PLoS ONE: forhøjet niveau af Wnt5a Protein i lokaliseret prostatacancer Tissue er forbundet med bedre resultat

Abstrakt

Baggrund

Wnt5a er en ikke-kanonisk udskilt glycoprotein af Wnt familien, der spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft og progression. Tidligere undersøgelser rapporterer, at Wnt5a er opreguleret i prostatakræft og foreslog, at Wnt5a påvirker migration og invasion af prostata tumor celle. Denne undersøgelse havde til formål at vurdere den prognostiske værdi af Wnt5a proteinekspression i prostatakræft væv og dets potentiale til at forudsige udfaldet efter radikal prostatektomi hos patienter med lokaliseret prostatacancer.

Metode og Resultater

immunhistokemisk analyse af et væv microarray indeholdende prostata enheder af 503 patienter med lokaliseret prostatacancer viste signifikant højere Wnt5a proteinekspression i cancer sammenlignet med benigne kerner fra de samme patienter (p 0,0001). Patienter med høj ekspression af Wnt5a protein havde betydeligt bedre resultat i form af tid til biokemisk tilbagefald sammenlignet med patienter med lavt udtryk niveauer (p = 0,001, 95% CI 1,361-3,570, Hazard s forholdet 2,204). En kombination af høj Wnt5a ekspression med lave niveauer af Ki-67 eller androgen receptor ekspression havde endda bedre resultat sammenlignet med alle andre grupper. Endvidere fandt vi, at Wnt5a ekspression korrelerede signifikant med VEGF og med Ki-67 og androgen receptor ekspression, men ikke stor betydning. In vitro, viste vi, at rekombinant Wnt5a faldt invasion af 22Rv1 og DU145 celler, og at siRNA knockdown af endogent Wnt5a protein ført til øget invasion af 22Rv1 og LNCaP celler.

Konklusion

Vi viser, at bevarede overekspression af Wnt5a protein i patienter med lokaliseret prostatacancer forudsiger et positivt resultat efter operationen. Dette fund sammen med vores in vitro-data demonstrerer evnen hos Wnt5a at forringe invasive egenskaber af prostatacancerceller, antyder en tumor undertrykkende virkning af Wnt5a i lokaliseret prostatacancer. Disse resultater indikerer, at Wnt5a kan anvendes som en prædiktiv markør og at det også er en sandsynlig terapeutisk mål for behandling af lokaliseret prostatacancer

Henvisning:. Syed Khaja AS, Helczynski L, Edsjö A, Ehrnström R, Lindgren A, Ulmert D, et al. (2011) forhøjet niveau af Wnt5a Protein i lokaliseret prostatacancer Tissue er forbundet med bedre resultat. PLoS ONE 6 (10): e26539. doi: 10,1371 /journal.pone.0026539

Redaktør: Alana L. Welm, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, USA

Modtaget: 17. april, 2011; Accepteret: September 28, 2011; Udgivet: 24 oktober 2011

Copyright: © 2011 Syed Khaja et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af den svenske Cancer Foundation (AB og TA), det svenske Forskningsråd (AB og TA), Söderberg fonde (TA), Malmö Universitetshospital Research Foundations (AB og TA), den Gunnar Nilsson Cancer Foundation (AB og TA ) og EU 6th Framework (P-Mark), Grant nummer LSHC-CT-2004 til 503.011. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: en patentansøgning har blevet forelagt med Anders Bjartell og Tommy Andersson som opfindere, hvor de, på grundlag af de foreliggende resultater, foreslår at behandle prostata cancer patienter med tumorer med en lav endogen Wnt5a udtryk med et stof, der genopretter Wnt5a signalering i prostata tumorer i sådanne patienter. Dette program ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den førende kræft påvirker mænd af alle racer og den næstmest førende dødsårsag i udviklede lande [1]. Androgener og androgen receptor (AR) spiller en kritisk rolle ikke kun i normal udvikling, vækst og funktion af prostata, men også i carcinogenese og progression af PCa [2]. Oprindeligt PCA-celler er almindeligvis AR afhængige for deres vækst og overlevelse, og dermed svare androgen deprivation terapi (ADT), men i senere faser PCA celler bliver androgen-ufølsom og fatal kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) udvikler [3] . De molekylære mekanismer ansvarlige for overgang til CRPC er dårligt forstået, men den mest konsekvente ændring der er associeret med kastrationsresistent vækst i den globale genekspression profiler af PCA xenotransplantater var en stigning i AR mRNA-niveauer [4]. Forøget ekspression af AR anses for at være et centralt element i CRPC og det er blevet påvist som en følge af enten mutation eller amplifikation af AR eller ved forøget ekspression forårsaget af deregulerede vækstfaktorer eller forskellige co-regulatorer [5]. Selvom vi har adgang til prognostiske faktorer i PCa, herunder Gleason kvalitet, TNM stadie, kirurgiske status margin og serum PSA-niveauer, der er et presserende behov for at identificere nye biomarkører, der kan forbedre betydeligt, enten alene eller i kombination med andre biomarkører, vores evne til at forudsige udfaldet i PCA patienter. Tidligere undersøgelser har antydet en mulig sammenhæng mellem AR og Wnt-β-catenin signalveje under udviklingen og progressionen af ​​PCa [6], [7].

