PLoS ONE: Målretning af topoisomerase I for Prognoser og Therapeutics af Camptothecin-Resistant Kræft i æggestokkene

Abstrakt

DNA-topoisomerase I (TOP1) niveauer af adskillige humane neoplasmer er højere end normalt væv. Top1 inhibitorer er meget udbredt i behandling af konventionel terapi-resistent ovariecancere. Dog kan patienter udvikler resistens over for top1 hæmmere, hæmmer kemoterapi succes. I denne undersøgelse undersøgte vi de mekanismer, der er forbundet med udviklingen af ​​camptothecin (CPT) resistens i ovariecancere og identificeret Evodiamine (EVO), et naturligt produkt med TOP1 inhiberende aktivitet som overvinder modstanden. De korrelationer mellem top1 niveauer, kræft iscenesættelse og samlet overlevelse (OS) blev analyseret. Effekten af ​​EVO på CPT-resistente æggestokkræft blev evalueret

in vitro

in vivo

. TOP1 var forbundet med dårlig prognose i ovariecancer (

s

= 0,024). EVO induceret apoptose, der blev påvist ved anvendelse af flowcytometri og terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick endemærkning (TUNEL) assay. Tumoren størrelse faldt betydeligt i EVO behandlingsgruppen sammenlignet med kontrolgruppen (

s

0,01) i en xenograft musemodel. Virkninger af lægemidler rettet mod TOP1 for prognose og terapi i CPT-resistent kræft i æggestokkene kan forventes. EVO med TOP1 kan udvikles som et antiproliferativt middel til at overvinde CPT resistens i ovariecancere

Henvisning:. Lee Y-C, Lee C-H, Tsai H-P, En H-W, Lee C-M, Wu J-C, et al. (2015) Målretning af topoisomerase I for Prognoser og Therapeutics camptothecin-Resistant kræft i æggestokkene. PLoS ONE 10 (7): e0132579. doi: 10,1371 /journal.pone.0132579

Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, UNITED STATES

Modtaget: Januar 21, 2015; Accepteret: 17 jun 2015; Udgivet: Juli 24, 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Science Council, Taiwan (NSC101-2320-B-038-023), Ministeriet for Sundhed Velfærd (MOHW104-TDU-B-212-113001), og Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital (101TMU-SHH-10)

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene har ingen specifikke tegn eller symptomer, og er normalt diagnosticeres på et fremskredent stadium, hvilket gør den til den mest dødbringende gynækologisk kræft i den vestlige verden [1]. Standard kemoterapi for kræft i æggestokkene er ofte ledsaget af kemoresistens, hvilket er en væsentlig hindring for en vellykket behandling af kræft [2] og en anden linje kemoterapeutiske mulighed skal anbefales. Stokastiske mutationer forårsaget af selektionstryk, sekventielle genetiske ændringer induceret af specialiserede stroma, og stemness af cancerceller blev foreslået at forklare overlevelse kemoresistent celler under kemoterapi [3]. Identificering molekylære biomarkører til forudsigelse lægemiddel følsomhed og modstand er afgørende for patientens prognoser.

TOP1 genkopiantal, mRNA-niveau, proteinniveau, og enzymaktivitet rapporteres at være forbundet med en dårlig prognose i cancerterapi [4 ]. Etablering rolle TOP1 udtryk i kræft i æggestokkene kan fremme udviklingen af ​​mere effektive terapeutiske strategier. Notch vej og DNA-topoisomerase I (Top1) hæmmere er ofte blevet brugt i cisplatin-resistente ovariecancer [5]. Imidlertid kan patienter udvikler TOP1 inhibitor modstand, hvilket hæmmer succes terapi [6]. Anvendelse af kombinationsbehandling i single-agent kemoterapi fører til forbedrede resultater i kræft i æggestokkene [7]. Kemoterapi-induceret bivirkninger afhjælpes efter ved hjælp af naturlige produkter som polyphyllin D [8], emodin [9] eller Rosa Roxburghii Tratt [10], mens antitumoraktivitet og immunmodulerende funktioner overholdes [11].

