenlignet med patienter med lavere udtryk for YAP eller TAZ, med ujusterede HR være 1,617 og 1,643 henholdsvis. Desuden blev celledifferentiering, lymfeknudemetastase, og TNM stadie fundet at være forbundet med prognosen for CRC patienter (tabel 3). Multivariat analyse viste, at højere udtryk for YAP eller TAZ var forbundet med en reduktion af den samlede overlevelse, med den justerede HR være 2,168 (95% CI: 1,125-4,179;

P

0,001) og 1,544 (95% CI:. 0,999-2,451;

P

= 0,05), hvilket viser, at ekspressionen af ​​YAP eller TAZ kunne være en prognostisk faktor uafhængig af disse justerede clinicopathologic egenskaber (tabel 3)

Derefter undersøgte vi, om co-overekspression af YAP og TAZ kunne have en prognostisk rolle i CRC. Vores kohorte patienter blev inddelt i fire grupper efter deres samlede ekspressionsniveauer af YAP og TAZ. En statistisk signifikant forskel blev observeret i den samlede overlevelse resultat mellem disse fire undergrupper af patienter; dem med positiv co-overekspression af YAP og TAZ havde den værste samlet overlevelse (figur 2). Cox ‘proportionale farer model, justeret for køn, alder, tumorstørrelse, tumor placering, differentiering status, og TNM stadie sammenlignet med YAP eller TAZ udtryk, viste, at negative udtryk for både YAP og TAZ var forbundet med væsentlig forbedret samlet overlevelse; henviser til, at blev udtryk for både YAP og TAZ forbundet med en markant dårlig samlet overlevelse (tabel 3), med den justerede HR være 3,118 (95% CI: 1,017-9,559;

P

0,001). Disse data viste, at YAP og TAZ co-overekspression kan have en specifik og uafhængig prognostisk betydning blandt CRC patienter

(A) Korrelation af YAP udtryk med den samlede overlevelse.; (B) korrelation af TAZ udtryk med samlet overlevelse; (C) korrelation af kombineret YAP og TAZ udtryk med den samlede overlevelse. En statistisk signifikant forskel er vist i samlet overlevelse resultat mellem de forskellige grupper af patienter, med dem, der har positiv co-overekspression af YAP og TAZ have den værste samlede overlevelse.

Overekspression af YAP og TAZ i HCT116 coloncancercellelinie

for yderligere at undersøge virkningen af ​​YAP og TAZ på progression af CRC, testede vi vores foreløbige kohorte undersøgelse konklusioner i cellelinje eksperimenter. Vi undersøgte først genet og protein ekspressionsniveauer af YAP og TAZ i HCT116, LS174T, LOVO, SW620, og SW480 Tyktarmskræft cellelinjer. HCT116 celler viste de højeste ekspressionsniveauer af både YAP og TAZ (figur 3A og B); derfor blev HCT116 cellelinie valgt til efterfølgende eksperimenter for at undersøge YAP og TAZ i CRC progression

(A) QRT-PCR-analyse af YAP og Taz udtryk.; (B) Western blot-analyse af YAP og Taz udtryk. β-actin anvendes som en intern loading kontrol. HCT116 celler viser de højeste ekspressionsniveauerne af både YAP og TAZ.

Effekt af YAP eller TAZ siRNA på YAP eller Taz Niveauer i human HCT116 Colon Cancer Cell Lines

Vi næste undersøgte effekt af YAP og TAZ i HCT116 celle linje gennem knockdown af YAP eller TAZ udtryk ved hjælp af målrettet siRNA’er. Specificiteten af ​​siRNA målretning for YAP og TAZ blev bekræftet ved Western blot analyse. Sammenlignet med celler, der var blevet transficeret med kontrol siRNA, ekspressionen af ​​YAP og TAZ var stærkt undertrykt i HCT116-celler transficeret med 10 ug af målrettede siRNA’er (figur 4A og figur S2).