For nylig er blevet gjort opmærksom på den rolle Wnt proteiner og Wnt signalering i PSA. Navnet Wnt kommer fra “vingeløse-relaterede MMTV integration site” og blev oprindeligt foreslået af Nusse og medarbejdere i 1991 [8]. Wnt proteiner udgør en familie af nitten udskilte glycoproteiner, der spiller vigtige roller under udvikling og i celle skæbne specifikation, cellevandring og cellepolaritet [9], [10]. Wnt proteiner kan inddeles i mindst to underfamilier; kanoniske Wnts der fremmer β-catenin-medieret transkription og ikke-kanoniske Wnts. Wnt signalering forekommer i en auto- eller parakrin måde gennem binding af secernerede Wnt molekyler til syv transmembrane Frizzled receptorproteiner (Fz) i fravær eller nærvær af co-receptorer, såsom LRP 5/6 og ROR [10]. Adskillige Wnt signaling komponenter har også været impliceret i tilblivelsen af ​​humane cancere; overekspression af Wnt-1 blev observeret i brystepitel- adenocarcinom [11] og i adskillige PCA cellelinier og PCA væv. Wnt-1-ekspression positivt korreleret med Gleason score, β-catenin og med serum PSA-niveauer [12]. Desuden baseret på bestemmelse af Wnt5a mRNA-niveauer i prostatatumorer det blevet foreslået, at unormal ekspression af den ikke-kanoniske Wnt5a er involveret i PCa [13].

Wnt5a, en af ​​de mest studerede ikke- kanoniske Wnts, er en væsentlig Wnt protein i at fremkalde og kontrollere Wnt /plane cellepolaritet (PCP) og Wnt /Ca

2 + veje [14], [15]. Desuden Wnt5a er ikke kun påvist at modvirke den Wnt /β-catenin vej, men også i særlige sammenhænge, ​​for at aktivere denne vej [16]. Muligheden for Wnt5a at inducere forskellige nedstrøms signaleringsbegivenheder kan i det mindste delvis forklare tilstedeværelsen af ​​forlydender om en tvetydig karakter Wnt5a; der enten en tumorsuppressor eller tumorfremmende funktionen afhængig kontekst og tumortype [16]. Tidligere undersøgelser har vist, at Wnt5a nedreguleres i visse maligniteter, herunder colorectal cancer (proteinekspression) [17], neuroblastom (mRNA-niveauer) [18], invasive duktale brystcarcinomer (proteinekspression) [19], [20] og leukæmier (mRNA niveauer) [21], hvilket indikerer en tumor undertrykke effekt af Wnt5a. Interessant nok har andre rapporter stedet foreslået et onkogent effekt af Wnt5a primært baseret på en opregulering i brystcancerceller (mRNA-niveauer) [22], gastrisk cancer (proteinekspression) [23], melanom (proteinekspression) [24], lungecancer og prostatacancer (mRNA-ekspression) [13]. Afvigende gen og protein udtryk for Wnt5a i PCa og mulige underliggende molekylære mekanismer er blevet beskrevet i tidligere rapporter [13], [25], [26], [27]. I en nylig undersøgelse, baseret på Affymetrix studier af normale prostata epitel- og cancercellelinjer udviste Wang et al, at øget transkription af Wnt5a genet i PCa skyldtes hypometylering; hvilket antyder, at epigenetisk regulering af Wnt5a ekspression kan være af betydning i PCa progression [28]. Enhver konklusion lavet af data fra en Affymetrix analyse uden en samtidig analyse af Wnt5a proteinekspression er farligt, da Wnt5a mRNA har en lang ikke-transkriberet 3′-region åben for translationel regulering. Data, der støtter en sådan translationel regulering af Wnt5a proteinekspression er tidligere blevet rapporteret [19], [29].