Aktivering af 5 ‘AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) og efterfølgende undertrykkelse af mTOR aktivitet kan fremkalde beskyttende autofagi som giver kemoresistens til tumorceller [12]. Derfor kan inhibering af AMPK-associeret autofagi forbedre antitumorvirkningerne udøves af kemoterapeutiske midler [4,13]. Den TOP1 inhibitor camptothecin (CPT) kan inducere autofagi og reducere apoptose gennem AMPK-TSC2-mTOR pathway i human colorectal cancer [14]. Desuden er Topotecan rapporteret at inducere cytobeskyttende autofagi i vildtype p53-celler, men ikke i mutant p53 eller p53 knockout-celler [15]. Humane A2780 ovariecancerceller er analyseret for p53-mutationer og klassificeres i et p53 vildtype-cellelinje [16]; Derfor forventes denne cellelinie til nemt udvikle kemoresistens gennem AMPK-medieret autofagi. Denne virkningsmekanisme Human A2780 celle linje giver en potentiel strategi til at screene Top1 inhibitorer med lav-beskyttende autophagy aktivering aktivitet til behandling af kræft med vildtype p53.

Evodiamine (EVO), en quinilone alkaloid, der oprindeligt isoleret fra

Evodia rutaecarpa

(Juss.), er rapporteret at besidde mange fysiologiske funktioner, herunder vasorelaksation, fedme, anticancer, antibakterielle, antivirale og antiinflammatoriske virkninger [17]. Syntetiske EVO derivater er blevet udviklet som potente antitumormidler [18]. Denne undersøgelse karakteriseret de mekanismer, der er forbundet med CPT-resistente æggestokkene cancerceller. Det naturlige produkt EVO viste TOP1 inhiberende aktivitet, der overvandt CPT modstand ovariale A2780 celler. Vores resultater giver indsigt i stigningen i det stof modtagelighed af CPT-resistente ovariecancerceller efter brug EVO-relaterede alkaloider.

Materialer og metoder

Materialer

(

S

) – (+) – CPT (C9911), Evodiamine (E3531), natriumbicarbonat, dimethylsulfoxid (DMSO), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), propium iodid (PI), og Hochest 33342 blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), trypsin, føtalt bovint serum (FBS), L-glutamin, og natriumpyruvat blev erhvervet fra Gibco-BRL (Grand Island, NY, USA). Et antistof mod cyclin D1 blev købt fra Ventana (Tucson, AZ, USA). γ-H2A.X, AMPK, phospho-AMPK, acetyl-CoA carboxylase (ACC), phospho-ACC, og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev indkøbt fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Ki-67 kanin monoklonalt primært antistof blev købt formular DAKO (MIB-5, Danmark). Comet assay kit blev fremskaffet fra Trevigen (Gaithersburg, MD, USA). Generel Layer Medium (GLM) chip kapacitet blev opnået fra Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Lentivirale vektorer (LVS), luciferase (Luc) og grønt fluorescerende protein (GFP) vektorer, og bille luciferin blev opnået fra Promega (Madison, WI, USA). iView Universal DAB Detection Kit blev opnået fra Ventana (Tucson, AZ, USA). In Situ Cell Død Detection kit, POD, blev opnået fra Roche Applied Science (Penzberg, Tyskland)

Etik

Menneskelig Emne Forskning:. Væv vi brugte blev opnået fra Taipei Medical University Hospital og Wan Fang Hospital efter Institutional Review Board godkendelse (WFH-IRB-99.049). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere. Animal Research: Alle mus blev udført i overensstemmelse med retningslinjer og forudgående godkendelse af Institutional Animal Care og brug Udvalg Taipei Medical University. IACUC godkendelse: LAC-99-0302. Dyrene blev aflives humant med isofluran.

Prøver

formalinfikseret paraffinindlejrede kirurgiske prøver blev brugt til immunhistokemisk (IHC) farvning. En histologisk diagnose blev udført ifølge WHO klassificering. Tissue microarrays bestod af 180 æggestokkene overflade epitel carcinomer: 61 serøse carcinomer, 35 mucinøse carcinomer, 42 endometrioide carcinomer, og 42 klar-celle karcinomer. For nærværende undersøgelse, 2 patologer (Chi Lang Chen og Chii-Hong Lee) screenet de histologiske sektioner og udvalgte områder af repræsentative tumorceller. Et væv kerne (1,5 mm i diameter) fra hver prøve blev brugt på afsløring platforme (Ventana Benchmark GX, Tucson, AZ, USA).

Cell kultur

A2780 blev dyrket i DMEM og CPT resistent A2780

R2000 ovariecancerceller [19] blev dyrket i RPMI1640, der indeholdt 10% FBS, 4 mM L-glutamin, 4,5 g /l glucose, 1 mM natriumpyruvat og 1,5 g /l natriumbicarbonat ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2.

Western blot-analyse

Proteinprøver blev løst ved anvendelse af natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og elektrooverført på polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner, som blev inkuberet med et primært antistof ved 4 ° C natten over, og derefter inkuberet med et peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære immunglobulin G (IgG) antistof. Immunoreaktive bånd blev visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens (ECL) reagenser fra PerkinElmer [20].

Cell levedygtighed assay

Cellerne (10

4 celler /brønd) blev dyrket på en 96- brøndsplade suppleret med dyrkningsmedium. Celler blev behandlet eller ubehandlet i 48 timer, og en MTT-stamopløsning (5 mg MTT /ml phosphatbufret saltvand [PBS]) blev tilsat til de voksende kulturer i 2 timer. Absorbansen blev målt ved anvendelse af et spektrofotometer ved 560 nm. En blindprøve kun indeholdende DMSO blev anset læsning kontrol [21].

Flowcytometri

Celler blev behandlet med testforbindelser i 0-24 timer, derefter trypsiniseret, pelleteret og vasket i PBS . Celleprøver blev analyseret under anvendelse af et FACS Canto-II flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Annexin-V og propidiumiodid (PI) dobbelt farvning blev udført ifølge producentens protokol [22].

Cellecyklusanalyse

Celler blev podet ved en densitet på 2 x 10

5 celler /brønd i plader med 6 brønde og synkroniseret ved udpladning i RPMI1640-medium i 24 timer for cellecyklusanalyse. Celler blev inkuberet i 2 ml komplet RPMI1640 med 5 uM EVO og 10 uM CPT i 48 timer. Efter behandling blev cellerne høstet med trypsin og vasket en gang med PBS. Før flowcytometri blev cellerne inkuberet med 10 pg /ml RNase A ved 37 ° C i 15 minutter. Derefter blev cellerne farvet med 5 pg /ml Hochest 33342 og 20 ug /ml PI i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke [23]. Ti tusind celler per prøve blev analyseret ved anvendelse af en BD FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Cellecyklussen blev analyseret under anvendelse MODFIT software.

DNA afslapning assay

Den inhiberende virkning af EVO på supersnoet DNA-streng brud forårsaget af TOP1 blev evalueret. Plasmid-DNA (200 ng) blev inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter i 20 pi reaktionsopløsning (40 mM Tris-acetat, 100 mM NaCl, 2,5 mM MgCl

2, og 0,1 mM EDTA, pH 7,5) i nærvær og fravær af en 0-5 uM inhibitor; 0,5 enheder af TOP1 enzym blev tilsat for at starte reaktionen i 30 minutter [24]. TOP1-induceret DNA-streng brud blev angivet ved omdannelsen af ​​kovalent lukkede cirkulære dobbeltstrenget supercoilet DNA til en afslappet formular.

Comet assay (encellede gelelektroforese)

For at bestemme omfanget af DNA-skader af celler blev comet assays udført ifølge den Trevigen CometAssay kit protokol med små modifikationer. A2780

R2000 celler blev behandlet med top1 hæmmere i 1 time. Den endelige celledensitet var ca. 15.000 celler /ml. Cellesuspensionen blev derefter blandet med lavt smeltepunkt agarose ved 37 ° C og efterfølgende overført til objektglas. Objektglas blev elektroforeret ved stuetemperatur og derefter farvet med SYBR Green I i 5 minutter. På hvert objektglas, blev cellekerner undersøgt under anvendelse af et fluorescensmikroskop. Individuelle hale øjeblikke blev beregnet ved hjælp af billedanalyse software (Comet Assay Software Project, https://www.casp.of.pl/). Tail øjeblikke blev beregnet efter følgende formel: tail øjeblik = tail DNA% (procent af DNA i halen) × hale (længde af halen) [24]. Middelværdien ± standardafvigelse (SE) blev beregnet ud fra mindst 50 celler for hver behandlingsgruppe. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af en 2-halet uparret Students

t

test.

