PLoS ONE: Urinary flygtige forbindelser som biomarkører for Lung Cancer: En Bevis for Princip Study Brug Lugt signaturer i musemodeller af Lung Cancer

Abstrakt

En potentiel strategi til diagnosticering af lungekræft, den hyppigste årsag til kræft- dødsfald, er at identificere metaboliske signaturer (biomarkører) af sygdommen. Selvom data understøtter den hypotese, at der kan påvises flygtige forbindelser i ånde lungekræftpatienter med lugtesansen eller gennem bioanalytiske teknikker, analyse af udåndingsprøver er tung og teknisk udfordrende, hvilket begrænser dets anvendelighed. Hypotesen undersøges her er, at variationer i små molekylvægt flygtige organiske forbindelser ( “lugtstoffer”) i urin kan anvendes som biomarkører for lungekræft. For at demonstrere tilstedeværelse og kemiske strukturer af flygtige biomarkører, vi studerede mus lugtesansen-styrede adfærd og metabolomics af flygtige bestanddele af urin. Sensor-mus kan trænes til at skelne mellem lugte af mus med og uden eksperimentelle tumorer som viser, at flygtige lugtstoffer er tilstrækkelige til at identificere tumorbærende mus. I overensstemmelse med dette resultat, kemiske analyser af urin flygtige stoffer viste, at mængderne af adskillige forbindelser var dramatisk anderledes mellem tumor og kontrolmus. Brug principal komponent analyse og overvåget maskine-learning, vi præcist diskriminerede mellem tumor og kontrolgrupper, et resultat, der var kors valideret med nye testgrupper. Selv om der blev delt forskelle mellem forsøgs- og kontroldyr i de to tumormodeller, vi også fundet kemiske forskelle mellem disse modeller, hvilket viser tumor-baserede specificitet. Succesen med disse undersøgelser tilvejebringer et nyt proof-of-principle demonstration af lunge tumor diagnose gennem urin flygtige lugtstoffer. Dette arbejde skal give et afsæt for lignende søgninger for flygtige diagnostiske biomarkører i urinen af ​​patienter menneskelige lungecancer

Henvisning:. Matsumura K, Opiekun M, Oka H, ​​Vachani A, Albelda SM, Yamazaki K, et al . (2010) Urinary flygtige forbindelser som biomarkører for Lung Cancer: En Bevis for Princip Study Brug Lugt signaturer i musemodeller af lungekræft. PLoS ONE 5 (1): e8819. doi: 10,1371 /journal.pone.0008819

Redaktør: Xiaoping Pan, East Carolina University, USA

Modtaget: August 15, 2009; Accepteret: 16. december 2009; Udgivet: 27 Januar 2010

Copyright: © 2009 Matsumura et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Panasonic Corporation. Som anført under afsnittet konkurrerende interesse, en medarbejder i Panasonic, Dr. H. Oka, hjalp forestille den oprindelige idé og revideret manuskriptet. Ingen anden rolle i denne forskning blev spillet af Dr. Oka og Panasonic

Konkurrerende interesser:. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Panasonic Corporation. Forfatterne erklærer ingen andre konkurrerende interesser. Der er ingen patenter eller patentansøgninger baseret på arbejde, og der er ikke nogen produkter i forbindelse med arbejdet under udvikling. Ingen af ​​forfatterne, bortset fra én medforfatter som er ansat af Panasonic (Dr. Oka), have økonomiske relationer, der kunne opfattes som relevant, herunder kapitalandele, rådgivning aftaler, eller rejsestipendier eller honorarer. Dr. Oka hjalp fatte den oprindelige idé til dette arbejde og revideret manuskriptet, men de andre medforfattere designet undersøgelse, foretaget det, analyserede data og skrev manuskriptet.

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald i det meste af verden [1]. Den eneste behandling, der opnår en høj kur er kirurgisk resektion af tidlig sygdom (før metastatisk spredning forekommer). Da kun omkring 25% af tilfældene er diagnosticeret på dette tidlige tidspunkt, er der et presserende behov for effektive tidlige diagnostiske teknikker.