Nylige undersøgelser har vist øget Wnt5a og protein niveauer i PCa forhold til godartet væv [25], [26] . Yamamoto et al demonstrerede

in vitro Hoteller, som knockdown af Wnt5a reduceret invasive egenskaber DU145, og overekspression af Wnt5a stimuleret invasion af PC3 celler [25]. I modsætning hertil Wang Q og medarbejdere vist, at rekombinant Wnt5a ikke inducerer en øget motilitet i de samme PC3-celler [26]. Desuden er det blevet vist ved immunhistokemi (IHC) at Wnt5a ekspression korrelerede med Gleason score ≥8 i 24 patienter fra en kohorte af 98 PCA patienter, der havde gennemgået radikal prostatektomi. Dette kunne indikere, at Wnt5a fremmer aggressivitet, da patienter med lave Wnt5a niveauer haft et bedre tilbagefald overlevelse sammenlignet med patienter med høj Wnt5a niveauer [25].

Modstridende rapporter om rolle Wnt5a i PCa progression og sparsom oplysninger om Wnt5a udtryk i forhold til klinisk udfald, opfordrede os til at undersøge protein udtryk for Wnt5a i en stor populationsbaseret kohorte og dens mulige rolle at forudsige udfaldet efter operation for lokaliseret og overvejende lav kvalitet (91%) PSA. Denne undersøgelse blev suppleret med

in vitro

eksperimenter for at udforske mulige årsager til evne Wnt5a til at fungere som en prædiktiv biomarkør i denne patientkategori. I nærværende undersøgelse bekræftede vi, at Wnt5a protein niveauer blev opreguleret i PCa forhold til godartet væv, men vi fandt, at øget Wnt5a proteinekspression haft en positiv effekt på resultat i PCA patienter, som patienter med høje Wnt5a protein niveauer havde et bedre resultat sammenlignet med patienter med lave Wnt5a niveauer efter radikal prostatektomi. I god overensstemmelse, vi fandt også, at denne evne Wnt5a til positivt påvirke resultat i PCA patienter kan være på grund af sin evne til at hæmme invasion af PCA celler uden indledningsvist at påvirke deres spredning

in vitro

. Tilsætning af Foxy5 (en Wnt5a efterligne peptid) også faldet invasion, men ikke spredning af disse celler.

Resultater

immunhistokemisk evaluering af Wnt5a, AR, Ki-67 og VEGF

A tissue microarray (TMA) konstruktion med dobbelte kerner af både benigne og maligne væv fra 503 patienter (patienter egenskaber i tabel 1), der havde undergået radikal prostatektomi, blev immunfarvet for Wnt5a, AR, Ki-67 og VEGF (fig. 1a- F). Wnt5a proteinekspression blev detekteret i det cytoplasmatiske rum af epitelceller og lejlighedsvis i stromale celler af både kræft og godartede vævsprøver. Cancervæv fra de fleste patienter (82%) viste en homogen stærk cytoplasmatisk immunfarvning, at størstedelen af ​​godartede væv (65%) viste svag immunreaktion understøtter, at en opregulering af Wnt5a protein forekommer i kræftvæv. Resultater fra manuel scoring af cytoplasmatiske farvningsintensiteter i maligne og benigne epitelceller er illustreret i fig. 1G-I. Forskellen mellem Wnt5a farvningsintensiteter i cancer og godartede prøver viste sig at være signifikant (p 0,0001), når parret Wilcoxon rank sum test blev udført. I næsten 80% af de patienter, fandt vi stærke Wnt5a farvningsintensitet (vilkårlig enhed 2 eller 3) kræft kerner, mens kun 35% af patienterne viste stærk farvning i godartede vævsprøver. Yderligere oplysninger om de scoring data fra Wnt5a, AR, Ki-67 og VEGF farvede kerner er givet i tabel 2.