Computerbaseret molekylær docking

røntgen- krystalstruktur af det humane TOP1-DNA-komplekset blev hentet fra Protein data Bank (https://www.rcsb.org/pdb) for docking studier. Efter tilsætning hydrogenatomer, blev det resulterende protein-DNA-kompleks struktur, som anvendes i docking simuleringer. Chem3D 6.0 software (CambridgeSoft, Cambridge, MA, USA) blev anvendt til at bygge 3D-strukturen af ​​EVO. Endvidere blev denne struktur optimeres på basis af energiminimering ved anvendelse af MM2 kraftfelt og en minimal geometriske middelværdi (RMS) gradient af 0,05 Docking simulationer blev udført ved anvendelse af GOLD-programmet (version 3.1) på en Silicon Graphics Octane arbejdsstation med dual 270 MHz MIPS R12000 processorer. GOLD-programmet bruger en genetisk algoritme (GA) for at udføre fleksible ligand-docking simuleringer. Annealing parametre for hydrogenbinding og Van der Waals-interaktioner blev sat til 4,0 og 2,5 Å hhv. Den GoldScore fitness-funktion blev anvendt for at udføre docking udgør ved hjælp EKSTERN ENERGY WT = 1,375 [24].

analyt assay med en overflade (SPR) sensor chip

Human (h) TOP1 blev koblet til den carboxylmethylated dextran overflade af en GLM kapacitet chip ifølge protokollen beskrevet i Bio-Rad ProteOn One-Shot Kinetics Kit Instruktionsmanual med mindre ændringer. Opløsninger af EVO og plasmid-DNA blev fremstillet i en filtreret og afgasset reaktionspuffer. Alle bindingsforsøg blev udført ved 25 ° C i en konstant strømningshastighed på 100 pl /min af TOP1 reaktionsbuffer (40 mM Tris-acetat [pH 7,5], 2,5 mM MgCl

2, 100 mM NaCl og 1 mM EDTA). Bindingsaffiniteten af ​​proteinerne blev vurderet ved anvendelse ligevægtsdissociationskonstanter (Kd). KD blev fastsat på grundlag af en steady state affinitet montering analyse ved hjælp af resultaterne fra ProteOn Manager 2.0 (Bio-Rad) [24].

Produktion af luciferase (Luc) /grøn fluorescerende protein (GFP) A2780

R2000 celler

For

in vivo

undersøgelser, A2780

R2000 celler blev inficeret med LVs indeholder Luc eller GFP, der blev drevet af en cytomegalovirus promotor. Når transplanteret til SCID-mus, Luc- eller GFP-mærkede A2780

kan overvåges R2000 celler under anvendelse

in vivo

bioluminescens billeddannelse, og GFP-positive celler kan isoleres ved anvendelse af en flow sorteringsanlæg. Kort fortalt, A2780

R2000 celler blev dyrket i 6-brønds plader, således at de opnåede 20% -40% konfluens. En specifik titer af medierne høstet fra LV-producerende celler blev sat til de dyrkede celler. Plader blev centrifugeret ved 1200 x

g

i 1 time. Umiddelbart efter centrifugering blev 2 ml af det specifikke cellemedium tilsat til hver brønd, og pladerne blev anbragt i en inkubator. To dage efter spinoculation blev GFP-ekspression undersøgt under et fluorescensmikroskop. GFP-positive celler blev sorteret ved hjælp nontransduced celler som negativ kontrol [25].

Mus modeller af mærket tumorer

A2780

R2000 celler (10

6) blev blandet med 500 pi DMEM og subkutant inokuleret i 4 uger gamle SCID-mus. Efter 7 dage blev musene indgivet intraperitoneale (IP) EVO injektioner (100 mg /kg) (5 mus pr gruppe). Tumoren størrelse blev målt ved hjælp af skydelære hver 3 dage, og bioluminescens af tumorerne blev filmede med en noninvasiv IVIS-200 optisk system (Xenogen, Alameda, CA, USA) og den levende billede Program (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). Mus blev intraperitonealt administreret 300 pi PBS indeholdende 10 mg /ml beetle luciferin (Promega, Madison, WI, USA) før de modtog isofluran-medieret anæstesi. Den kvantitative bioluminescens intensitet (QBI) blev bestemt som den totale fotonflux per sekund [26]. Ved slutningen af ​​forsøget blev musene aflivet, og tumorerne blev udskåret og vejet. Alle mus blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og forudgående godkendelse af Institutional Animal Care og brug Udvalg Taipei Medical University. Alle operation blev udført under isofluran-medieret anæstesi, og blev gjort en indsats for at minimere dyrenes lidelser.

Immunohistocytochemistry

Immunohistocytochemical og terminal deoxynukleotidyltransferase dUTP nick ende mærkning (TUNEL) analyser af æggestokkene cancerceller, høstet i uge 4, blev udført ifølge producentens anvisninger. Formalin-fikserede væv blev indlejret i paraffin, skåret i 4-um-tykke snit og farvet med hematoxylin og eosin (H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Til sammenligning af de to klassificeringsmetoder, studerendes

t

test statistisk analyse blev udført.

Resultater

Overekspression af TOP1 er korreleret med fremskredent stadium og en dårlig prognose i æggestokkene kræft

Vi afgøres, om TOP1 udtryk i kræft i æggestokkene var forbundet med dårlig overlevelse. Væv fra 156 æggestokkene kræftpatienter blev undersøgt ved hjælp af IHC farvning. Kriterierne for antistof specificitet og scoring blev defineret og scorede fra niveauet 0-3 (Fig 1A). Vi undersøgte 30 sæt af matchede prøver fra primær ovarie neoplasme og normale væv. TOP1 ekspression var betydeligt højere i neoplasmer end i normale væv, som vurderet ved anvendelse IHC (Fig 1B,

s Restaurant 0,001). Derefter undersøgte vi forholdet mellem Top1 ekspressionsniveauer og samlet overlevelse (OS), defineret som patienter med kræft i æggestokkene kan dø direkte fra denne sygdom eller fra en uafhængig årsag. Samlet set 110 af 156 patienter havde høje Top1 ekspressionsniveauer (med snesevis af 2+ eller 3+), og de resterende 46 patienter havde lave Top1 ekspressionsniveauer (med scorer på 0 eller 1+). Endvidere patienter med høje Top1 ekspressionsniveauer havde dårlig OS sammenlignet med patienter med lave Top1 ekspressionsniveauer. Vi undersøgte bidrag TOP1 mRNA udtryk til OS af æggestokkene kræftpatienter ved hjælp af KM plotter (https://kmplot.com/analysis/), som vurderede effekten af ​​22,277 gener på overlevelsen af ​​1.464 æggestokkene kræftpatienter. En baggrund databasen blev etableret ved hjælp af genekspression data og overlevelse på 1436 patienter, der blev hentet fra Gene Expression Omnibus (GEO, Affymetrix HGU133A og HGU133 + 2 mikroarrays). OS analyse viste, at høj TOP1 mRNA-ekspression indikeret dårlig overlevelse æggestokkene kræftpatienter (hazard ratio (HR): 1,28,

s

= 0,00062) (S1 Fig). Resultaterne viste, at høj TOP1 ekspression blev signifikant associeret med en dårlig prognose (log-rank

s

= 0,024, Fig 1C). Desuden χ

2 analyse mellem de top1 niveauer og klinisk-patologiske karakteristika patienter viste, at TOP1 overekspression i kræft i æggestokkene var forbundet med Den Internationale Sammenslutning af Gynækologer og obstetrikere (FIGO) fase (

s

0,044; S1 tabel). I univariat analyse, høj TOP1 udtryk (HR: 2,465; 95% konfidensinterval (CI): 1,139-5,335;

s =

0,022; tabel 1), tumor stadie (HR: 8,843; 95% CI: 4,200 til 18,619;

s

0,0001; tabel 1) og tumor recidiv (HR: 0,453; 95% CI: 0,243-0,841;

s =

0,012; tabel 1) blev alle signifikant korreleret til OS. Desuden blev Sygdomsfri overlevelse (DFS), længden af ​​tid efter behandling, hvorunder ingen sygdom fundet, også forbundet med TOP1 ekspression (HR: 1,939; 95% CI: 1,018-3,695;

s =

0,044 ), kræft etape (HR: 5,669; 95% CI: 3,143 til 10,225;

s

0,0001), kemoterapi (HR: 1,774; 95% CI: 0,999-3,151;

p =

0,050), og recidiv (HR: 7,775; 95% CI: 4,515 til 13,391;

s

0,0001). I multivariat analyse blev OS omvendt associeret med TOP1 udtryk (HR: 2.290; 95% CI: 1,055-4,971;

s

= 0,036); tumor stadie (HR: 0,071; 95% CI: 0,030-0,167;

s

0,0001); og kemoterapi (HR: 0,330; 95% CI: 0,151-0,721;

s =

0,005), og DFS var omvendt associeret med TOP1 udtryk (HR: 2,223; 95% CI: 1,150-4,299;

p =

0,018), kræft etape (HR: 0,150; 95% CI: 0,072 til 0,310;

s

0,001), og recidiv (HR: 7,685; 95% CI: 4,294 til 13,753;

s

0,001; tabel 1). I denne undersøgelse, at resultaterne viste en sammenhæng mellem TOP1 udtryk og kræft progression.

(A) Right, kvantificering efter nukleare IHC TOP1 til udtryk i æggestokkene neoplasmer sammenlignet med parrede normale væv. Venstre, repræsentative billeder af IHC farvning af celler, der udtrykker TOP1 i 30 parrede prøver af neoplasma og normale væv; Scorerne blev beregnet efter formlen farvningsintensitet × procentdelen af ​​farvede celler. (B) Snesevis af 0-3 + angiver top1 niveauer i repræsentative kræft i æggestokkene væv. (C) Kaplan-Meier (KM) afbildning af den samlede overlevelse af 155 Ovariecancerpatienter, stratificeret på grundlag af de Top1 niveauer. (D) KM plot af sygdomsfri overlevelse af 155 patienter med kræft i æggestokkene, stratificeret på grundlag af Top1 niveauer.

EVO binder sig til TOP1 og hæmmer dens DNA katalyse aktivitet

EVO er en TOP1-hæmmer, som binder til TOP1-DNA komplekse sites. En computerstyret molekylær model blev brugt til at evaluere docking EVO til TOP1. Selvom EVO har en ikke-plan struktur, kan denne forbindelse interkalere i mellemrummene mellem DNA-baser til dannelse af π-π stabling (Fig 2A). Et SPR-assay blev udført for at bestemme bindingsaffiniteten og yderligere at karakterisere lægemiddel binding. Rekombinant hTOP1 blev kovalent koblet til overfladen af ​​chippen, kombinationen af ​​pUC19 plasmid-DNA (1,0 ug /ml), og EVO (0-2 uM), bestemmes på basis af strømningshastigheden af ​​analytten gennem sensoren chip, og resonans enhed (RU) steg i en koncentrationsafhængig måde (fig 2B) med en KD værdi på 6,92 × 10

-22, beregnes ved hjælp af ProteOn manager 2.0. Strømningshastigheden af ​​analytten uden pUC19 plasmid-DNA forøgede ikke RU. Resultaterne udgør bindingen af ​​EVO til TOP1. For yderligere at bekræfte hTOP1-inhiberende aktivitet af EVO anvendte vi hTOP1-induceret supersnoede PBS (SK +) plasmid afslapning assaysystemet. Supersnoede DNA migrerede hurtigere på agarosegeler end gjorde afslappet cirkulært DNA, som vist i kontrollen (bane 1 og 2). EVO hæmmede hTOP1 katalytisk afslapning (bane 3-5; 1-5 uM). I en koncentrationsafhængig måde (Fig 2C), mens det alene forårsagede ikke ændringer i DNA-topologi (bane 6)

( A) Computer aided molekylær modellering af EVO docking til TOP1. (B) overfladeplasmonresonans sensorgram af interaktionen mellem immobiliseret rekombinant human (h) TOP1 og EVO (0-2 uM). Data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. (C) EVO forhindrede DNA undergå hTOP1-induceret omdannelse af supersnoet DNA til afslappet lukket cirkulært DNA. pUC19 (0,2 ug) plasmid-DNA blev inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter med hTOP1 i nærvær af EVO (0-5 uM).

EVO udviste en cytotoksisk virkning på CPT-resistent A2780

R2000 celler

Vi sammenlignede følsomhed CPT-resistente celler (A2780

R2000) og forældrenes celler (A2780) til det kemoterapeutiske stof, CPT, og EVO. A2780

R2000 celler udviste større modstandsdygtighed over for de cytotoksiske virkninger af CPT end der udvises af A2780-celler (ca. 19-fold høj, Fig 3A). EVO udøvede lignende cytotoksiske virkninger på A2780 og A2780

R2000 celler med IC

50 værdier på 2,18 og 2,38 uM (tabel 2). Disse data indikerer, at CPT-resistente ovariecancerceller er mere følsomme over EVO end til CPT. Endvidere blev den apoptotiske fraktion efter EVO og CPT behandling bestemmes under anvendelse FITC /PI flowcytometri. EVO-udløst apoptose af A2780

R2000 celler skete i en tidsafhængig måde (20,24% ved 12 timer, 26,53% ved 24 timer, og 37,89% ved 48 timer) (fig 3B). Behandling af levedygtige celler med top1 hæmmere kan skade deres DNA og fremkalde responsive reparationsmekanismer. En komet assay blev udført for at overvåge EVO-induceret DNA-beskadigelse af A2780

R2000 celler. EVO behandling (25 uM) i 1 time produceret forstærket DNA-hale, hvilket indikerer øget elektroforetiske mobilitet af DNA-fragmenter. Omvendt kernerne i kontrol og CPT-behandlede celler præsenteret en kompakt runde område af fluorescens, med at blive opdaget intet DNA hale. DNA pauser repræsenteret ved hale området blev beregnet og sammenlignet (

s

0,05, vs. ubehandlede celler; ved hjælp af en Students

t

test) (Fig 3C og 3D). Phosphorylering af histon H2A.X (γ-H2A.X), en biomarkør af DNA dobbelt-strengbrud, blev påvist i celler til yderligere kontrol. Et immunoblot assay blev udført for at bekræfte virkningen af ​​EVO på γ-H2A.X niveauer, og resultaterne viste, at EVO øgede γ-H2A.X proteinniveauer i en koncentrationsafhængig måde efter 6 timer af behandlingen. Sammenlignet med CPT behandling, 0-10 uM EVO behandling steget markant de relative γ-H2A.X niveauer (Fig 3E). GAPDH med konstant udtryk blev anvendt som en intern kontrol.

(A) Levedygtigheden af ​​A2780 og A2780

R2000 celler blev vurderet efter 48 timers behandling med camptothecin (CPT) eller EVO under anvendelse af et MTT-assay, og IC

50 værdier blev bestemt. (B) FITC /PI flowcytometri af A2780

R2000 celler behandlet med EVO (10 uM) i 12-48 timer sammenlignet med celler behandlet med CPT (10 uM) for 12-48h. (C). EVO-induceret DNA-skader i A2780

R2000 celler. Celler blev ubehandlet eller behandlet med CPT og EVO (25 uM) i 1 time og blev derefter analyseret under anvendelse af et neutral komet assay som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Repræsentative billeder (200 ×). (D) Histogram af halen øjeblik afbildet mod hver behandling tilstand.

s

værdier af sammenligninger (markeret med *) var 0,05 som bestemt ved hjælp af en 2-tailed Students

t

test. (E) y-H2A.X niveauer efter EVO eller CPT behandling i A2780

R2000 celler. Celler blev behandlet (0-10 pM) i 6 timer, og cellelysater blev immunoblottedes med et antistof mod γ-H2A.X. GAPDH med konstant udtryk blev anvendt som den interne kontrol.

EVO induceret G

1 fase anholdelse og træghed AMPK aktivering i CPT-resistent A2780

R2000 celler

Fordeling af celler i 3 faser (G

0 /G

1, S og G

2 /M) af cellecyklussen blev bestemt ved anvendelse flowcytometrianalyse, og andelen for parental A2780 celler var 64,84 ± 0,63, 27,27 ± 0,33 og 7,94 ± 0,36 hhv. EVO behandling (5 uM i 48 timer), øget andelen af ​​celler i G

2 /M fase (25,82 ± 1,38,

s

0,05). Andelen af ​​A2780

R2000 celler i G

0 /G

1, S, og G2 /M-faser var 53,2 ± 0,36, 15,93 ± 0,66, og 28,20 ± 1,16 hhv. EVO behandling øget andelen af ​​celler i G

0 /G

1 fase (58,7 ± 0,24,

s

0,01), mens der blev observeret nogen signifikant ændring i andelen af ​​celler i G

2 /M-fase (30.53 ± 0,19) (fig 4A). EVO behandling induceret G

2 /M anholdelse i forældrenes A2780 celler, mens det induceret tab af G

2 /M anholdelse og gevinst på G

1 anholdelse i CPT-resistent A2780

R2000 celler. En forskel i cellecyklus distribution på CPT (S2 ​​Fig) og EVO behandlinger blev observeret i CPT-resistente celler sammenlignet med dets forældre celler. Lægemiddelresistens blev rapporteret at være associeret med øget AMPK aktivitet. For at bestemme om AMPK aktiveres i A2780

R2000 celler, blev cellerne behandlet med CPT (10 uM) i 0-3 timer, og derefter Western blotting blev udført for at undersøge niveauerne af den aktive phosphorylerede form af AMPK (phospho-Thr172 ). CPT behandling forbedrede phospho-AMPK niveauer i A2780

R2000 celler (Fig 4B, til venstre). Endvidere blev phospho-AMPK niveau efter EVO behandling for 0-3 timer evalueret. EVO behandling ikke fremkalde vedvarende phospho-AMPK-niveauer (Fig 4B, højre), hvilket tyder på, at A2780

R2000 celler udøver forskellige reaktioner i forhold til deres forældre A2780 celler efter CPT og EVO behandlinger. CPT og EVO behandlinger afslørede konsistente ændringer i AMPK nedstrøms target, phospho-acetyl-CoA-carboxylase (ACC) i A2780

R2000 celler (Fig 4C).

(A) Cell cyklus fordelinger af A2780 og A2780

R2000 celler efter EVO behandling (5 uM) i 48 timer. Ændringerne i cellecyklus blev anslået på grundlag af flowcytometri resultater. Data er repræsentanter fra flere eksperimenter med lignende resultater. (B) Immunoblot af AMPK fosforylering efter EVO (10 uM) behandling for 0-3 timer. (C) Immunoblot af phospho-ACC efter EVO (10 uM) behandling for 0-24 t.

Desuden eksponering af A2780

R2000 celler til 10 uM CPT eller EVO til 0- 24 timer produceret forskellige reaktioner til at inducere phosphorylering af c-Jun N-terminal kinase (JNK) (Thr183 /Tyr185) og ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK) 1/2 (Thr202 /Tyr204) med forskellige tider. JNK fosforylering startede 3 timer efter CPT behandling og vedholdende øges op til 24 timer, mens EVO behandling ikke øgede phospho-JNK. Phosphorylering af ERK startede 6 timer efter CPT behandling og vedholdende øget til 24 timer, mens EVO behandling ikke øgede phospho-ERK. Hverken CPT eller EVO behandling forbedret phosphorylering af (Thr180 /Tyr182) af A2780

R2000 celler (S3 Fig).

EVO hæmmede celle proliferation i en xenograft musemodel

For

in vivo

undersøgelser, A2780

R2000 celler, der udtrykker Luc eller GFP-generne blev isoleret og beriget med et flow sorteringsanlæg og derefter sprøjtet ind i underhuden hos SCID-mus (10

6 celler /mus) udarbejde ovariecancer xenograft model. Syv dage efter celleimplantation blev musene tilfældigt inddelt som kontrol eller behandlede grupper (100 mg /kg IP EVO behandling).