Aggressiv og tidlig bryst billeddannelse af højrisikopatienter fremstår som den dominerende tilgang til tidlig diagnose, selv om store undersøgelser at validere denne fremgangsmåde er stadig i gang [2], [3], [4]. Desværre, selvom billeddannelse er meget følsomme, er det også relativt ikke-specifik. Nylige undersøgelser har vist, at mellem 5-26% af højrisiko ryger patienter har detekterbare lungeknuder ved CT screening imidlertid kun et gennemsnit på omkring 4% (med en afstand af 2-11%) af disse knuder er maligne [5]. Klart kirurgisk resektion af alle disse knuder hverken er praktisk eller ønskelig. Tilgange til at bestemme hvilke knuder bør fjernes således behov. En attraktiv strategi ville være at kombinere en følsom billeddannelse teknik med en biomarkør for lungekræft at øge specificitet [6], [7], [8]. Fordi forekomsten af ​​lungekræft i denne “knude befolkning” er betydeligt højere end i nuværende eller tidligere rygere befolkninger, ville biomarkører i denne sammenhæng ikke kræver de ekstremt høje følsomheder og særlige nødvendige for befolkningen screening. En anden anvendelse for en sådan biomarkør kunne være at følge forløbet af tumoren efter behandling.

Med udviklingen af ​​højt gennemløb teknikker til biomarkør opdagelse [9], er området for lungekræft biomarkører nylig udvidet væsentligt. Aktuelle biomarkør kandidater fra blod, spyt og urin omfatter mange klasser af molekyler, herunder proteiner, tumorantigener, anti-tumor-antistoffer, celle typespecifikke peptider, forskellige metaboliske produkter og epigenetiske fænomener som hyper-methyleret DNA, RNA, og specifik genekspression [10]. Men ingen biomarkør identificeret til dato har vist, at få tilstrækkelig følsomhed, specificitet og reproducerbarhed skal anses for tilstrækkelig til brug til at opdage og overvåge lungekræft udvikling.

En anden klasse af biomarkører for lungekræft kunne være små molekylvægt flygtige organiske forbindelser. Disse molekyler, som kan opfattes som lugte (især ved dyr), har vist sig at fungere som “underskrifter”, der formidler sociale, følelsesmæssige og helbredsoplysninger til andre medlemmer af de arter [11]. Der kan være to kilder til flygtige markører hos patienter med lungecancer. Undersøgelser har vist, at lungekræft-cellelinjer kan frigive specifikke flygtige organiske forbindelser

in vitro

[12]. Tilstedeværelsen af ​​en voksende tumor kan også fremkalde specifikke metaboliske eller ernæringsmæssige ændringer, der kan ændre produktionen eller frigivelsen af ​​sådanne forbindelser [6].

“flygtige hypotese” for lungekræft har ført til en række undersøgelser undersøge nytten af ​​at analysere disse forbindelser i udåndingsluften hjælp af enten dyr (såsom hunde) [13] eller sofistikerede biokemiske teknikker [14], [15]. Nogle af disse undersøgelser har vist lovende. For eksempel en nylig undersøgelse fra Chen gruppen [16] anvendelse af fastfase mikro-ekstraktion efterfulgt af gaskromatografi viste, at 1-butanol og 3-hydroxy-2-butanon blev fundet ved signifikant højere koncentrationer i udåndingsluften af ​​patienter med lungecancer sammenlignet til kontrol. Dragonieri et al. brugte en “elektronisk næse”, og var i stand til at skelne patienter med lungekræft versus dem med kronisk obstruktiv lungesygdom med relativ høj følsomhed og specificitet [17].

Desværre, indsamling, håndtering, opbevaring, koncentrere og analysere ånde prøver er besværligt, teknisk udfordrende, og kan således ikke være let at anvende bredt. En delvis løsning på disse problemer ville være at anvende en langt mere bekvem kilde til flygtige stoffer, såsom urinprøver selvom urin, ligesom ånde, vil ikke kun omfatte endogene flygtige stoffer, men også eksogene dem fra kilder såsom kost og miljø. I denne henseende Willis et al. (2004) rapporterede, at hunde kan trænes til at skelne patienter med blærecancer på grundlag af urin lugt større held end det ville forventes ved en tilfældighed alene [18]. Desværre, en opfølgende undersøgelse af Gordon ET1 al. [19] ikke var i stand til at reproducere disse resultater i urinprøver fra patienter med bryst- og prostatakræft.

