PLoS ONE: rolle microRNA-30c Målretning ADAM19 i kolorektal Cancer

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) er dereguleret i en række kræftformer, herunder tyktarmskræft. MIR-30c tilhører MIR-30 familien, og er involveret i en række ondartede sygdomme. I denne undersøgelse påvist vi ekspressionen af ​​MIR-30C i colon cancer-cellelinjer og kliniske coloncancer prøver. MIR-30c viste sig at være dramatisk nedreguleret både i cellelinier og cancervæv. Derudover kunne MIR-30c inhibere cancercellevækst, migration og invasion in vitro. Konsekvent, stabil overekspression af miR-30c hæmmede væksten og lunge metastase for tyktarmskræft celle xenografter in vivo. Desuden bioinformatik algoritme og luciferase reporter assay angivet ADAM19 som et direkte mål for miR-30C. Af interesse, yderligere eksperimenter viste, at inhibering af ADAM19 af MIR-30c delvist medieret anti-tumor effekt af MIR-30C. Samlet set vores undersøgelse giver den ny indsigt, at miR-30c hæmmede tyktarmskræft celler via målrettet ADAM19. Således kan MIR-30c tjener som et lovende terapeutisk strategi til tyktarmskræft behandling

Henvisning:. Zhang Q, Yu L, Qin D, Huang R, Jiang X, Zou C, et al. (2015) rolle microRNA-30c Målretning ADAM19 i kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (3): e0120698. doi: 10,1371 /journal.pone.0120698

Academic Redaktør: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, TYSKLAND

Modtaget: 11. november 2014 Accepteret: 26 januar 2015; Udgivet: 23 marts 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er højt konserveret, 22 nukleotider lange ikke-kodende RNA. MiRNA kan regulere genekspression post-transkriptionelt ved at interagere med komplementære sekvenser (normalt placeret i 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af nukleotid) af messenger-RNA (mRNA) mål. Disse interaktioner kan føre til proteinet translation inhibering eller target mRNA’er nedbrydning afhængig af om miRNA og deres mål er perfekt komplementære [1]. MiRNA er dysreguleret i en række forskellige cancere og miRNA spiller en vigtig rolle i tumorigenese [2,3,4,5]. En række miRNA har vist sig at virke som tumorsuppressorer [2,6,7,8]. I de senere år har miRNA blevet anerkendt som kritiske regulatorer i udvikling og progression af cancer, herunder kolorektal cancer (CRC) [9,10,11,12].

CRC er den tredje mest almindelige kræftform hos mænd og kvinder , med en anslået 142820 nye tilfælde og 50830 dødsfald i USA i 2013 [13]. Selv om der er gjort betydelige fremskridt i de seneste årtier, herunder kirurgisk behandling, strålebehandling og kemoterapi, har overlevelsesraten for CRC patienter ændret sig lidt. Det er af afgørende betydning for at søge tidlig påvisningsmetode på grund af øget metastase og dødelighed af avancerede high-grade CRC.

MIR-30c er medlem af MIR-30 familien. Fem forskellige modne miRNA sekvenser er inkluderet i denne familie: MIR-30a /MIR-30c-2, MIR-30d /MIR-30b og MIR-30e /MIR-30c-1 [14]. Akkumulerende vidnesbyrd viser, at deregulering af MIR-30C bidrager til forskellige maligne tumorer, herunder brystcancer, endometriecancer, lungecancer, levercancer [8,15,16,17]. MIR-30 undertrykker de tumorform processer i disse ovennævnte kræftformer ved direkte at interagere med deres tilsvarende mål. Alligevel er der relativt få tilgængelige undersøgelser rapportering konsekvenserne af miR-30c i udviklingen af ​​tyktarmskræft.

I vores undersøgelse, vi bestemt den potentielle effekt af miR-30C på tyktarmskræft progression. Vores data viste, at miR-30c har lavere udtryk niveau i humane coloncancer prøver. Hvad mere er, vi undersøgte mekanismerne bag rolle miR-30c i udvikling tyktarmskræft. Resultaterne viste, at MIR-30c spiller en afgørende rolle i en overflod af biologiske processer via regulering ADAM19 i human coloncancer. Derfor re-udtrykkende miR-30c og ​​/eller forstyrre ADAM19 funktion kunne være en lovende tyktarmskræft terapeutisk strategi.