(A) Western blot-analyse cellelinjer med reduceret YAP og Taz niveauer efter transfektion med siRNA’er: forældrenes HCT116 celler, som bærer ingen siRNA (forældrenes); kontrol siRNA (si-Con); siRNA til Yap (si-YAP); siRNA til TAZ (si-TAZ); og cotransficeret med siRNA til Yap og siRNA til TAZ (si-YAP-TAZ). (B) MTT celle vækst analyser af kontrol celler (parental, si-Con); celler med reduceret YAP eller TAZ udtryk (si-YAP, si-TAZ); eller celler med reduceret YAP og TAZ udtryk (si-YAP-TAZ). Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse, n = 3, *

P

0,05. (C) Flowcytometrisk analyse af celler farvet med Annexin-V-FITC og PI: celler, der bærer ingen siRNA (parental); kontrol siRNA (si-Con); siRNA til Yap (si-YAP); siRNA til TAZ (si-TAZ); og celler med reduceret YAP og TAZ udtryk (si-YAP-TAZ). Disse resultater indikerer, at YAP udtryk har en større effekt på celleproliferation og undertrykkelse af apoptose sammenlignet med TAZ ekspression; Men en synergistisk rolle mellem YAP og TAZ øger deres samlede individuelle effekter.

Effekt af YAP og TAZ Expression på Cell Proliferation

MTT analyser blev anvendt til at bestemme virkningerne af nedsat YAP og TAZ udtryk på HCT116 tyktarmskræft celle vækstrater. Gruppen transficeret med YAP siRNA viste en signifikant reduktion i proliferationshastighed i forhold til gruppen transficeret med parentale eller kontrol siRNA’er. En lignende tendens blev observeret med TAZ siRNA; Men virkningen var ikke så stærk. Den gruppe, der blev co-transficeret med YAP og TAZ siRNA’er viste den mest dramatiske og særdeles signifikant (

P

0,05), fald i proliferationshastighed sammenlignet med de parentale eller kontrollere siRNA grupper (figur 4B); derfor, disse resultater viste, at YAP og TAZ besad en synergistisk rolle om spredning af tyktarmskræft celler.

Effekt af YAP og TAZ Expression på HCT116 Cells Apoptose Ratio

Vi undersøgte derefter forskellen i apoptose forholdet mellem YAP og /eller Taz knockdown grupper og kontrolgruppen for at bekræfte vores retrospektive kohorte undersøgelsesresultater. Flowcytometri-analyse viste, at apoptose forholdet blev reduceret i HCT116-celler transficeret med YAP siRNA sammenlignet med HCT116 celler transficeret med forældre- eller si-Con siRNA (17,48% versus 1,62%,

P

0,05; 17,48% vs. 2,28%,

P

0,05, henholdsvis, figur 4C); effekten var lidt svagere i HCT116 celler transficeret med TAZ siRNA i forhold til dem, transfekteret med forældre- eller si-Con siRNA (6,48% vs.1.62%,

P

0,05; 6,48% vs. 2,28%,

P

0,05, henholdsvis, figur 4C); imidlertid apoptose forholdet var mest dramatisk reduceret i HCT116 celler cotransficeret med YAP og TAZ siRNAs sammenlignet med dem transfekteret med forældre- og si-Con (33,60% vs. 1,62%,

P

0,01; 33,60 % vs. 2,28%,

P

0,05, henholdsvis, figur 4C). Kollektivt, disse resultater viste, at YAP udtryk havde en stor rolle i at fremme celledeling og undertrykke celle apoptose; TAZ spillede en vigtig, om end mindre væsentlig rolle i denne udvikling; og en synergistisk effekt mellem YAP og TAZ øget deres indvirkning på celleproliferation og apoptose yderligere.

Effekt af YAP og TAZ om migration og invasion

YAP og TAZ aktivitet har tidligere vist sig at mediere tumor cellemigration og invasion. Vores observation, at en reduktion af YAP og TAZ udtryk spillede en synergistisk rolle i hæmning af celledeling og øget apoptose af HCT116 celler førte os til at vurdere effekten af ​​YAP og TAZ siRNA co-transfektion på migrations- og invasion kapaciteter af tyktarmskræft celler. Standard, og Matrigelcoatede transwell assays blev anvendt til at vurdere migration og invasion, hhv. Både YAP og TAZ siRNA transficerede celler udviste statistisk signifikant reduceret migration i sammenligning med kontrolceller; reduktionen var større i gruppen transficeret med TAZ siRNA; Men gruppen transficeret med både YAP og TAZ viste den mest signifikant effekt på reduktionen af ​​migration (figur 5A og B). Tendenserne var ens i de Matrigel invasion assays: kloner med reducerede YAP eller Taz niveauer viste en statistisk signifikant reduktion er invasiv i forhold til kontrol celler; effekten var mere markant i TAZ knockdown gruppe; dog blev observeret, når både YAP og TAZ blev slået ned (figur 5C og D)., den mest signifikant reduktion invasiv