På baggrund af disse overvejelser, hypotesen udforsket i dette papir er, at variationer i små molekylvægt flygtige organiske forbindelser ( “lugtstoffer “) i urin kan anvendes som biomarkører for lungekræft. En af de primære problemer i forsøget på at begynde med at identificere flygtige biomarkører fra humane patienter er den enorme variation, kan skyldes ukontrollerede variabler som genetiske og kosten forskelle, personlig pleje produkt brug og andre miljømæssige variabler, der kan få indvirkning på kropslugt flygtige. Den iagttagelse, at hunde tilsyneladende kan bortfiltrere disse potentielle distraktioner og fokusere på sygdommen signatur (se ovenfor) tyder på, at der kan være potentielt nyttige biomarkører.

I lyset af disse udfordringer, vi valgte at forfølge en mere meget kontrolleret dyr model tilgang [20], [21], hvor mange af de variabler, der gør patienten arbejde så svært kan kontrolleres (figur 1A). Vores strategi var at først vise, at mus kan trænes til at skelne urinprøver fra mus med tumorer fra kontrol mus ved lugt alene. Når vi havde etableret dette var muligt, vi derefter anvendes metabolisk profilering (fast-fase-mikroekstraktion, efterfulgt af gaskromatografi kombineret med massespektrometri) til at vise, vi kunne identificere specifikke mønstre af flygtige stoffer i urin, som kunne adskille tumorbærende mus fra kontroldyr .

(A) Oversigt over eksperimentel procedure. Vi ansat mus olfaktoriske guidet adfærd (til venstre) og metabolomiske (til højre) nærmer. (B) LKR-celler og LLC-celler blev injiceret subkutant i flankerne af voksne hanmus og tumorstørrelse blev målt ugentligt derefter. Hvert tidspunkt viser middelværdien ± SEM tumorstørrelse. Solid linje: faktiske data; Stiplet linje: kurve monteret med Tredjegradsligning; LKR: y = 0,092 * x

3-2,8 * x

2 + 38 * x – 18, LLC: y = 0,16 * x

3 – 0,83 * x

2 + 3,5 * x – 4. mus urin blev opsamlet individuelt en gang om dagen og blev brugt til kemisk analyse og bioassay i de anførte perioder: for LKR – Days 15-24 og 25-37 til træning og Dage 2-7, 9-14, 15-20 og 25-37 for generalisering; For LLC – Days 17-26 til træning og Dage 1-8, 9-16, og 17-26 for generalisering. (C) Box plot af generalisering scorer for bioassay og korrelationerne blandt tests. Blå kasser repræsenterer den nedre og øvre kvartil. Den røde vandrette bjælke i hver boks angiver medianen. Den stiplede linie repræsenterer intervallet af observationer. Den plus (+) markerer ekstrem outlier observationer. *;

P

0,01, **

P

0,001, ***;

P

0,0001 sammenlignet med nul-hypotesen af ​​en 50% generalisering score. Fra venstre, LKR-uddannede mus urin generalisering til LKR musen urin (Uddannelse 1, figur 1C-i); LKR- uddannet mus urin generalisering til LKR musen urin (Uddannelse 2, figur 1C-ii); LLC-uddannede mus urin generalisering til LLC musen urin (Figur 1C-iii); LKR-uddannede mus urin generalisering til LLC musen urin (Figur 1C-iv); LLC-uddannede mus urin generalisering til LKR musen urin (Figur 1C-v).