Materialer og metoder

Kliniske prøver

Sixty tyktarmskræft prøver og deres tilstødende normale væv blev indsamlet fra patienter tyktarmskræft i andet Tilknyttede Hospital i Harbin Medical University (Harbin, Kina) under operationen og straks opbevaret i flydende nitrogen indtil brug. Ingen patienter var blevet behandlet med strålebehandling eller kemoterapi før kirurgi. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for 2

nd Tilknyttede Hospital i Ha’erbin Medical University. Alle kliniske undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Den skriftlige informerede samtykke blev opnået fra hver patient og godkendt af den lokale etiske komité.

Cell kultur

HCT116 og SW620 menneskelige kolon cancer cellelinjer var gaver fra Pro. LQ [18] og blev dyrket i RPMI1640 eller L15-medium (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA) og HEK293T celler blev dyrket i DMEM-medium. Alle medium blev suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin G og 100 pg /ml streptomycin (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY, USA). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO2.

Vektorer konstruktion, oligonukleotidsyntese og transfektion

HSA-MIR-30c mimic, MIR-30c inhibitor, mimic negativ kontrol (NC efterligne), hæmmer negativ kontrol (NC-inhibitor) sekvenser og den menneskelige ADAM19 siRNA var fra Gene Pharma Company (Shanghai, Kina). Lipofectamine 2000 Transfektion Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) blev anvendt til transfektion af celler. ADAM19 cDNA uden dens 3′-UTR (2757 bp) blev indsat i pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for at bygge plasmidet pcDNA3.1 (+) – ADAM19. En 513-bp segment indeholdende præ-MIR-30c blev ligeret til pcDNA3.1 (+) vektor til at konstruere stabile MIR-30c overekspression celler. Tabel 1 angivet alle relaterede DNA-sekvenser.

Stabil transfektion af miR-30c

2 × 10

5 HCT116 celler blev dyrket i en 60 mm plade indtil sammenløbet nået 60-70% i RPMI1640 medium. PcDNA3.1 (+) – pre-MIR-30c plasmid blev derefter transficeret ind i celler med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stabile cellelinjer blev screenet med 1 mg /ml G418 (Sigma, Shanghai, Kina), og positive kloner blev identificeret under anvendelse QRT-PCR.

Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR)

kvantitativ real-time RT-PCR blev udført som tidligere [18] beskrevne. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol reagenser (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Bagefter RNA blev revers transkriberet, efterfølgende QRT-PCR blev udført under anvendelse af en 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Mannheim, Tyskland) som følger: 94 ° C i 3 minutter og derefter 40 cykler ved 94 ° C i 30 sek, 60 ° C for 30s, 72 ° C i 30 sek og et trin på 82 ° C i 5 sek. Fluorescens blev detekteret ved afslutningen af ​​hver cyklus.

Celleproliferation og kolonidannelse assayet

3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid ( MTT) assay blev vedtaget for at vurdere cellernes levedygtighed som tidligere [18] beskrevet. At evaluere kolonidannelse evne, blev HCT116 eller SW620 celler podet i 3,5-cm plader (1000 celler /skål). Kolonierne blev fikseret i methanol, farvet med 0,1% krystalviolet (Sigma, St. Louis, MO, USA) og talt efter 2 uger.

Migration og invasion assay

For at bestemme migration evne af celler in vitro blev Transwell assay vedtaget som tidligere [18] beskrevet. For at detektere invasionen cellernes evne blev membranen af ​​Transwell enhed belagt med 40 pi matrigel (BD Biosciences, SanJose, CA, USA) ved 37 ° C i 4 timer til at udvikle en rekonstrueret basalmembran. Cellerne blev behandlet på samme måde som migration assay. Sårheling assay blev også vedtaget at undersøge cellemigration evne. Celler blev podet i 3,5-cm plader til en densitet på 70-80%. Bagefter blev cellerne ridset af 200 pi pipettespidser til at konstruere et kunstigt sår. Den vandrende afstand blev målt efter 24-72h

Western blot-analyse

I alt celle- eller vævsekstrakter blev udvundet i celle lysis buffer efterfulgt af immunblotting med anti-ADAM19 (1:. 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), og anti-β-actin (1:. 2000 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) som tidligere beskrevet [12]

