PLoS ONE: Mutation Analyse af BRAF, MEK1 og MEK2 i 15 Kræft i æggestokkene cellelinier: Konsekvenser for Terapi

Abstrakt

Baggrund

Blandt gynækologiske kræftformer, kræft i æggestokkene er den anden mest almindelige og har den højeste dødelighed. Cancer er en genetisk lidelse, og opstår på grund af ophobning af somatiske mutationer i kritiske gener. En forståelse af den genetiske basis for kræft i æggestokkene har konsekvenser både for tidlig påvisning og til terapeutisk intervention i denne population af patienter.

Metodologi /vigtigste resultater

Femten æggestokkene kræft cellelinjer, der almindeligvis anvendes til in vitro eksperimenter, blev screenet for mutationer ved hjælp af tovejs direkte sekventering i alle kodende regioner af

BRAF

,

MEK1

MEK2

.

BRAF

mutationer blev identificeret i fire af de femten æggestokkene kræft cellelinjer undersøgt. Tilsammen udgør disse fire cellelinjer indeholdt fire forskellige

BRAF

mutationer, hvoraf to var roman. ES-2 havde den fælles B-Raf p.V600E mutation i exon 15 og Hey indeholdt et exon 11 missense mutation, p.G464E. De to hidtil ukendte B-Raf-mutanter blev identificeret, var en 5 aminosyre heterozygot deletion p.N486-P490del i OV90, og en exon 4 missense substitution p.Q201H i OVCAR 10. En af cellelinierne, ES-2, indeholdt en mutation i MEK1, specifikt en roman heterozygot missense substitution, p.D67N som resulterede fra en nt 199 G → a overgang. Ingen af ​​cellelinier indeholdt kodende region mutationer i

MEK2

. Funktionel karakterisering af MEK1 mutant p.D67N ved transient transfektion med efterfølgende Western blot analyse viste øget ERK fosforylering i forhold til kontroller.

Konklusioner /Betydning

I denne undersøgelse rapporterer vi roman

BRAF

mutationer i exon 4 og exon 12 og rapporterer også den første mutation i

MEK1

forbundet med human cancer. Funktionelle data indikerer

MEK1

mutation kan give ændring af aktivering gennem MAPK-vejen. Betydningen af ​​disse fund er, at

BRAF

MEK1 /2

mutationer kan være mere udbredt end forventet i kræft i æggestokkene, som kan få stor betydning for behandling af patienter med denne sygdom og foreslår potentiel ny terapeutiske veje

Henvisning:. Estep AL, Palmer C, McCormick F, Rauen KA (2007) Mutation Analyse af

BRAF

,

MEK1

MEK2

i 15 Kræft i æggestokkene cellelinier: Konsekvenser for terapi. PLoS ONE 2 (12): e1279. doi: 10,1371 /journal.pone.0001279

Academic Redaktør: Amanda Toland, Ohio State University Medical Center, USA

Modtaget: Juli 25, 2007; Accepteret: November 13, 2007; Udgivet: December 5, 2007

Copyright: © 2007 Estep et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. NIH tilskud HD048502 (KAR) forudsat en delvis finansiering. Canary Foundation giver delvis finansiering. De Kanariske Foundation havde ikke en rolle i indsamling, analyse og fortolkning af data

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den anden mest almindelige gynækologisk kræft i USA rammer ca. 22.000 kvinder hvert år forårsager en anslået 15.200 dødsfald [1]. Cancer er en genetisk lidelse som følge af ophobning af somatiske mutationer i gener involveret i kritiske cellulære pathways. Disse mutationer resulterer typisk i proteiner, som udviser deres onkogene virkning ved at ændre signalering gennem vitale transduktion net, eller i haploinsufficiency af kritiske tumor suppressor proteiner.

Forståelse den genetiske basis for ovariecancer har konsekvenser både for tidlig detektion samt som for terapeutisk intervention i denne patientpopulation. Gener, som er blevet fundet somatisk muteret i kræft i æggestokkene omfatter

KRAS

[2] – [5],

NTM

[2],

PIK3CA

[5] – [9 ],

PTEN

[5], [10], [11],

TP53

[5], [12], [13] og

BRAF

[2] – [4]. B-Raf, proteinproduktet af

BRAF

, er en serin /threoninproteinkinase og den første i mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) kaskade som er en af ​​de mange nedstrøms effektor veje for Ras. Ekstracellulære stimuli fører til aktivering af Ras, som igen aktiverer Raf (A-Raf, B-Raf, og /eller C-Raf-1). Raf phosphorylerer derpå og aktiverer MEK1 og /eller MEK2 (MAPK kinase). MEK1 og MEK2 er threonin /tyrosinkinaser med begge isoformer med evnen til at phosphorylere og aktivere ERK1 og ERK2 (MAPK). ERK, når aktiveret af MEK, har talrige cytosoliske og nukleare substrater [14]. Afvigende opstrøms signalering, hvilket resulterer i hyperaktiveret ERK spiller en central rolle i patogenesen og udviklingen af ​​ca. 30% af humane cancere, herunder ovariecancer [15]. Som følge heraf er denne vej været et attraktivt mål for udviklingen af ​​småmolekylære inhibitorer til behandling af cancer [16].

Gener omfattende MAPK-vejen,

BRAF

,

MEK1

MEK2

, blev systematisk scannet for mutationer i 15 æggestokkene kræftceller ved hjælp af tovejs direkte sekventering af alle exons. Tidligere rapporter har vist, at B-Raf muteres i ca. 28-37% af lav kvalitet serøse carcinomer [3], [17]. Med disse oplysninger, var vores søgning udvidet til at omfatte

MEK1

MEK2

, to gener sammen med

BRAF

, som vi for nylig har bestemt til at være kausal for hjerte-Facio -cutaneous (CFC) syndrom (MIM 115.150), en multipel medfødt anomali syndrom, hvor individer har karakteristisk kraniofacial dysmorphia, hjertefejl og ektodermale anomalier [18]. Interessant, i modsætning germlinie mutationer identificeret i CFC syndrom, ingen somatiske mutationer er nogensinde blevet identificeret i

MEK1 /2

i enhver kræft type. I vores analyse, roman

BRAF

mutationer blev identificeret i exon 4 og exon 12 af to separate cellelinjer. Desuden rapporterer vi den første funktionelle mutation i

MEK1

forbundet med human cancer. Betydningen af ​​disse fund er, at

BRAF

MEK1 /2

mutationer kan være mere udbredt end tidligere er indregnet i kræft i æggestokkene, som kan have stor betydning for behandlingen af ​​patienter med kræft i æggestokkene.

Resultater

BRAF og MEK1 mutationer

Genomisk DNA fra 15 æggestokkene kræft cellelinjer blev screenet for

BRAF

mutationer i kodning exon 1-18. Fire mutationer blev identificeret i fire individuelle cellelinier: OVCAR 10, OV90, Hey og ES-2 (figur 1). Ingen af ​​de andre cellelinjer havde

BRAF

mutationer. To af de fire

BRAF

mutationer identificeret var roman. OVCAR 10 indeholdt en nt 603 G → T transversion forårsager en heterozygot missense substitution p.Q201H i exon 4 (figur 1A). OV90 indeholdt en hidtil ukendt heterozygot 5 aminosyredeletion, p.N486-P490del, i exon 12 (figur 1B). Ud over de to nye

BRAF

mutationer identificeret, blev to yderligere mutationer, som tidligere er blevet rapporteret i kræft identificeret. Hey indeholdt en nt 1391 G → A-transition resulterer i en exon 11 missense mutation, p.G464E (figur 1C). Elektroferogrammet demonstrerede tab af heterozygositet i dette locus. ES-2 indeholdt et exon 15, T → A transversion ved nt 1799 substituere glutaminsyre til valin i position 600 (p.V600E) (figur 1D). Ingen af ​​disse mutationer blev identificeret i kontrollerne.

Fire

BRAF

mutationer blev identificeret i fire individuelle cellelinjer. A) OVCAR 10 indeholdt en nt 603 G → T transversion forårsager en heterozygot missense substitution p.Q201H i exon 4. B) OV90 indeholdt en hidtil ukendt heterozygot deletion begyndende ved nt 1457 (pil) resulterer i en 5 aminosyredeletion, p.N486 -P490del, i exon 12. C) Hey indeholdt en nt 1391 G → en overgang resulterer i tab af heterozygoti. D) ES-2 indeholdt et exon 15, T → A transversion ved nt 1799 substituere glutaminsyre til valin i position 600 (p.V600E). E) Et nt 199 G → En overgang i

MEK1,

exon 2 resulterede i en heterozygot missense substitution, p.D67N.

Alle elleve kodende exoner af

MEK1

og

MEK2

blev også sekventeret i de samme cellelinjer og kontroller. En mutation i

MEK1

blev identificeret i ES-2 består af en roman heterozygot missense substitution, p.D67N, hvilket skyldtes en nt 199 G → A overgang (figur 1E). Ingen andre ikke-synonyme substitutioner i MEK1 blev identificeret. Alle elleve kodning exons af

MEK2

blev sekventeret, og ingen ikke-synonyme udskiftninger blev identificeret.

Nukleotid Variation

Ud over disse mutationer, i alt fire forskellige synonyme enkelt nukleotid polymorfier (SNPs) blev identificeret i

BRAF

(tabel 1),

MEK1

(tabel 2), og

MEK2 Hotel (tabel 3). Tre af disse fire SNP’er blev fundet i fem eller flere af de femten cellelinier og er tidligere blevet rapporteret (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/). For frekvens, de tre synonyme database SNPs omfatter: i) MEK2 p.I220I (rs10250) til stede i 11 af de 15 cellelinjer (73%), ii) BRAF p.G634G (rs9648696) fundet i seks af de 15 celler linjer (40%), og iii) MEK2 p.D151D (rs17851657) identificeret i fem af de 15 cellelinier (33%). Der var én unikt identificeret MEK1 SNP i OVCAR 10 er resultatet af en nt 348 heterozygot G → A-transition i exon 3, p.Q113Q (tabel 2). Alle synonyme SNP’er blev karakteriseret ved SIFT (Sortering Intolerant Fra Tolerant) og fast besluttet på at blive tolereret. Vejviser

Funktionel karakterisering af mutanter

SIFT blev anvendt til at karakterisere funktionelle betydning af de ikke-synonyme aminosyresubstitutioner identificeret i B-Raf og MEK1. B-Raf p.G464E blev p.N486-P490del, p.V600E og MEK1 p.D67N forudsiges at være skadelige erstatninger forårsager en ændring af protein funktion, mens B-Raf p.Q201H var forudsagt til at blive tolereret.

for at bekræfte den funktionelle ændring af romanen MEK1 p.D67N mutant identificeret i ES-2, forbigående transfektion af HEK 293T-celler med efterfølgende Western blot analyse viste øget kinase aktivitet målt ved ERK fosforylering (figur 2). Den MEK1 p.D67N mutanten var steget ERK phosphorylering sammenlignet med vildtype MEK1. Niveauet af ERK phosphorylering var lavere end CFC MEK1 p.Y130C mutant, som er kendt for at have et højt aktivitetsniveau (positiv kontrol).

Humane embryonale nyre 293T-celler blev transient transficeret med tom vektor, Wild- skriv MEK1, MEK1 p.Y130C (positiv kontrol mutant, der har kendt højt aktivitetsniveau [18]) og MEK1 p.D67N mutant. ERK (p44 ERK1 og ERK2 p42) phosphorylering blev analyseret ved Western blotting under anvendelse af phospho-specifikke antistoffer. Den p.D67N MEK1 mutant var steget ERK fosforylering i forhold til niveauet induceret af tom vektor og vildtype MEK1. Niveauet af ERK phosphorylering fremkaldt af p.D67N MEK1 er lidt mindre end den CFC MEK1 p.Y130C mutant, som vides at have forøget aktivitet [18]. Myc-mærkede MEK1 er vist for transfektionseffektivitet og total ERK er vist som en loading kontrol.

Diskussion

Altered signalering gennem MAPK-vejen i cancer ofte resultatet af mutationer i opstrøms komponenter af ERK, herunder K-Ras, N-Ras, H-Ras, C-Raf-1 og B-Raf [15]. Molekylære undersøgelser af æggestokkene kræft cellelinjer og tumor prøver har identificeret genetiske mutationer i nogle af disse gener,

KRAS

,

NTM

og

BRAF

, som resulterer i ændring af signalering gennem denne kritiske vej [2], [19] – [23].

Somatiske mutationer i

BRAF

er blevet rapporteret ved en høj frekvens i mange kræftformer, herunder melanom, skjoldbruskkirtel, colorectal og æggestokkene. Ca. 70 missense-mutationer, der påvirker 34 kodoner er blevet rapporteret (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). Ved cancer, de fleste somatiske

BRAF

mutationer resulterer i missense-substitutioner findes i, men ikke begrænset til, exon 11 (glycin-rige loop) og exon 15 (aktiveringen segment) i proteinet kinasedomænet [ ,,,0],24]. En missense mutation i exon 15 resulterer i en missense substitution, B-Raf p.V600E, tegner sig for over 90% af

BRAF

mutationer identificeret i human cancer. Krystalstrukturen af ​​B-Raf viser, at aktiveringen segment holdes i en inaktiv konformation ved association med G-loop. Mutationer i disse to regioner, glycin-rige loop og aktiveringen segmentet, menes at forstyrre denne interaktion, konvertering af B-Raf til dets aktive konformation [25].

Ud over somatiske mutationer, germline mutationer i

BRAF

for nylig er blevet identificeret som årsag CFC syndrom, en multipel medfødt anomali uorden, hvorved enkeltpersoner har karakteristiske kraniofaciale dysmorphisms, hjerte-defekter, ektodermale anomalier og forsinket udvikling [18], [26]. De fleste af mutationerne i CFC syndrom falder uden for exon 11 og exon 15-protein kinase domæne. Den mest almindelige forårsagende CFC mutation, p.Q257R, bor i exon 6 i den cysteinrige domæne. Ligesom de fleste kræftfremkaldende mutationer i

BRAF

, biokemiske undersøgelser har fastslået, at de fleste nye CFC B-Raf mutante proteiner har øget kinase aktivitet i forhold til kinaseaktiviteten af ​​vildtype B-Raf [18], [26 ]. Disse undersøgelser pointere det faktum, at

BRAF

mutationer forekommer ikke kun somatisk men også i kimcellelinje, og at mutationer, der bibringer forøget kinaseaktivitet er ikke begrænset til dem, der typisk er forbundet med cancer.

Tovejs sekventering af alle de kodende exons af

BRAF

i 15 velkarakteriserede og stærkt udnyttede ovariecancer cellelinjer identificeret fire cellelinjer med

BRAF

mutationer. Kun én cellelinje havde det fælles exon 15

BRAF

mutation. ES-2, som er afledt af ovarie clear cell carcinoma [27] havde den fælles heterozygote p.V600E missense mutation. Tidligere rapporter har vist, at B-Raf muteres hyppigst i lav grad æggestokkene serøse carcinomaer med en frekvens på ca. 28-37%, og at alle mutationer er den fælles B-Raf p.V600E variant [3], [17]. Interessant, de to serøse-afledte cellelinier undersøgt i denne undersøgelse (Hey og OV90) havde ikke den fælles B-Raf p.V600E mutation; Men begge indeholdt

BRAF

mutationer. Hey, der stammer fra en papillær serøs karcinom [28], indeholdt et exon 11 missense mutation, p.G464E. Denne missense mutation er blevet beskrevet tidligere (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic) og er også en codon, som er muteret i CFC-syndrom ([29] Rauen, upublicerede data). OV90 som er afledt af en serøs adenocarcinoma [30] indeholdt en hidtil ukendt mutation i exon 12 resulterer i en heterozygot fem aminosyredeletion, p.N486-P490del. Selvom ekstremt sjældne, somatisk exon 15 B-Raf i-frame er blevet rapporteret sletning-indsættelser i kræft [31], [32]. Desuden har vi identificeret to CFC individer med små i-frame deletioner i exon 11 (Rauen, upublicerede data). Endelig OVCAR 10, som er afledt af en human ovarie epithelcancer, havde en unik heterozygot missense substitution p.Q201H i exon 4. Denne ikke-synonyme SNP er ikke blevet identificeret i cancer eller CFC syndrom og blev bestemt til at blive tolereret af SIFT, så måske B-Raf p.Q210H repræsenterer en sjælden polymorfi.

Kun to af de ovarian cancer cellelinjer havde mutationer i typisk påvirket exon 11/15 regioner i B-Raf-protein kinase domæne. Dette fund rejser muligheden for, at kræft-associerede

BRAF

mutationer uden for exon 11/15 kan være mere udbredt end forventet. Da langt størstedelen af ​​

BRAF

mutation undersøgelse undersøgelser offentliggjort er begrænset til exon 11 og 15, andre mulige mutationer uden for disse regioner kan blive overset.

At udforske den funktionelle betydning af disse roman B- Raf mutanter, blev alle dem, der i denne undersøgelse analyseret af SIFT (https://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html), en online mutation analyse program, der forudsiger den funktionelle konsekvens af ikke-synonyme aminosyresubstitutioner [33], [34]. Alle

BRAF

mutationer identificeret blev forudsagt at have ændret protein-funktion, bortset fra p.Q201H. Den funktionelle betydning af

BRAF

kodning mutationer i andre end 11 og 15 exons understøttes af biokemiske undersøgelser af nye germlinie mutationer identificeret i CFC. Ligesom somatiske mutationer, de fleste CFC germline mutationer giver en øget kinase aktivitet, mens nogle er kinase forringet. Men alle CFC mutationer, der er blevet biokemisk karakteriseret alter proteinfunktion til en vis grad ([18], [26] Rauen, upublicerede data).