Resultater

Mus modeller af lungekræft

lungetumorer stammer fra mus celle linjer har ligheder i morfologi, histopatologi og molekylære karakteristika med humane lunge adenokarcinomer og kan tjene som nyttige første modeller [22]. Vi anvendte to muse lunge cancercellelinjer, LKR, der blev afledt fra et transgent dyr, der udtrykker muteret Kras og LLC, Lewis lunge cellecarcinom, der opstod spontant. Tumorer blev induceret ved inokulering hver af disse cellelinier i forskellige grupper af mus (kontrolmus blev injiceret med køretøjet, saltvand, efter det samme skema). Tumoren vækstkurver for disse to cellelinjer viste lignende mønstre (figur 1B). Baseret på tumor vækstkurver, vi indsamlede urinprøver, der strakte stadier af tumorvækst for bioassay og til senere kemisk analyse.

olfaktoriske Påvisning af urin lugt

Vi trænede sensor mus (se metoder) til skelne mellem de lugte af mus urinprøver indsamlet fra LKR-injicerede mus med store tumorer (Dage 25-37 indlæg celle injektion) i forhold til genetisk identiske kontrol mus uden tumorer. Da dette var en succes, vi testet for at bestemme, om denne læring generaliseres til tidligere stadier af tumor udvikling. Som vist i figur 1C-i, de uddannede mus succes fornemme mellem uriner indsamlet fra mus med tumorer på 25-37, 15-20 og 9-14 dage efter injektion, men ikke generalisere til tumorer på meget tidlige stadier (dage 1-7 ). Dernæst vi yderligere trænet disse samme sensor mus ved hjælp af urinprøver indsamlet på dag 15-24 efter injektion. Selv om disse mus generaliseret denne uddannelse til nye prøver indsamlet fra mus med tumorer den samme størrelse, har de ikke gøre det for uriner indsamlet på dag 9-14 eller 1-7 (Figur 1C-ii). Kontrol eksperimenter bekræftet, at uddannede mus ikke skelnede mellem injicerede og ikke-injicerede mus forud for injektioner, hvilket viser, at der ikke var nogen skævhed i den oprindelige mus urin eller Y-labyrint-apparatet.

For at undersøge den generelle betydning af dette resultat, vi trænet en separat gruppe af sensor mus til at skelne urinen af ​​mus tilbage- og uden LLC-inducerede tumorer. Mønsteret af resultater var næsten identisk med den med LKR-inducerede tumorer (Figur 1C-iii).

Vi næste spurgt, om de lugte forbundet med LKR og LLC tumorer var perceptuelt lignende, ved at teste uddannede mus på urinprøver indsamlet fra tumorbærende vs. kontrolmus fra dyremodellen er forskellig fra den, som de er uddannet på. Det vil sige, vi spurgte, om mus uddannet til at diskriminere urinen af ​​mus med og uden LKR-inducerede tumorer ville genkende (generalisere denne reaktion på) LLC tumor-bærende mus og vice versa. Svaret var bekræftende (Figur 1C-vi og -v). Disse resultater viser, at tumorer forårsaget af disse kræft cellelinier producerer almindelige. (Selvom de ikke er identiske, se nedenfor) flygtige biomarkører, der kan genkendes af de olfaktoriske systemer af mus

Karakterisering af Urinary flygtige forbindelser

Vi næste kendetegnet karakteren af ​​kemiske variation adskille mus med tumorerne fra dem uden ved at analysere urin flygtige forbindelser med fastfase-mikroekstraktion, efterfulgt af gaschromatografi koblet med massespektrometri. Fra den typiske totale ionchromatogrammer (tics) et stort forskelligartet sæt af toppe kunne skelnes (fig S1). Fyrre syv toppe blev udvalgt til identifikation fra tics baseret på deres have tilstrækkeligt store tophøjder og ikke-overlappende TIC som bestemt ved visuel inspektion. Som det kan ses i tabel 1 og S1, blev toppene består af en række forskellige kemiske strukturer, og som potentielt involveret i flere biologiske funktioner, for eksempel i pheromonal kommunikation (2-heptanon, 3,4-dehydro-

exo

-brevicomin og 2-

sec

butyl-4,5-dihydrothiazol, 6-hydroxy-6-methyl-3-heptanon,

β

farnesen [23]). identificeret var også forbindelser, som tidligere rapporteret i human urin (nitromethan, dimethylsulfon,

o

toluidin, 2-ethylhexansyre [24]).