Luciferase reporter assay

Sådan konstruere pMIR-ADAM19-3’UTR plasmid, som indeholdt den potentielle bindingssteder i ADAM19 3′-UTR nedstrøms for ildflue-luciferase-genet, blev et 282 bp-sekvens amplificeret og indsat i Spel og HindIII-stederne i pMIR-RAPPORT luciferase vektor (Ambion, Austin, TX, USA). Plasmidet med miR-30c målsted slettet fra ADAM19 3′-UTR blev også konstrueret. HEK293 og HCT116-celler blev anvendt til at måle luciferaseaktivitet. Når voksede til 60-70% konfluens, cellerne blev co-transficeret med 100 ng Luciferase plasmid og 50 ng Renilla plasmid (Ambion, Austin, TX, USA) sammen med 650 ng MIR-30c efterligner eller NC som beskrevet ovenfor. Efter inkubation i 48 timer ved 37 ° C blev luciferaseaktivitet detekteret med Dual Luciferase Reporter 1000 Assay System (Promega, Madison, WI, USA).

In vivo tumor vækstassays

Kvinde athymiske BALB /c nu /nu mus (i alderen 4 uger) blev købt fra Shanghai Laboratory Animal center (Shanghai, Kina). Alle procedurer dyr var i overensstemmelse med Harbin Medical University Institutional Animal Care og brug Udvalg retningslinjer. Den 2. Tilknyttede Hospital i Harbin Medical University Animal Care og brug Udvalg godkendte denne forskning. Dyrene blev huset som tidligere [12] beskrevne. 5 × 10

6 HCT116 celler, som var stabilt transficeret med MIR-30c blev injiceret subkutant i højre flanke hos nøgne mus. Tumorstørrelse blev målt ved skydelære hver 4. dag. Både maksimum (L) og minimum (W) længde af tumoren blev målt og tumorstørrelsen blev beregnet som ½LW

2. Efter 30 dage blev musene aflivet og fotograferet. Tumorer blev høstet og vejet. Derudover blev 2 × 10

6 celler injiceret i halevenerne af nøgne mus. Efter 18 dage blev lungerne fjernet og skyllet, og de pulmonære metastatiske kolonier blev talt ved visuel inspektion. Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Tre dyr blev inkluderet i hver gruppe.

Statistisk analyse

Den software SPSS V20.0 blev brugt til statistisk analyse. Alle værdier er udtrykt som middelværdi ± SEM og alle data er blevet gentaget mindst tre gange. Students t-test blev anvendt til at bestemme den statistiske signifikans af forskelle mellem grupperne. Spearmans korrelation blev anvendt til at identificere sammenhængen mellem MIR-30C ekspression og ADAM19 ekspression. Forskelle med

s

. 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

MIR-30c blev nedreguleret i tyktarmskræft væv

For at bestemme udtrykket af miR-30c i kliniske væv, vi indsamlet 60 par humane coloncancer prøver og deres tilstødende, ikke-tumorform slimhinde væv. Som angivet af resultaterne af QRT-PCR-analyse, MIR-30c ekspressionsniveauet var naturligvis nedreguleret i 54 ud af 60 tumorprøver forhold til de tilstødende normale mucosa væv (fig. 1). Associationen mellem MIR-30c og ​​klinisk-patologisk funktion blev analyseret (tabel 2). Disse data indikerer, at MIR-30C er faldet i tyktarmskræft, og det kan korreleres med human coloncancer progression.

MIR-30c ekspression blev undersøgt ved QRT-PCR i 60 par af humane coloncancer væv. 54 ud af 60 tumorprøver viste reduceret ekspression af MIR-30C i forhold til de tilstødende normale slimhinde væv. MIR-30c-ekspression normaliseret til den for U6 i hver prøve.

MIR-30c hæmmede celledeling in vitro

QRT-PCR blev anvendt til at detektere relative udtryk niveau af mIR-30C i forskellige colon cancer cellelinjer og Lovo blev anvendt som kontrolgruppe. Som vist i fig. 2A, HCT116 havde en relativ lavere MIR-30c ekspressionsniveauet blandt disse fem cellelinier. Derfor har vi forbigående transficerede MIR-30c efterligner i HCT116-celler og MIR-30c inhibitor i LoVo-celler og MIR-30c ekspression blev valideret af QRT-PCR (fig. 2B). Disse celler blev efterfølgende udsat for MTT-assayet. Som forventet, MIR-30c inhibitor fremmes mens MIR-30c mimic undertrykte proliferationen af ​​celler (fig. 2C, 2D). For at grundigt undersøge fænotype, blev kolonidannelse assay vedtaget. Konsekvent, miR-30c overekspression undertrykt koloni dannelsen af ​​tyktarmskræft celler (fig. 2E, 2F).