(A) Repræsentative billeder (× 10) af migration analyser af HCT116 celler med normale niveauer af YAP og TAZ udtryk (forældre- og si-Con); celler med undertrykte niveauer af YAP eller TAZ udtryk (si-YAP eller si-TAZ); og celler med undertrykt YAP og TAZ udtryk (si-YAP-TAZ). (B) Mean antal celler fra de fem uafhængige migration assays beskrevet i tidligere. (C) Invasion assay af forældrenes HCT116 celler; si-Con celler; si-YAP; si-TAZ; og si-YAP-Taz celler i modificerede Boyden kamre med Matrigelcoatede membraner. Efter 24 timer blev invasive celler, der var flyttet gennem Matrigel membranen farves og talt under et mikroskop ved × 10 forstørrelse. (D) Grafisk fremstilling af invasive celler beregnet som middelværdi ± SD fra fem felter. Disse viser statistisk signifikant reducerede migration i både YAP og TAZ siRNA transficerede celler sammenlignet med kontrol celler; effekten er størst i gruppen transficeret med både YAP og TAZ. [Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle i YAP eller TAZ siRNA transficerede celler vs. si-Con eller parentale celler, (*,

P

0,05, **,

P

0,01) .].

diskussion

YAP og TAZ er store nedstrøms mål i Hippo signalvejen. Til dato har der været en betydelig mængde af beviser, der forbinder YAP /TAZ onkogen til tumorgenicitet i flere solide kræftformer, herunder ovarie, bryst, prostata, lever og lunge [7], [9], [12], [15]. Overekspression af YAP er blevet rapporteret at aberrerende aktivere et array af målgener ansvarlige for celleproliferation, overlevelse, anti-apoptose, og migration [19], [20]. Desuden har tidligere undersøgelser identificeret YAP som en uafhængig prognostisk markør for samlet overlevelse og sygdomsfrie tider af hepatocellulært carcinom (HCC) patienter; og clinicopathologically forbundet med tumor differentiering [21]. Baseret på de etablerede synspunkter, som YAP kan øge orgel størrelse, og fungere som et onkogen [5], [9]; og at TAZ kan fremme celleproliferation, inducerer epitel-mesenkymale overgang (EMT), og øge celle migration og invasion [22]; kombineret med potentiale lighed vævsspecifikke funktioner YAP og TAZ, vi undersøgt og karakteriseret den kliniske betydning af YAP og TAZ som en selvstændig prognostisk faktor til bestemmelse af resultaterne af CRC patienter. Vores resultater stemte overens med en tidligere undersøgelse [7], idet ekspressionsniveauerne af både YAP og TAZ blev signifikant forhøjet i de fleste CRC væv sammenlignet med tilstødende normale væv; Men i modsætning til rapporter om brystkræft og lungekræft pladecellekræft, fandt vi ingen uoverensstemmelse mellem cytoplasmatisk og nuklear udtryk for YAP eller TAZ i CRC væv [15]. Variationer i angivelsen af ​​YAP mellem forskellige kræft væv er sandsynligvis på grund af deres komplicerede tumor mikromiljø. Brug multivariat Cox regressionsanalyser, fandt vi, at høj co-ekspression af YAP og TAZ var en prognostisk prædiktor for samlet overlevelse af CRC patienter, uafhængigt af køn, alder, tumorstørrelse, differentiering status, vaskulær invasion, og TNM stadie. Desuden blev de laveste overlevelsesrater identificeret hos patienter, som co-udtrykte YAP og TAZ, og var forbundet med tumorer, der har den største kapacitet migration og invasion.

YAP er anerkendt som kandidat onkogen, og blev den fokus for forskning, efter at det blev identificeret i humant kromosom 11q22-amplikon, der er tydeligt i adskillige humane cancere [14]. TAZ er en YAP paralog, oprindeligt identificeret som et 14-3-3 bindende protein [23]; TAZ har ca. 50% sekvensidentitet med YAP, og en lignende topologi; TAZ virker som en transkriptionel co-aktivator i måde svarende til Yap [23]; at bemærke, var opdagelsen af, at YAP og TAZ deler nedstrøms transskriptionsfaktor, TEAD, at fremme celleproliferation, migration, forankringsuafhængig vækst, og EMT, der alle er involveret i cancer initiering og progression [24]. Desuden mekanismerne i TAZ og YAP regulering af Hippo er ens. Disse resultater tyder delt regulering og funktion mellem TAZ og YAP;