Vi næste brugte kvantitative analyser af disse 47 toppe at afgøre, om mus med og uden eksperimentelt inducerede tumorer kunne skelnes. Variation i de rå tophøjder viste klart forskelle i de relative mængder af forskellige forbindelser baseret på nærvær eller fravær af tumor og cancertyper (figur 2A og figur S2). Vi observerede relativt konsistente ændringer for mange toppe og for begge tumor grupper med de mest almindelige mønster er en nedsat produktion (nedregulering) i tumor grupper, og enten en øget produktion (opregulering) eller ubetydelig ændring i placebogruppen (figur S3). For eksempel, peak 13 (5-hepeten-2-on) blev nedreguleret drastisk som følge af tilstedeværelse af tumor (figur 2B). Således kan en overordnet nedregulering af flygtige forbindelser være et fælles træk ved tumorvækst. Der var dog andre mønstre af ændring for et mindretal af flygtige forbindelser. For eksempel blev fremstillingen af ​​top 37 (2-ethylhexansyre) forhøjet i begge tumor grupper. Ændringer i andre toppe afhang cancertyper (og /eller muse-stamme). Peak 29 (Acetophenon) var nedregulering i LKR-tumor-gruppe og opregulering i LLC-tumor gruppe mens peak 33 var nedregulering kun i LKR tumor gruppe. Billedet vifte plot (Figur 2C) tydeligt viser de overordnede forskellige virkninger af tumorvækst.

(A) Sammenligning mellem tidlig fase og sent tidspunkt i 4 illustrative toppe udvalgt blandt 47 toppe analyseres. Lodrette akse angiver intensitet (mængde) af TIC; lodrette linier omkring gennemsnittet angiver SEM ved hvert prøvetagningssted. Blå repræsenterer tidligt mens rød repræsenterer sent tidspunkt. Vandrette akse angiver retentionstid. (B) Bar plot af intensiteten af ​​4 illustrative toppe udvalgt blandt de 47 toppe analyseres. Mean peak intensitet er plottet på hver top. Røde søjler repræsenterer tumor-grupper; blå søjler repræsenterer kontrolgrupper. En bleg blå baggrund angiver en signifikant forskel på

P

0,0001 mellem tumor og kontrolgrupper. (C) Rå intensitet på 47 analyserede toppe opnås ved at trække den tidlige periode fra den senere periode (n = 25 for hver af de 4 grupper). Mørkere grå betyder toppen øget efter tumor udvikling mens lysere grå betyder toppen faldt efter tumor udvikling.

Forskelsbehandling af Tumor og placebogruppen

Vi næste fortsatte med at metabolomiske profilering til statistisk diskriminere mellem grupper og identificere karakteristiske toppe. Til dette formål har vi kombineret to forskellige fremgangsmåder: principal komponent analyse (PCA) og support vektormaskine (SVM). Den første, PCA, tillader strukturen i et datasæt at diktere adskillelsen af ​​prøver i klynger baseret på den samlede lighed i spidsværdier uden forudgående kendskab til prøven identitet. Plots af PCA scorer beregnet ud fra de normaliserede værdier af de 47 toppe viste en markant adskillelse af den kemiske profil mellem tumor grupper og placebogrupperne i begge cancercellelinier (figur 3A og 3B). For det andet blev en overvåget maskine-learning tilgang baseret på SVM anvendes til at bestemme grænsen mellem tumor grupper og placebogruppen. Denne algoritme betragtes som den første to hovedkomponenter, PC1 og PC2, for at skabe beskrivelser af prøver i denne high-dimensionelle rum, og derefter defineret en hyperplan der bedst adskiller prøver fra de to klasser. Den SVM klassifikator held adskilt prøverne i tumor og placebo kategorier (vises i fine kontur med farven blå til rød i figur 3A og 3B). Den SVM held klassificeret fleste individer giver en klassificering nøjagtighed på 94% med en følsomhed på 88% og specificitet på 100% (LKR) og en nøjagtighed på 94% med en følsomhed på 100% og specificitet på 88% (LLC). Især kun 3 af de 50 individuelle mus i vores test sæt blev kategoriseret. Således de udvalgte toppe indeholder kemiske egenskaber adskiller tumor fra placebo-mus.