(A) relative ekspressionsniveauer af miR-30c i fem tyktarmskræft cellelinjer blev påvist med den kvantitative real -tid PCR (QRT-PCR). Kolonner, gennemsnit på tre uafhængige forsøg; barer, S.E. (B) HCT116 eller LoVo-celler blev transient transficeret med MIR-30c efterligner eller NC efterligning og inhibitor eller NC-inhibitor henholdsvis. Ekspressionen af ​​MIR-30C blev bestemt ved QRT-PCR efter 24 timer. (C-D) Virkninger af miR-30c på spredning blev undersøgt af MTT-analysen. Points er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg; søjler repræsenterer S.E .; *

s

0,05; **

s

0,01. (E) Virkninger af miR-30c om spredning af HCT116 celler blev undersøgt ved kolonidannelse assay. (F) Antallet af kloner blev analyseret kvantitativt. *

s

0,05; **

s

. 0,01

MIR-30c hæmmede celle migration og invasion evne kolon kræftceller

For at forstå konsekvenserne af miR-30C på cellemigration og invasion, Transwell migration og invasion og sårheling blev udført. Resultaterne indikerede, at overekspression af MIR-30C naturligvis inhiberet mens nedregulering af MIR-30C fremmes migration og invasion evner af colon cancerceller (fig. 3A-3D). Desuden sårheling assay blev anvendt til at studere indflydelsen af ​​MIR-30c på migration af SW620-celler (fig. 3E, 3F). Resultaterne viste, at MIR-30c kunne inhibere vandringshastighed af colon cancerceller. Tilsammen miR-30c var sandsynligt, at spille en vigtig rolle i celle migration og invasion.

(A-B) Virkninger af miR-30c om migration blev analyseret ved Transwell migration assay. A, repræsentative billeder; B, kvantitativ analyse. (C-D) Virkninger af MIR-30c på invasion blev analyseret ved Transwell invasion assay. C, repræsentative billeder; D, kvantitativ analyse. (E-F) F, blev Sårheling assay vedtaget for at vurdere effekten af ​​miR-30c om migration. Den kunstige kløft var gennem midteraksen, når cellerne nåede en densitet på 80%. Billeder af celler blev taget ved 0 og 24 timer. E, repræsentative billeder; F, kvantitativ analyse. *

s

0,05; **

s

. 0,01

ADAM19 var et direkte mål for miR-30c

Bioinformatik strategier blev brugt til at søge de potentielle mål for miR-30c at medieret mIR-30c vækst og metastase inhibering. Alle de fire bioinformatik algoritmer, miRBase, Targetscan, PicTar, og Miranda blev anvendt, og derefter MIR-Ontologi Database blev anvendt. Endelig ADAM19 blev identificeret som en cancer-associerede gen. ADAM19 3′-UTR besad en perfekt komplementær region i position 3539-3546nt for MIR-30c. Desuden viste Targetscan at bindingsstederne af MIR-30c evolutionært er konserveret i forskellige vertebrale arter (fig. 4A). Endvidere er både Western blot og QRT-PCR foreslog en nedregulering af ADAM19 i HCT116-celler efter transfektion med MIR-30c mimic (fig. 4B, 4C). Yderligere forsøg viste, at ekspressionsniveauerne af MIR-30c og ​​ADAM19 omvendt korreleret i flere coloncancer-cellelinjer og kliniske tumorprøver bestemt ved QRT-PCR (fig. 4D, 4E). Consitently, ADAM19 blev opreguleret i tumorvæv detekteres ved Western blot (Fig. 4G). Disse data viste, at ADAM19 vil kunne blive ramt af miR-30c både transkriptionelt og post-transkriptionelt. For at forklare den detaljerede mekanisme, blev luciferase reporter assay udføres. Som vist i fig. 4E, forbigående co-transfektion af MIR-30C efterligner og pmiRGLO-wt 3′-UTR vektor (der indeholdt MIR-30C målsted) ind HEK293T celler med medført en markant reduktion i reporteraktivitet. Imidlertid blev reduktionen afskaffet når miR-30c efterligne og en konstruktion, hvor målområdet blev slettet fra ADAM19 3′-UTR-reporter blev transficeret ind HEK293T celler (Fig. 4F). Tilsammen viste disse resultater, at miR-30c hæmmede ADAM19 udtryk ved direkte rettet mod ADAM19 3′-UTR