B-Raf har kun to kendte nedstrømseffektorer, MEK1 og MEK2 . I et forsøg på at karakterisere mutationen spektret af MAPK vejen i kræft i æggestokkene, vi også sekventeret

MEK1 /2

og identificeret en roman MEK1 heterozygot missense substitution, p.D67N i ES-2, som resulterede fra en nt 199 G → A overgang. Dette er den første identificeret funktionelle MEK mutation forbundet med kræft og ikke repræsenterer en sjælden polymorfi i, at denne mutation blev ikke identificeret i 40 normale kontroller (80 alleler) eller i 52 CFC individer (104 alleler) vi har sekventeret til dato ([18 ] Rauen, upubliceret data). Interessant, selvom vi ikke havde identificeret denne MEK1 p.D67N mutant i vores CFC kohorte, denne samme MEK1 mutation er for nylig blevet rapporteret som en kimlinie mutation i CFC syndrom [29]. Foruden en

MEK1

mutation, ES-2 havde også en B-Raf p.V600E missense substitution. Disse to mutationer kan have været samarbejder tumorigene begivenheder. Hvad gør denne konstatering særligt interessant er det faktum, at tidligere sekventering undersøgelser af MEK1 /2-proteinkinase-domæne ikke har identificeret nogen mutationer i gliomer, testikulære kimcelletumorer, brystcancer og lungecancer [35] – [38]. Især den p.D67N i ES-2 falder uden for proteinkinasen domæne, som spænder fra AA 68-271 (www.ensembl.org/Homo_sapiens). Mange kimcellelinje CFC mutationer placeret 5 ‘af proteinet kinasedomænet ([18], [29], [39]; Rauen, upublicerede data). Funktionelle studier af disse hidtil ukendte CFC-mutanter har vist forøget aktivitet

in vitro

løbet vildtype MEK i stimulering ERK-phosphorylering, men disse CFC-mutanter er ikke så aktive som en kunstigt frembragt konstitutivt aktiv MEK-mutant ([18]; Rauen, upublicerede data). Andre undersøgelser har vist, at ændring af N-terminalen af ​​MEK øger den basale kinaseaktivitet implicerer en vigtig regulerende rolle sammen med substrat anerkendelse [40] -. [42]

For at vurdere den funktionelle konsekvens af MEK1 s. D67N, var dette aminosyresubstitution analyseret ved SIFT og viste sig at være funktionelt påvirket. At bekræfte denne information blev MEK1 p.D67N transient transficeret ind i HEK 293T-celler, og ERK-phosphorylering blev målt ved Western blot-analyse. Den MEK1 p.D67N mutant aktiverer som påvist ved øget ERK fosforylering i forhold til tomme vektor og vildtype MEK1, to kontroller, som ikke aktiverer ERK. Men niveauet af ERK phosphorylering for p.D67N er mindre end den positive kontrol CFC MEK1 p.Y130C mutant [18].

Ud over

BRAF

MEK1

mutationer, blev flere synonym database SNP også identificeret. B-Raf p.G634G (rs9648696) blev identificeret i 40% af de 15 cellelinier, MEK2 p.I220I (rs10250) var til stede i 73% og MEK2 p.D151D (rs17851657) blev identificeret i 33% af cellelinierne. Disse synonyme database SNPs var til stede ved en frekvens, der er sammenlignelig med tidligere rapporteret (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp; [43]). Der var en entydigt identificeret

MEK1

SNP i OVCAR 10 som følge af en nt 348 heterozygot G → En overgang i exon 3, p.Q113Q. Alle synonyme SNP’er var præget af SIFT og fast besluttet på at blive tolereret.

Vores resultater understreger, at mutationer, som ændrer funktion af MAPK pathway spille en vigtig rolle i ovariecancer [15]. Derudover vil identifikationen af ​​mutationer i vigtige MAPK-vejen komponenter være vigtige ved bestemmelse af reaktionsevne af canceren til terapeutiske midler, den aggressive og metastatisk adfærd af tumoren og patientens prognose. Fire af 15 (26%) cellelinjer i denne undersøgelse havde

BRAF

mutationer og en af ​​15 (7%) havde en MEK mutation. Det vides, at

BRAF

mutationer er blevet identificeret i visse typer af kræft i æggestokkene; dog mutationer i de nedstrøms effektorer af B-Raf herunder

MEK1

MEK2

kan også være vigtige bidragydere af kræft i æggestokkene tumorigenese. Definition af pathogenetics af ovariecancer kan muliggøre anvendelsen af ​​målrettede lægemidler, såsom små molekyler inhibitorer af MAPK-vejen, som for nylig er begyndt at demonstrere stor løfte [16]. Derudover en rapport indikerer, at celler med aktiverede B-Raf have forbedret, selektiv følsomhed til MEK-inhibitorer [44]. Vores resultater understreger betydningen af, at yderligere karakterisering af følsomhed af forskellige BRAF og MEK mutanter til lille molekyle hæmning er en vigtig vej til at fortsætte i retning af udvikling af effektive behandlinger for kræft i æggestokkene.

Metoder

cellelinjer og Isolering af Genomisk DNA

Femten æggestokkene kræft cellelinjer, der almindeligvis anvendes til

in vitro

eksperimenter blev screenet for mutationer: OVCAR 3, SKOV 3, TOV-112d, A2780, OV90 , ES-2, TOV-21g, Caov-3, A1847, IGROV 1, OVCAR 5, 2008, OVCAR 10, PEO1 og Hey. Cellepellets fra hver af disse cellelinjer blev venligst leveret af Drs. Charles Drescher og Beatrice Knudsen. Genomisk DNA blev isoleret fra cellepellets ved anvendelse af QIAamp DNA Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Fyrre raske kontroller blev indbefattet i denne undersøgelse. Genomisk DNA blev isoleret fra perifere blodlymfocytter under anvendelse af QIAamp DNA Blood Midi-kittet (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Kontrolprøver blev opnået under en godkendt institution review board fra University of California San Francisco.

PCR og Tovejs Sequencing

PCR primere blev designet til at forstærke alle kodende exons og intron flankerende regioner i

BRAF

(NM_004333.2),

MEK1

(NM_002755.2) og

MEK2

(NM_030662.2) (tabel 4 og tabel 5). Til sekventering blev PCR-primere modificeres på 5′-enden til at omfatte M13 fremad (GTAAAACGACGGCCAGT) og revers (CAGGAAACAGCTATGACC) sekvenser. PCR og sekventering blev udført ved Agencourt Bioscience Corporation (Beverly, MA). Tovejs-sekventering blev udført med ABI BigDye v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) ifølge producentens retningslinier og kørt på en ABI3730xl kapillær sekventering instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Analyse

Sekventering data blev analyseret ved hjælp af to sekvens analyse programmer, PolyPhred Software v5.02 (University of Washington, Seattle, WA) og SeqScape® Software (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Desuden blev manuel gennemgang udført med Mutation Surveyor 3,00 (SoftGenetics LLC, State College, PA). Yderligere evaluering af fundne nukleotid mutationer bestod af Sortering Intolerant Fra Tolerant (finkæmme, blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html) og screening mod kendte databaser: NCBI, Kosmiske, UniProtKB /Swiss-Prot og JSNP (www.ncbi.nlm .nih.gov /SNP, www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/, ca.expasy.org/sprot/, snp.ims.u-tokyo.ac.jp/).

Plasmider

Menneskelig

MEK1

cDNA (Origene, Rockville, MD) blev klonet ind i en pcDNA3 vektor med et Myc-tag ved N-terminus.

MEK1

nt 199 G → En overgang blev indført ved hjælp af Quick-Change mutagenese (Stratagene, La Jolla, CA) og verificeret ved direkte sekventering.

Forbigående transfektioner og Western blot-analyse

Humane embryoniske nyre (HEK) 293T-celler blev podet dagen før i seks brønde og transficeret i to eksemplarer, med 2 ug totalt plasmid-DNA og 5 pi Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Celler blev serum-udsultet (0,5% føtalt bovint serum) og 24 timer senere lyseret i buffer indeholdende protease og phosphataseinhibitor cocktails (Sigma, St. Louis, MO). Ekspressionsniveauer af myc-MEK blev total ERK og phosphoryleret ERK analyseret ved Western-blot. Myc (A-14) og p-ERK (E-4) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), og p44 /42 MAP kinase-antistof blev købt hos Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

anerkendelser

forfatterne takker Kanariske Foundation (www.canaryfoundation.org) for finansiel og videnskabelig støtte og Drs. Ingrid Revet og William Tidyman for tankevækkende kommentarer og teknisk bistand.