Adskillelse af tumor og placebogruppen ved Princip Komponenter Analysis (PCA) og dens grænse bestemmelse ved Support Vector Machine (SVM) er vist i A (LKR ) og B (LLC). Cirkler repræsenterer individer af tumor grupper og trekanter repræsenterer individer af placebogruppen (Support vektorer: udfyldte cirkler og trekanter). Baggrunden kontur farve, der spænder fra rød til blå, angiver klassen sandsynligheden for forskellige regioner i flyet.

Cross Validering og Essential Kombination af Peaks

For at validere disse analyser, vi anvendes en 10-fold krydsvalidering metode ved anvendelse af alle 25 prøver. For yderligere analyse, valgte vi 11 toppe fra de oprindelige 47 toppe, der afveg mellem tumor og placebogruppen med en

P

0,0001 (Tabel 1). Vi trænet SVM klassifikator ved at anvende alle logisk mulige kombinationer uden gentagelser fra disse 11 toppe for hver af de to modelsystemer (LKR og LLC). Den generalisering udførelsen af ​​SVM klassificører beskæftiger forskellige sæt af peak klynger blev illustreret i receiver opererer karakteristik (ROC) plads. Ingen enkelt top med succes klassificeret med en nøjagtighed på mere end 95%. Imidlertid klassificering med flere par toppe resulterede i en nøjagtighed på op til 98 ± 2% for LKR og 100% for LLC (tabel 2-i, -ii og tabel S2, fig S4), hvilket bekræfter, at bedre generalisering afhængig af en kombination af toppe. I yderligere analyser (data ikke vist) fandt vi, at SVM havde overlegen ydelse til Fisher Discriminant Analysis, som brugte opsyn læringsmetoder. Således kan karakteristiske peak klynger pålideligt skelne tumor grupper fra placebogruppen og kan have diagnostisk potentiale.

For at vurdere generalisering magt peak klynger til en ny gruppe, vi skabt uafhængige uddannelse sæt (13 de 25 prøver) og test sæt (forblev 12 prøver). SVM klassificører trænet med de 11 udvalgte peak klynger af træningssættet genererede en bedste kombination af toppe med nøjagtigheder på 95% for LKR og 100% for LLC teste sæt (Tabel 2-iii, -v og tabel S3, figur S5 ).

Selvom LKR og LLC cellelinier er forskellige modelsystemer og de blev injiceret i forskellige indavlede musestammer (som selv sandsynligvis afveg i kropslugt), vores adfærdsmæssige undersøgelser antydet, at de delte fælles lugte indikerer tilstedeværelsen eller fravær af tumorer. Dette viste sig også at være tilfældet i de metabolomiske analyser. Den gruppe af toppe (klyngen), der bedst forudsagt LLC status fra LKR data som bestemt ved SVM (tabel 2-iv) havde en nøjagtighed på 98%. Omvendt gruppen af ​​toppe, der bedst forudsagt LKR fra LLC (Tabel 2-vi) havde en nøjagtighed på 91%. Kun én top (# 22; se tabel 2-iv, We) var fælles for disse to sæt prædiktive klynger. Klassifikation af andre peak klynger også genereret høj diagnostisk nøjagtighed (95%) med betydelig diagnostisk potentiale (Figur S6).

Interaktiv Effekt af tumorer og cellelinier

Selvom der var fællestræk mellem de to tumormodeller, yderligere statistiske analyser viste også, at virkningerne af de to tumormodeller på metaboliske profiler ikke var identiske. Samspillet mellem to forskellige cellelinier (LKR og LLC) og tumor versus placebo blev analyseret med 2-vejs analyse af varians (tumor og placebogrupperne for hver af de to tumormodeller) for hver af de 47 toppe (figur 4 og S7 ). En signifikant interaktion indikerer tumor specificitet. Af de 47 separate analyser, samspillet w’as signifikant (

P

0,05) i 11 tilfælde (Tabel S3). For at kontrollere for falske positiver grundet teste 47 toppe, vi begrænset hensyn til 4 toppe (nr 1, 7, 29 og 33) med

P

0,002. Disse interaktioner er illustreret i figur 4, hvor for eksempel, peak 29 viser ingen forskel mellem tumor og placebo (

P

= 0,0387), men en stor forskel mellem tumormodeller (

P

= 0,0002) . Der er tilstrækkelig specificitet til at skelne mellem de flygtige profiler af de to tumortyper.