(A) Den forudsagte målrettet site med miR-30c af ADAM19 3′-UTR.; MIR-30c targeting sekvenser af ADAM19 3′-UTR er evolutionært bevaret gennem otte arter (HSA: menneske; Ptr: chimpanse; Mml: rhesus; Oga: bushbabay; TBE: treeshrew; MMU: mus; RNO: rotte, og OCU: kanin .). De målretning steder er fremhævet med rødt. (B-C) QRT-PCR og western blot-analyse blev anvendt til at detektere mRNA og protein ekspression af ADAM19 i HCT116-celler efter transfektion af MIR-30C efterligner eller NC mimic. (D) ADAM19 mRNA og MIR-30c ekspressionsniveauet blev bestemt i fem colon cancer cellelinjer ved QRT-PCR. (E) ADAM19 mRNA og miR-30c niveauer blev omvendt korreleret i tyktarmskræft væv, som bestemt ved QRT-PCR. β-actin og U6 blev anvendt som endogene kontroller, henholdsvis. (F) HEK293T celler blev co-transficeret med vildtype eller mutante reportere og MIR-30C efterligner eller negativ kontrol (NC mimic). Efter 48 timer blev Luciferase /Renilla aktivitet målt. (G) ADAM19 blev opreguleret i colon cancer væv sammenlignet med normalt væv, som indikeret ved Western blotting.

ADAM19 medieret tumor undertrykkende virkning af MIR-30C

Baseret på disse ovennævnte beviser , gjorde vi den hypotese, at ADAM19 tilskrives den anti-tumorform effekt af miR-30C. For at bevise dette uprøvede hypotese konstruerede vi en vektor under anvendelse af en cDNA, der ikke indeholdt 3′-UTR af ADAM19, bagefter vektoren og MIR-30c mimic /NC mimic blev cotransficeret ind i HCT116-celler. MIR-30c og ​​ADAM19 ekspression blev undersøgt med QRT-PCR og Western blot (fig. 5A, 5B). Transwell migration og invasion analyser viste, at restaurering af ADAM19 var i stand til at afskaffe miR-30c induceret migration og invasion hæmning (fig. 5C, 5D). Af interesse, Transwell assays indikerede, at knockdown af ADAM19 af siRNA kunne undertrykke migration og invasion af celler, som var magen til virkningen af ​​MIR-30c overekspression (fig. 5E, 5G og 5H). Derudover har vi bestemt effekten af ​​miR-30C og ADAM19 på EMT-processen. De QRT-PCR-resultater demonstrateed at E-cadherin blev opreguleret mens N-cadherin og vimentin blev hæmmet ved overekspression af miR-30c eller dæmpning af ADAM19 (fig. 5F), derfor miR-30c og ​​ADAM19 kan være involveret i reguleringen af ​​EMT behandle. Samlet set ADAM19 kan være en funktionel mål for miR-30c.

(AB) Udtrykket af miR-30C og ADAM19 blev undersøgt ved QRT-PCR (A) og western blot analyse (B), henholdsvis HCT116 celler, som var co-transficeret med mIR-30c mimic (eller NC mimic) og ADAM19 (eller pcDNA3.1 (+)). p-actin blev anvendt som den endogene kontrol. (C-D) Cellerne blev underkastet Transwell migration og invasion-assays. C, repræsentative Transwell billeder; D, kvantitativ analyse. (E) HCT116-celler blev transficeret med ADAM19 siADAM19 eller siRNA negativ kontrol (sinc). Efter 48 timer blev ADAM19 ekspression detekteret med western blot. (F) E-cadherin, N-cadherin og vimentin blev detekteret ved QRT-PCR efter transficeret med siADAM19 /sinc og MIR-30c mimic /NC mimic. Søjlerne repræsenterede den relative ekspression til sinc og NC efterligne grupper hhv. (G-H) Efter transficeret med siRNA eller sinc, HCT116 celler blev underkastet Transwell migration og invasion-assays. G, repræsentative Transwell billeder; H, kvantitativ analyse. *