A B) Panelerne viser repræsentative Wnt5a immunfarvninger i benigne og kræft væv områder fra den samme patient C D) Panelerne viser repræsentative nukleare AR immunfarvninger i godartet og kræft væv områder E F) paneler omrids VEGF immunfarvning i benigne og cancer vævsområder fra den samme patient. Alle indsætter i panelerne skildrer forstørrelse (40 x) billeder af området angivet med pilen i den større billede set ved 15 ganges forstørrelse. G, H I) Panelerne skitsere grafiske illustrationer af Wnt5a, AR og VEGF protein udtryk i benigne og kræft prøver i PCA patienter. Baren i hvert panel skitserer 100 um. Vejviser

Androgen receptor farvning var overvejende nukleare som forventet og generelt mere intens i kræft sammenlignet med benigne vævsprøver som beskrevet i tabel 2. halvfjerds procent af tumor kerner blev intenst farvet sammenlignet med 53% af godartede kerner.

Nuclear Ki-67-ekspression blev anvendt som en proliferationsmarkør (fig S1A, B, C, D). Der var signifikante forskelle i Ki-67 farvning mellem kræft og godartede kerner, som 14% af de godartede kerner var negative for Ki-67, mens kun 5% af de kræftformer kerner var Ki-67 negative. Med hensyn til positiv Ki-67 nukleare farvning, næsten 9% af kræft kerner havde en farvning score mere end 2, mens det tilsvarende tal for de godartede kerner var kun 2,5% (tabel 2).

VEGF udtryk, som en surrogatmarkør for angiogenese, blev observeret i cytoplasmaet i både maligne og benigne epitelceller, med kræft områder, der viser højere farvning sammenlignet med godartet. Mere end 73% af kræft kerner viste stærk VEGF immunfarvning, mens kun 51% af de godartede kerner viste stærk immunreaktion (tabel 2).

Forskellen mellem AR, Ki-67 og VEGF farvning intensiteter i kræft versus godartede kerner var statistisk signifikant (p 0,0001). når Wilcoxon rank sum test blev udført (tabel 2)

Korrelation af Wnt5a vævsekspression med AR, Ki-67 og VEGF

i den foreliggende kohorte Wnt5a udtryk viste en positiv og statistisk signifikant sammenhæng med VEGF-ekspression (Spearman Rho (ρ) = 0,396, p 0,0001), svag, men stadig statistisk signifikante korrelationer med AR udtryk (ρ = 0,159, p = 0,007) og Ki-67-ekspression (ρ = 0,233, p 0,0001) (tabel 3). De fleste af de patienter (220/365, 60%) med stærk Wnt5a immunfarvning i cancervæv udviste også intens AR-farvning (tabel 4). Der blev observeret en lignende tendens, når Wnt5a og VEGF blev sammenlignet; 65% (219/339) af kræft kerner udstillet stærk farvning for både Wnt5a og VEGF. Vi fandt ingen forskelle i Wnt5a immunfarvning intensitet, når vi sammenlignede grupper af patienter med forskellige Gleason score. Blandt patienter med patologiske Gleason score op til 3 + 4 ( “low grade”), havde 81% forhøjet Wnt5a proteinekspression sammenlignet med 86% af patienterne med højere Gleason score (data ikke vist). Tilsvarende blev der ikke observeret nogen korrelation mellem Wnt5a farvning og patologisk T scenen, klinisk T fase, status kirurgisk margen eller sædblæren invasion (data ikke vist).

Wnt5a proteinekspression og forudsigelse af klinisk resultatet

Dernæst vi evalueret hvis Wnt5a protein-ekspression i cancer væv analyseret efter radikal prostatektomi for lokaliseret PCa kunne forudsige klinisk resultat som målt ved tid til biokemisk recidiv (BCR), ved hjælp af PSA 0,2 ng /ml i blodet prøver med en bekræftende værdi som et surrogat markør. Wnt5a proteinekspression som illustreret ved IHC var signifikant højere hos cancerpatienter områder sammenlignet med benigne områder (fig. 1, tabel 2). Interessant, når Kaplan-Meier-kurve blev plottet mellem Wnt5a proteinekspression og BCR fritid, et positivt resultat (p = 0,001) var tydelig for patienter med en høj Wnt5a proteinekspression sammenlignet med patienter med lav Wnt5a proteinekspression (fig. 2A). Som forventet blev lav udtryk for AR (figur S2C) og Ki-67 (figur S2B) i forbindelse med positivt resultat hvorimod VEFG udtryk ikke var signifikant associeret med BCR fritid (figur S2D)

Alle kræfttilfælde. blev adskilt i 2 grupper baseret på farvningsintensiteter af Wnt5a, Ki-67, AR og VEGF. De lave grupper omfattede tumorer med scoringer 0 eller 1 og de høje grupper omfattede tumorer med scoringer 2 eller 3. A) Panelet viser overlevelseskurver plottet mellem høj eller lav Wnt5a proteinekspression og BCR fritid. B) Panelet viser overlevelseskurver plottet mellem høj eller lav Wnt5a og høje og lave Ki-67 protein udtryk. Følgelig blev tumorerne opdelt i følgende 4 grupper; Wnt5a lav Ki-67 lav, Wnt5a lav Ki-67 høj, Wnt5a høj Ki-67 lav og Wnt5a høj Ki-67 høj. C Panelet viser overlevelseskurver plottet mellem høj eller lav Wnt5a og høje og lave AR protein udtryk. Følgelig blev tumorerne opdelt i følgende 4 grupper; Wnt5a lav AR lav, Wnt5a lav AR høj, Wnt5a høj AR lav og Wnt5a høj AR høj. D) Panelet viser overlevelseskurver plottet mellem høj eller lav Wnt5a og høje og lave VEGF protein udtryk. Følgelig blev tumorerne opdelt i følgende 4 grupper; Wnt5a lav VEGF lav, Wnt5a lav VEGF høj, Wnt5a høj VEGF lav og Wnt5a høj VEGF høj. I alle paneler høj ekspression af et protein er angivet ved ↑ henviser ↓ angiver lav ekspression. Hvert trin i kurverne repræsenterer tilbagefald i PSA. De angivne p-værdier i bunden højre side af panelerne indikerer betydelige forskelle i resultatet mellem de mest gunstige gruppe og det ugunstigste gruppe (se tabel 4 for mere detaljerede oplysninger).

Endvidere vi undersøgt, om Wnt5a proteinekspression også kunne forudsige udfaldet når det kombineres med nogen af ​​de andre væv biomarkører. Den bedste forudsigelse model blev opnået, når Wnt5a proteinekspression blev kombineret med enten AR eller Ki-67-ekspression (figur 2B, C.), Som patienter med højt Wnt5a og lav AR eller lav Ki-67-ekspression viste bedre tilbagefald overlevelse (p 0,0001), mens patienter med lav Wnt5a udtryk og høj AR eller høj Ki-67-ekspression havde den værste udfald efter operationen. Patienter med høj Wnt5a og lav VEGF-ekspression havde bedre resultat sammenlignet med andre grupper (p = 0,003) eller hver markør alene. Men kombinationen af ​​høj Wnt5a og lav VEGF var ringere end når Wnt5a blev analyseret i kombination med AR eller Ki-67 indikerer, at VEGF i ikke så stærk som Ar eller Ki-67 til at forudsige udfaldet i kombination med Wnt5a i nærværende sammenhæng ( fig. 2D). Cox regressional analyse blev anvendt til multivariate analyser og afslørede, at Wnt5a udtryk, Gleason score og patologisk T etape var uafhængige faktorer, der påvirker tilbagefald overlevelse i PCa (tabel 4).

Wnt5a proteinekspression og dens virkninger på invasion og spredning af PCa cellelinjer

Vores data viser, at patienter med højt Wnt5a proteinekspression har gunstigere resultat sammenlignet med patienter med lav Wnt5a proteinekspression. For bedre at forstå dette finde Wnt5a proteinekspression i en SV40 immortaliseret normal human prostata epitelial cellelinje (PNT2) og fire forskellige PCA cellelinier blev undersøgt. PNT2 celler havde en lav udtryk for endogen Wnt5a protein mens der var betydelig Wnt5a udtryk i PCA-cellelinjer LNCaP- og 22Rv1 (fig. 3A). Disse data er i god overensstemmelse med vores fund af Wnt5a protein-ekspression i øjeblikket analyseret kohorte af PCa og en nylig undersøgelse også udført på normal prostata epitelial og PCA-cellelinjer [26]. Imidlertid analyser af de to mere aggressive PCA cellelinier (PC3 og DU145) afslørede meget lav ekspression af Wnt5a protein, der kan sammenlignes med den normale PNT2 prostata epitelial cellelinje (fig. 3A). Interessant nok, Wnt5a protein niveauer matchet med AR protein udtryk i disse cellelinjer (fig. 3A).

A) Dette panel viser den endogene Wnt5a og AR udtryk i fire angivet PCA cellelinjer (LNCaP, 22Rv1 , DU145 og PC3-celler) og i en immortaliseret human prostata epitelcellelinie (PNT2 celler). Wnt5a proteinbånd blev identificeret ved at køre rWnt5a parallelt på den samme gel. Blottene blev testet igen for β-actin som ladningskontrol. De præsenterede blots er repræsentative for 4 separate forsøg. B) Panelet skitserer den relative invasion af LNCaP, 22Rv1, DU145 og PC3-cellelinjer efter 24 timer i fravær eller nærvær af rWnt5a (0,4 ug /ml) i assayet beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Resultaterne er givet som middelværdi ± SEM fra 5 separate forsøg. Forskellene i invasion mellem celler behandlet med bærer alene eller med rWnt5a blev vurderet for statistisk signifikans (p = 0,0001 for 22Rv1 og p 0,0001 for DU145). C) Panelet skitserer spredning af LNCaP, 22Rv1, DU145 og PC3 cellelinier efter 24 timer i fravær eller tilstedeværelse af rWnt5a (0,4 ug /m). Resultaterne er givet som middelværdi ± SEM fra 5 separate forsøg. Der var ingen signifikante forskelle i spredning mellem kontrol og rWnt5a behandlede celler. D) Panelet repræsenterer den relative invasion af 22Rv1 og DU145-celler efter 24 timer i fravær eller nærvær af Foxy5 (100 uM) under anvendelse af samme assay som i panel B. Forskellene i invasion mellem celler behandlet med vehikel alene eller med Foxy5 var evalueret for statistisk signifikans (p = 0,01 for 22Rv1 og p = 0,0003 for DU145). E) Panelet viser virkningerne af siRNA knockdown af Wnt5a i LNCaP og 22Rv1. Blottene blev testet igen for α-tubulin som ladningskontrol. De præsenterede blots er repræsentative for 4 separate forsøg. F) Panelet skitserer den relative invasion af LNCaP og 22Rv1 celler efter behandling med Wnt5a si-RNA (Wnt5a knockdown) eller krypteret siRNA (kontrol), i det samme assay tidligere anvendt i panel B. Resultaterne er angivet som middelværdi ± SEM fra 5 separate forsøg. Forskellen i invasionen mellem røræg og si-Wnt5a slået ned celler var statistisk signifikant for begge cellelinier (p 0,0001).

Vi brugte fire cancer cellelinjer (LNCaP, 22Rv1, PC3 og DU145 ) for vores efterfølgende invasion forsøg. Tilsætning af rekombinant Wnt5a (rWnt5a) faldt den invasive opførsel af både 22Rv1 og DU145 cancerceller (fig. 3B). Hverken LNCaP eller de PC3 celler reagerede på rWnt5a med en ændring i deres invasive adfærd. Resultatet med PC3 celler er i overensstemmelse med en nyligt offentliggjort rapport fra Wang et al [26], hvor PC3 celler ikke reagerer på tilsætning af rWnt5a i en migration sår ridse assay. LNCaP-celler er kendt for at have en meget lav invasion aktivitet, og dette kan forklare, hvorfor disse celler ikke reagerer, når rWnt5a blev tilsat. Men når Wnt5a ekspression i LNCaP-celler blev slået ned ved hjælp si-RNA’er (fig. 3E), var der en signifikant stigning i den invasive opførsel af LNCaP-celler (Fig. 3F). Desuden Wnt5a knockdown ved si-RNA i 22Rv1 kræftceller også resulteret i øget invasion af disse celler (fig. 3E-F og Figur S4).

For at finde ud af, om faldet i invasionen af ​​22Rv1 og DU145 cellelinier med tilsætning af rWnt5a skyldtes at falde i proliferation af disse cellelinier, undersøgte vi proliferationshastighed i PCA-cellelinier. Tilsætning af rWnt5a havde ikke nogen signifikant effekt på proliferation i disse cellelinjer i løbet af de 24 timer, der bruges til invasionen assay (fig. 3C).

Siden rWnt5a faldt invasionen af ​​22Rv1 og DU145 celler, invasion assay var også udført i disse cellelinjer under anvendelse Foxy5 som er et hexapeptid afledt af aminosyresekvensen af ​​Wnt5a protein og tidligere vist at inhibere motilitet af brystcancerceller som rWnt5a [30]. Foxy5 faktisk undertrykt invasive kapaciteter af disse to PCA cellelinjer (fig. 3D), og dette fald i invasion var ikke forårsaget af nedsat proliferation som Foxy5 ikke påvirkede spredning status i disse cellelinjer (BrdU assay, data ikke vist).

diskussion

Så vidt vi ved, er dette langt kun én undersøgelse med et begrænset antal patienter har vist en rolle Wnt5a protein til at forudsige det kliniske resultat i PCa [25]. Det opfordrede os til at udføre en undersøgelse om Wnt5a proteinekspression i en større kohorte af veldefinerede PCA patienter med lokaliseret og overvejende lav kvalitet sygdom og relatere resultaterne med ekspression af andre kendte væv biomarkører og vigtigst med BCR. Nærværende undersøgelse omfattede en fortløbende serie af 503 PCA patienter, der havde gennemgået radikal prostatektomi i 1988-2003 på Skånes Universitetssygehus, Malmø, Sverige med en gennemsnitlig follow-up tid på 41,6 måneder (interval fra 1,51 til 205,90). Denne patient kohorte er stor, population baseret, og patienterne er velkarakteriserede (tabel 1). I TMA glider benigne og maligne væv fra den samme patient er til stede i dubletter. Baseret på Gleason kvaliteter patient materiale blev yderligere karakteriseret i lav kvalitet cancere (Gleason score op til 3 + 4) og ædelstål cancere (Gleason 4 + 3 eller højere). Næsten 89% af patienterne blev klassificeret som lav kvalitet kræftformer, hvilket kan forventes i en gruppe af patienter med lokaliseret PCa egnede til radikal prostatektomi. Som kontrol af vores kliniske materiale, vi konstateret, at der var en statistisk signifikant forskel i det kliniske resultat mellem patienter med lav kvalitet og high-grade kræft ved hjælp af Kaplan-Meier analyser af BCR-overlevelse (figur S2A). Yderligere kontrol af klinisk materiale viste også, at det samme var tilfældet, når proliferation blev undersøgt ved Ki-67-ekspression, en valideret væv biomarkør i PCa [31]. Patienter med højt Ki-67-ekspression havde reduceret tilbagefald overlevelsestid sammenlignet med patienter med lavt antal Ki-67, der udtrykker tumorceller (Figur S2B).

I nærværende TMA studie vi brugte en brønd kendetegnet ved -house antistof specifikt for Wnt5a som tidligere beskrevet i brystkræft undersøgelser [20]. Her, udførte vi også konkurrence med rWnt5a at bekræfte specificiteten af ​​antistoffet på prostatavæv sektioner (fig S3). Farvningsintensiteten faldt fra antistof alene til når antistof og rWnt5a blev anvendt, og allerede i et molært forhold på 1:10 vi fundet en klar reduktion af immunfarvning. Desuden har vi udført immuncytokemi (supplerende materialer og metoder S1) af Wnt5a i prostatakræft-cellelinier (LNCaP, 22Rv1 og DU145) efter forbehandling med enten røræg eller Wnt5a si-RNA (figur S4A, B, C, D, E) . Først observerede vi cytosolisk farvning af Wnt5a ligner den, der observeres i prostata cancer væv og for det andet, intensiteten af ​​Wnt5a immunfarvning faldt betydeligt i Wnt5a si-RNA behandlede celler sammenlignet med dem behandlet med røræg si-RNA. Behandling med Wnt5a siRNA faldt graden af ​​Wnt5a immunfarvning til et niveau svarende til den, der ses i de vestlige blots (fig. 3E). Analyse af vores TMA viser klart, at Wnt5a proteinekspression blev forøget i lokaliseret PCa sammenlignet med godartet væv fra de samme patienter, en virkning, som udviste en stærk statistisk signifikans (p 0,0001;. Figur 1 A, B 4 + 3) PCA tilfælde. Hvis disse tilsyneladende modstridende resultater tyder en klasse-relateret funktion Wnt5a eller kun afspejler de individuelle egenskaber af de to tumorer, hvorfra cellelinier blev indhentet, er svært at sige. Som en alternativ forklaring, kan antallet af high-grade PCa i den nuværende kohorte (n = 41) være for lille til at detektere en klasse-relateret Wnt5a nedregulering.

Vi har også fundet forøget ekspression af AR, Ki-67 og VEGF proteiner i lokaliseret PCa væv sammenlignet med godartet væv (fig. 1 C-F, H-i, tabel 2). For at opnå et første indblik i mulige mekanismer for hvordan Wnt5a funktioner i PCa, vi udførte statistiske analyser af mulige sammenhænge mellem Wnt5a proteinekspression og af AR, Ki-67 og VEGF, alle tre kendte til at blive opreguleret i progressiv PSA. Wnt5a signifikant korreleret med VEGF, en markør for angiogenese, hvilket indikerer, at Wnt5a kan være relateret til tumorvækst (tabel 3). I denne henseende vores data er noget anderledes end dem, der rapporteres fra analyser af ikke-småcellet lungekræft, hvor Wnt5a ikke korrelerer med VEGF-ekspression i cancervævet, men med VEGF i det omgivende stromale væv [32]. Endvidere Wnt5a ekspression i PCa væv i vores undersøgelse svagt men signifikant associeret med AR-ekspression (tabel 3). Proteinekspression analyse ved western-blot indikerede, at Wnt5a niveauer og AR ekspression i en immortaliseret prostata epitelcellelinie og 4 forskellige PCA cellelinier matchet med hinanden, hvilket indikerer en mulig sammenhæng mellem Wnt5a og AR i PCa (fig. 3A). Trods disse data, er det for nylig blevet vist, at Wnt5a inhiberer AR transkriptionel aktivitet i 22Rv1 celler, når disse celler blev transficeret med en Wnt5a plasmid [33]. Endelig blev Wnt5a proteinekspression svagt men signifikant associeret med Ki-67-ekspression (tabel 3). Dette resultat er i overensstemmelse med den rapport om ikke-småcellet lungekræft, hvor intratumoral Wnt5a udtryk signifikant korreleret med Ki-67 proliferation indeks [32], men i modsætning til undersøgelsen om hepatocellulært carcinom hvor Wnt5a har en tumor undertrykkende virkning og tab af Wnt5a har en stærk korrelation med høj Ki-67 proliferation indeks [34]. Tilsammen indikerer disse data, at den rolle Wnt5a signalering i reguleringen af ​​tumorcelleproliferation er usikker.

I denne undersøgelse fandt vi ikke en sammenhæng mellem Wnt5a protein-ekspression og Gleason score, selv om sidstnævnte maj være den bedste tilgængelige prognostiske indikator for udfaldet i PCa [35]. Men Gleason scoring har sine begrænsninger på grund af interobserver variation blandt patologer og dermed er der behov for supplerende markører.