Normaliseret intensitet (på den lodrette akse) af de fire toppe (A-D), hvor en to-vejs ANOVA angivet signifikant (

P

0,002) interaktioner angiver differentiering mellem de to tumormodeller. Den vandrette akse for hver af de 4 paneler (A-D) viser de to trin, tidligt – før væsentlig tumorudvikling til venstre og senere – efter udvikling af signifikant tumorstørrelse. Rød: tumor, Blå: placebo, Cirkel: LKR, Star:. LLC

Diskussion

Identifikation af flygtige biomarkører i urin for sygdomsdiagnose er et område med store løfter, men det er baseret på begrænset forudgående menneskelige forskning. Dataene i dette papir er konsistente med den hypotese, at diagnostisk anvendeligt flygtige forbindelser fremstilles i patienter med lungekræft og udskilles i urinen, hvilket giver støtte til denne diagnostiske fremgangsmåde i forbindelse med lungekræft.

Specifikt vores undersøgelser viste, at dyr lugtesansen i arter som mus (der har et følsomt olfaktoriske system, [25], [26]), kan have diagnostisk succes med at afsløre lungekræft signaturer i urin. Vigtigere, var vi i stand til at efterligne denne evne ved hjælp bioanalytic teknikker. Dette tyder det vil være muligt at skabe en biomimetisk sensor baseret på kendskabet til olfaktoriske system til screening af diagnostiske lugtstoffer, der kunne være praktisk for udbredte anvendelser [27], [28], [29], [30]. Faktisk har gensplejset gær udtrykker et olfaktoriske receptor og dens signaltransduktionssystem vist sig at kunne detektere 2,4-dinitrotoluen, en forbindelse diagnostiske for sprængstoffer [31]. Kunstig lugtesans med en polymer epitel og model glomeruli kunne registrere lugtstoffer derved efterligne et biologisk olfaktoriske system, [32]. Med tiden vil sådanne sensorer føre til udviklingen af ​​kommercielt tilgængelige testsæt. Men det ser også, at metabolisk profilering (fast-fase-mikroekstraktion, efterfulgt af gaskromatografi kombineret med massespektrometri) er et levedygtigt alternativ, der bør undersøges nærmere.

Den metaboliske oprindelse mange af de diagnostiske biomarkører vi identificerede er ikke kendt, og vi kunne ikke identificere fælles kemiske egenskaber. I stedet havde de deres oprindelse i enten en række endogene biokemiske veje eller fra miljømæssige (exogene) kilder. Disse sidstnævnte forbindelser (for eksempel

o

toluidin, og 2-ethylhexansyre) næppe vil være diagnostisk anvendeligt. Blandt de endogene metabolitter, er 2-heptanon, en feromon, rapporteret at stige i koncentration i stressede rotter, og er blevet observeret i human urin [33]. 6-hydroxy-6-methyl-3-heptanon har også tidligere blevet identificeret i mus urin, selv om vi kan finde nogen rapport af denne forbindelse i human urin. Den observerede variation af ketoner som funktion af tumorvækst antyder, at ketogenesic pathways kan være involveret i disse modeller for lungekræft. ville være nødvendigt yderligere forskning for at afgøre, hvilke af disse diagnostiske metabolitter er tumor oprindelse, og som stammer fra normale stofskifteprocesser og er enten ned- eller op-reguleret af tumorer.