s

0,05; **

s

. 0,01

MIR-30c hæmmet vækst tumor og metastase in vivo

For at analysere funktionen af ​​miR-30c in vivo, den nøgne mus xenograft model blev anvendt. Vi først konstrueret MIR-30c stabilt overudtrykkende celler under anvendelse HCT116 cellelinie (fig. 6A). Da det havde den højeste miR-30c udtryk, blev # 4 klon valgt i de følgende forsøg. Cellerne blev subkutant injiceret i flanken af ​​nøgne mus og tumorstørrelser blev overvåget hver fjerde dag. Mus blev aflivet, og subkutane tumorer blev vejet efter fire uger. Resultaterne viste, at MIR-30c ført til en markant nedgang i tumorstørrelse og vægt sammenlignet med mock-gruppen (fig. 6B-6D). Som vist i fig. 6E, MIR-30c faldt vækstraten af ​​tumorer in vivo. Derudover er ekspressionen af ​​MIR-30C i miRNA behandlede gruppe var højere end i mock gruppe (fig. 6F). Hvad mere er, viste in vivo tumormetastaser assay at miR-30c kunne hæmme lunge metastase (fig. 6G, 6H). Overordnede data foreslog antitumorvirkningen af ​​MIR-30c in vivo.

(A) Den stabile overekspression af MIR-30C i HCT116 cellekloner blev bestemt med QRT-PCR. (B) 5 × 10

6 HCT116 celler, som var stabilt transficeret med MIR-30C eller tom vektor (mock) blev subkutant injiceret i nøgne mus (n = 3). Mus blev aflivet 28 dage efter injektion. (C) Tumorer blev høstet og repræsentative tumorer blev vist. (D) Tumorer blev vejet og miR-30C overekspression gruppe havde en lavere vægt sammenlignet med mock gruppe. (E) MIR-30c overekspression resulterede i inhibering af væksten. (F) Ekspressionen af ​​MIR-30C blev påvist med QRT-PCR i tumorer. (G-H) Hematoxylin og eosin-farvning af sektioner af lunge og statistiske resultater af metastase knudepunkter. **

s

. 0,01

Diskussion

miRNA er dereguleret i forskellige typer af kræft og således fungere som tumor-undertrykkere eller oncogen ved interaktion med deres tilsvarende mål. Imidlertid er relativt begrænsede oplysninger ligger til grund for detaljeret mekanisme miRNA involvering i kræft kendt. MIR-30c er blevet undersøgt i en række cancere. Den er nedreguleret meste af indberettede undersøgelser såsom i ikke-småcellet lungekræft, prostatakræft, leukæmi, endometriecancer, brystkræft og tarmkræft [8,19,20,21,22]. Imidlertid har flere undersøgelser rapporteret opreguleringen af ​​MIR-30C i brystcancer, renalcellecarcinom [23,24]. MIR-30c udøver sin funktion ved at inddrage i tumor progression, forudsige prognose eller kemoterapi effekt hos disse kræftformer. Af interesse, findes nogle kontroversielle beviser med hensyn til funktionen af ​​miR-30C. Dette belyser komplicerede rolle miR-30C i tumorudvikling og progression, på trods af sin anti-tumor eller onkogen natur. I vores undersøgelse præsenterer vi, at MIR-30c omvendt kunne regulere tyktarmskræft progression ved at undertrykke celleproliferation, migration og invasion. Desuden er miR-30c faldet både i kliniske prøver og cellelinjer sammen med up-regulerede niveauer af ADAM19. ADAM19 er en direkte funktionel mål for miR-30c identificeret ved luciferaseassays og in vitro eksperimenter. Alle vores data tyder på, at miR-30c spiller en vigtig rolle i tyktarmskræft.

For at identificere potentielle mål for miR-30c, fire bioinformatik algoritmer blev anvendt. Efter en primær screening, er ADAM19 identificeret som mål for miR-30C, fordi det er tæt forbundet med tumorform proces. ADAM er en matrixmetalloproteinase-relateret protein familie, som hører til zink protease superfamilien. Den ADAM familie kunne binde med integrinreceptor og fungere som metalloprotease. De er også præsenteret for en cytoplasmatisk domæne [25]. Adams (disintegrin metalloproteaser) familie er involveret i et væld af aktiviteter, herunder membran fusion, vækstfaktor cytokin og udgydelse, celle migration, sammen med muskel udvikling, befrugtning, og celle skæbne beslutsomhed [26]. ADAM’er kan forringe ECM molekyler og fremme cancermetastase grundet deres proteinaseaktivitet, der svarer til MMP’er. Der er mere end tyve medlemmer af ADAM familie. ADAM19 er et vigtigt medlem af ADAM familien. Forskellige undersøgelser har vist, at ADAM19 er involveret i mange typer af sygdomme. Det forlyder, at muligheden for, at mutationer i ADAM19 kan bidrage til menneskers medfødt hjerteklap og septumdefekter [27]. Nogle Undersøgelser fra Kina viste, at ADAM19 kan have virkninger på testis udvikling og kronisk obstruktiv lungesygdom. herunder cancer. Hvad mere er, nogle data tyder på, at ADAM19 kan være involveret i de centrale processer kirtel sekretion, trofoblast invasion og nedbrydning af ekstracellulær matrix i den tidlige graviditet [28]. Desuden blev ADAM19 fundet at være opreguleret i renalcellecarcinom og primære hjernetumorer og fremmet invasiv af tumorerne [29,30]. Der er relativt små undersøgelser af miRNA rettet ADAM’er trods at en nylig undersøgelse viste transformerende vækstfaktor-β-signalering regulerer ADAM udtryk i eksperimentel renal fibrose via miR-29 [31]. Funktionen af ​​ADAM19 stadig uklar. I vores undersøgelse fandt vi, at ADAM19 kunne fremme invasiv af tyktarmskræft celler for første gang

MIR-30c tilhører miR-30 familie, som består af fem medlemmer:. MiR-30a, b, c , d, og e. Interessant, disse fem medlemmer har forskellige funktioner. MIR-30c er blevet vist at fungere som enten onkogen eller tumor-suppressor i forskellige typer af cancer. Konsekvent, MIR-30a virker som en tumorsuppressor betydelige typer af maligne tumorer, herunder lungecancer, brystcancer, mavecancer, thyroidcancer, og leukæmi [6,32,33,34,35]. MIR-30b kunne forbyde apoptose af gliom celler og lungekræft celler [36]. Betragtninger, miR-30b er i stand til at reducere cellevækst i brystkræft og forebygge EMT i leverkræft med interaktion med cyclin E2 (CCNE2) og Snail1 henholdsvis [32,37]. Men MIR-30d sandsynligvis fungere som et onkogen i de fleste undersøgelser [38,39,40,41]. Tilsvarende med miR-30a, kan miR-30e hæmme proliferation i kræft [16], og er også anerkendt som en prognose prædiktor i nasofaryngealt karcinom [42]. Dette fænomen er rimelig, da miRNA udføre i mål-afhængige og vævsspecifik måde. Den miRNA-30 familie deler den samme frø sekvens blev imidlertid ingen dramatiske yderligere effekter genereret efter tvungen udtryk for disse fem medlemmer samtidig (data ikke vist), hvilket tyder på at der er nogen synergistisk effekt af dem. Inhiberingen effekt af MIR-30C på ADAM19 er mest tydeligt blandt alle de fem medlemmer af MIR-30 familien er angivet med QRT-PCR og Luciferase assay. Derfor vi fokuserer på MIR-30c i vores undersøgelse.

Det er velkendt, at en enkelt miRNA kan regulere flere mål og hver mRNA kan også styres af flere miRNA. I vores undersøgelse fandt vi, at miR-30c inducerede en 20% reduktion af ADAM19 udtryk imidlertid migration og invasion steg mere end 20% (fig. 5B VS 5D). Det viste, at nogle andre gen Mål er involveret i forandringer som følge af miR-30c.

Samlet den foreliggende undersøgelse viser for første gang, at miR-30c undertrykker kræft cellevækst, migration og invasion ved direkte målrettet ADAM19 som kunne fremme malignance af tyktarmskræft celler. De nyligt identificerede miR-30c /ADAM19 akse kaste nyt lys på miRNA-baserede reguleringsmekanisme. I betragtning af den afgørende rolle, miR-30c i tyktarmskræft, kan manipulation af miR-30c udgør en potentiel ny terapeutisk mål for behandling af tyktarmskræft.

Tak

Vi takker Mr. Zhao for mus holder .