Den fælles nedregulering vi observeret efter tumor udvikling i mange forbindelser er bemærkelsesværdigt. De fleste biomarkører rapporteret af andre forskere er blevet opreguleret. En forklaring på disse forskellige fund kan opholde sig med afsløring strategier ansat af andre til at identificere biomarkører. I nogle undersøgelser kan der være en bias i retning af en søgning efter roman (og derfor up-reguleret) biomarkør forbindelser mens vores metoder ikke havde en sådan skævhed. En anden mulighed er, at denne hyppige Nedregulering skyldes komplekse virkninger af tumoren på dyrets stofskifte Salg

Selvom SVM fandt klynger af toppe, der forudsiges mellem de to modeller for kræft (LKR til LLC og omvendt:. Tabel 2) med stor nøjagtighed, klyngerne var hovedsagelig forskellige for forudsigelse i de to retninger. Dette resultat synes at være i modstrid med de dyr uddannelse undersøgelser, der er angivet, at mus uddannet til at diskriminere i en af ​​tumor-modeller generelle dette lærte reaktion uden yderligere træning til den anden model. Dette indebærer, at der skal være et sæt af flygtige forbindelser (lugtstoffer) fælles for de to modeller, der adskiller tumor fra ikke-tumor-mus. En sandsynlig forklaring på denne tilsyneladende anomali er, at kombinationer af flygtige komponenter, som vi har identificeret med SVM klassificører er ikke de samme, som de mus cueing i på under træning og test; måske er der andre komponenter til fælles med de to modeller, som vi endnu ikke har identificeret. Hvis dette er tilfældet, vil en af ​​de kommende udfordringer være at identificere disse nye biomarkører. Alternativt, kan vi konstatere, at der var en forbindelse, der var fælles for forudsigelse i begge retninger (# 22), og vi kan ikke udelukke muligheden for, at det var denne sammensatte mus, der anvendes til at skelne i begge tilfælde.

En vigtig overvejelse for enhver praktisk diagnostisk værktøj er dens evne til at skelne mellem forskellige typer af sygdom. Selv om de to modeller af lungekræft klart har ligheder i flygtige profiler, de har også tilstrækkelige forskelle, at de kan skelnes i metabolomiske analyser (figur 4). Denne evne til at skelne mellem nært beslægtede musemodeller for lungekræft indebærer, at bestemte cancertyper kan være modtagelige for diagnostisk differentiering gennem analyser af flygtige profiler som vist i den aktuelle forskning.

Det fremtidige arbejde med dyremodeller kunne fortsætte ad tre konvergerende linjer. Det første er det vigtigt at overvåge de udviklingsmæssige ændringer i markører på tidligere stadier af tumor udvikling. Ikke alene er dette relevant for vurderingen af, hvor tidligt kan påvises diagnostiske markører, men det kunne kaste lys over potentielle mekanismer bag ændringer i flygtige stoffer som følge af tumor progression. For det andet bør en række forskellige tumortyper undersøges ud over de to nært beslægtede er beskrevet her. Dette kunne også give vigtige fingerpeg om mekanismen. For det tredje, in vitro-undersøgelser af tumorceller vil være afgørende i at forstå mekanismer.

Sammenfattende kunne vi for første gang at identificere flygtige kemiske signaturer i urin af musemodeller for lungekræft ved hjælp streng eksperimentel adfærdsmæssige og analytisk teknikker. Betydningen af ​​denne undersøgelse er, at den fastlægger muligheden for at benytte urin flygtige til at opdage lungekræft. Evnen til let at indsamle og opbevare urinprøver vil være en stor fordel ved denne fremgangsmåde i at analysere volatile i udåndingsluften. Selv om denne undersøgelse har rejst mange spørgsmål om identitet og kilden til de fundne i vore musemodeller forbindelser, er vi ikke planer om at forfølge denne retning. I stedet skal vi se denne undersøgelse som en vigtig bevis på hovedstolen for værdien af ​​at studere urin flygtige hjælp biokemiske og bioinformatiske teknikker til diagnosticering af humane lungecancer (og måske andre kræftformer). Derfor har vi indledt kliniske studier med humane patienter. Disse undersøgelser vil tage fat på centrale spørgsmål om følsomhed, specificitet, størrelsen af ​​tumorer, der kan præcist detekteres, mekanismerne bag de observerede ændringer i flygtige profiler, evnen til at generalisere blandt forskellige typer af lungekræft, og virkningen af ​​nuværende eller tidligere rygning .

Materialer og Metoder

Lung cancer cellelinjer

Kras-inducerede murine lungekræft (LKR) og Lewis lunge celle carcinom (LLC) cellelinier blev indkøbt fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA).