PLoS ONE: Serum S100A6 Koncentration forudser Peritoneal Tumor Burden i mus med Epithelial kræft i æggestokkene og er forbundet med Advanced Scene i patienter

Abstrakt

Baggrund

Kræft i æggestokkene er den 5. hyppigste årsag til kræftrelaterede dødsfald blandt kvinder. Femårige overlevelsesrater for tidligt stadie sygdommen er større end 94%, men de fleste kvinder er diagnosticeret i fremskredent stadium med 5 år overlevelse mindre end 28%. Forbedrede midler til tidlig påvisning og pålidelig patientovervågning er nødvendige for at øge overlevelsen.

Metode og vigtigste resultater

Anvendelse massespektrometri-baseret proteomanalyse, vi søgte at belyse et ubesvaret biomarkør forskning spørgsmål om evnen til at bestemme tumorbyrde påviseligt ved en ovariecancer biomarkør protein stammer direkte fra tumorcellerne. Da aggressive serøse epitelial ovariecancer tegner sig for de fleste dødelighed blev en xenograft model ved hjælp af menneskelige SKOV-3 serøse ovariecancer celler etableret for at modellere progression til dissemineret carcinomatose. Ved hjælp af en fremgangsmåde til lavmolekylært protein berigelse, efterfulgt af væskekromatografi og massespektrometri-analyse blev et humant-specifik peptidsekvens af S100A6 identificeret i sera fra mus med fremskredent eksperimentel ovariecarcinom. S100A6 ekspression blev dokumenteret i kræft xenografter samt fra æggestokkene kræftpatient væv. Longitudinal undersøgelse viste, at serum S100A6 koncentrationen er direkte relateret til tumor byrde forudsigelser fra en omvendt regression kalibrering analyse af data fra et rengøringsmiddel-suppleret antigen capture immunoassay og hel-dyr selvlysende optisk billeddannelse. Resultatet fra dyremodel blev bekræftet i humane kliniske materiale som S100A6 viste sig at være signifikant forhøjet i sera fra kvinder med fremskreden æggestokkræft i forhold til dem med tidligt stadie sygdom.

Konklusioner

S100A6 udtrykkes i æggestokkene og andre kræft væv, men er ikke tidligere blevet dokumenteret i ovariecancer sygdom sera. S100A6 findes i serum i koncentrationer, der korrelerer med eksperimentel tumorbyrde og med klinisk sygdom fase. Dataene betyde, at S100A6 kan vise sig nyttige i at opdage og /eller overvågning ovariecancer, når det bruges sammen med andre biomarkører

Henvisning:. Wei BR, Hoover SB, Ross MM, Zhou W, Meani F, Edwards JB et al. (2009) Serum S100A6 Koncentration forudser Peritoneal Tumor Burden i mus med Epithelial kræft i æggestokkene og er forbundet med Advanced Scene i patienter. PLoS ONE 4 (10): e7670. doi: 10,1371 /journal.pone.0007670

Redaktør: Irene Oi-Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Juni 25, 2009; Accepteret: September 29, 2009; Udgivet: 30 oktober 2009

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Intramural Research Program, center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda , Maryland, og ved en bevilling fra Instituto Superiore Di Sanita, for Italien under USA-ITALIEN Oncoproteomics Program. BRW og RMD er medarbejdere i de videnskabelige Applications International Corporation-Frederick, Inc., Frederick, Maryland, på kontrakt til National Cancer Institute Intramural Research Program (Award N01-CO-12400). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene (OVCA) tegner sig for kun 4% af kræfttilfælde hos kvinder, men det er den femte hyppigste årsag til kræft død og den mest dødbringende gynækologisk cancer i denne population [1]. I 2008 var der en anslået 21,650 nye tilfælde og 15,520 dødsfald i [1] USA. Cisplatin, en platinbaseret kemoterapeutiske introduceret i 1978, er blevet en væsentlig del af en OVCA kemoterapi regime og har forbedret resultatet af tidlig fase OVCA [2]; 5-årige overlevelsesrate for fase I-patienter er større end 94% (http //: seer.cancer.gov/csr/1975_2006). Desværre er OVCA sjældent diagnosticeres på et tidligt tidspunkt, når sygdommen er begrænset og ofte asymptomatisk. Næsten 70% af OVCA tilfælde opdages på formidles stadier, dvs. iscenesætter III og IV, hvor den 5-årige overlevelsesrate falder til 30% eller mindre.

En presserende OVCA prioritet forskning er opdagelsen og validering af biomarkører nyttige til diagnosticering de mest dødbringende typer OVCA, som ofte fremskridt hurtigt [3]. Den eneste tilgængelige FDA-godkendte ikke-invasiv procedure for kræft i æggestokkene diagnose til dato er måling af serum CA-125 niveauer. Selv om 80% af patienter med fremskreden OVCA har forhøjet serum CA-125, der er en høj falsk positiv rate forbundet med CA-125 test [4] – [6]. Fysiske betingelser, såsom graviditet, pelvic inflammatory disease, godartede cyster, uterusfibromer, eller infektion kan også øge serum CA-125 niveauer [7], [8]. Andre maligniteter, herunder pancreas, lunge, bryst, gastriske og tyktarmskræft har også vist sig at forøge serum CA-125 [4], [8].

Fremkomsten af ​​massespektrometri (MS) proteomics teknologi har bragt ny muligheder for at opdage specifikke protein markører for tidlig OVCA påvisning. Humant serum står som en attraktiv model for biomarkør opdagelse bruger MS fordi erhvervelse prøve er minimalt invasiv, og serum er standard fysiologisk væske, der anvendes til diagnostiske formål. Men kompleksiteten og dynamikken fra proteinkoncentration serum gør analyse af en total serum proteom udfordrende; serum proteinkoncentrationer varierer 9 størrelsesordener og 99% af total serum protein masse udgøres af kun ca. 22 proteinarter [9]. Sådanne udfordringer forbundet med serum proteomics for biomarkør opdagelse vil ikke blive let overvindes [8], [10]. Derfor bør yderligere eksperimentelle metoder inkorporerer MS teknologi og serum prøve behandling undersøges med henblik på at opdage klinisk relevante OVCA biomarkører. Faktisk har metoder såsom udtømning af rigelige proteiner under anvendelse affinitetssøjler og proteinfraktionering blevet anvendt til at øge sandsynligheden for at afdække tumorafledte proteinarter, som ofte i lav tæthed [11]. En tilgang holder betydeligt potentiale er analyse af lavmolekylære serum proteom /peptidindhold [12]. Lav molekylvægt (LMW) proteiner og peptider ofte binde til højmolekylære serumproteiner, og dermed forlænge halveringstider LMW fraktionen i omløb [13] – [15]. Således serum LMW proteom repræsenterer en attraktiv reservoir, hvor tumorafledte lave rigelige proteiner og peptider kan bevares bedre og potentielt detekteret.

Udvikling og anvendelse af OVCA dyremodeller kan tjene som supplerende hjælpemidler i påvisning og bekræftelse forudsigende serum biomarkører. Brugen af ​​dyremodeller har udsigt til at minimere nogle af de dybe genetiske og miljømæssige variation ofte stødt i humane proteomanalyse undersøgelser, hvor upartiske kontrolprøver er ofte vanskeligt at opnå [16]. Sådanne undersøgelser med humane cancer xenograftmodeller er tidligere blevet publiceret [17] – [20]. Transplantation af human cancer i immundefekte mus er en nyttig model for opdagelsen af ​​proteom serum eller plasma profiler, der korrelerer med tumorbyrde. Disse modeller har den fordel at tilvejebringe midler til at bestemme, om biomarkør af interesse afledes direkte fra cancercellen eller er et produkt af værtens respons fordi man kan undersøge tilstedeværelsen af ​​tumor celle-afledte humane proteiner. Target biomarkører identificeret af MS kan derefter yderligere valideret i sådanne modeller, hvilket øger sandsynligheden for at opnå en patologisk relevant markør. Derfor blev en human OVCA musemodel etableret i et forsøg på at skelne ovariecancer-afledte proteiner i serum under anvendelse af MS-baserede opdagelse. Denne fremgangsmåde afslørede tilstedeværelsen af ​​S100A6, foruden andre humane proteiner, i sera fra mus med OVCA. Ekspression af S100A6 blev yderligere undersøgt i humane cancercellelinier og væv afledt fra OVCA patienter. Desuden blev søgt et system til at korrelere mængden af ​​serum S100A6 og tumorbelastning i modellen. Sidstnævnte Målet bestræber sig på at begynde at behandle vigtige ubesvarede spørgsmål vedrørende en tumorstørrelse nødvendigt for at muliggøre

de novo

påvisning af protein underskrifter fra massen i blodet. Endelig vi forsøgt at validere udtrykket profil S100A6 i humane sera ved hjælp af et velkontrolleret klinisk studie sæt af kvinder med tidlige og fremskredne stadie ovariecancer.

Resultater

En generel eksperimentel tilgang til opdage LMW serumproteiner med mulig relevans for human OVCA i en musemodel hjælp af MS er afbildet i figur 1. efter intraperitoneal (ip) injektion af mus med humane serøse SKOV-3 OVCA celler eller saltvand kontrol blev blod udtaget prøver på forskellige tidspunkter, mens tidlige, progressive carcinomatose blev modelleret. LMW serum proteom blev analyseret for at identificere proteiner der er specifikke for, eller mere rigelige i, cancer-bærende mus. Tilstedeværelsen af ​​tumor-afledt S100A6 protein i serum blev yderligere undersøgt som en kandidat biomarkør hjælp antistofbaserede analyser. Tumorbyrde blev korreleret med tilstedeværelsen eller niveauet af serum-protein S100A6 i modellen, som derved kunne anses for en formodet biomarkør. Grundlaget for yderligere validering af kliniske relevans af disse fund for OVCA patienter blev lagt ved påvisning af mere rigelige S100A6 i sera fra kvinder med fremskreden sygdom, sammenlignet med tidligt stadie sygdommen.

For at bestemme om kræft-afledte proteiner har kandidat biomarkør potentiale, (a) en bioluminescerende xenograft model, (B) ECLISA, (C) Western blot, og (D) OVCA vævsarray immunhistokemisk (IHC) anvendes. Dette blev fulgt op for S100A6 ved analyse af patient sera.

Discovery of OVCA Associated Serum Proteiner

Den eksperimentelle sygdom skred fra neoplastisk cellulære såning af bughinden under transplantation til dissemineret carcinomatose , efterligner progression fra regional til fjernt fremskredent stadium OVCA hos kvinder. Alle SKOV-3-podet mus udstillet flere, trinløst mellemstore infiltrative tan, solide tumorer knuder fordelt over hele bughinden ved 4 uger efter inokulering (p.i.). Dette var ledsaget af neoplastiske Udbrud i bughulen af ​​de fleste SKOV-3-podede mus. Histologisk blev mesenteriske masser består af en morfologisk variabel population af neoplastiske ovarieepitelceller. Disse celler forekom som ekspansionskraft, papillære vækster med trabekler 2-3 celler tyk, eller som faste tætte cellulære masser understøttet af begrænset fibrøst væv (figur 2A og B). Alle saltvand-podet kontrol mus forblev fri for sygdom.

(A) Repræsentant OVCA udstillinger overvejende solid tumorvækst, med dokumentation for papillære fremskrivninger og lejlighedsvise små cyster (bar = 25 pm). Indsat, højere opløsning mikrofotografi skildrer terningformet til polygonal pleomorf microcystic epitel med anisokaryosis og atypiske mitose på kræft i æggestokkene cellekerner (bar = 50 pm). (B) OVCA tumor knude implantat på uterin infundibulo-ovarie ligament (pilespids) i nærheden af ​​ovariet (pil) (bar = 25 um). Tumor implantater forekom i hele den peritoneale kavitet, peri-ovarie bindevæv, og invaderet omkringliggende væv, såsom tarme, lever og mellemgulv. Hematoxylin og eosin (H kontrol) som målt ved en t-test (p-værdi 0,05), eller et minimum af en 100% forskel i de spektrale tællinger ((kræft tæller – kontrol tæller) /(gennemsnitlig kræft og kontrol tæller) × 100%). Disse resultater er vist i tabel 1.

Efter identifikation af disse kandidat differentielt rigelige (cancer kontrol) humane proteiner, humane peptidsekvenser identificeret af MS /MS-spektre blev derefter søgte mod en muse-database til undersøge, om peptidsekvensen var homolog mellem menneske og mus og at verificere hensigtsmæssigheden af ​​sekvensen opkaldet (eller hvis der var tvetydighed i aminosyre betegnelse). Proteiner blev klassificeret ved at have (1) human-specifikke peptider kun, (2) peptider homologe med både menneske og mus, og (3) både 1 og 2 (tabel 1). Proteiner identificeret ved humane-specifikke peptider er potentielt større værdi, eftersom de mest sandsynligt stammede fra de xenotransplanterede humane cancerceller.

S100A6 blev udvalgt til yderligere undersøgelse. Ud over at opfylde kriterierne for signifikans er fastsat for at differentiere cancer associeret serumproteiner fra kontrol prøver (tabel 1), blev S100A6 betragtet som en kandidat til yderligere validering på grund af dets øgede udtryk i en række forskellige menneskelige kræftformer og dens relativt lille størrelse (10,5 kDa ). I sidstnævnte henseende S100A6 var attraktivt for dets potentiale til at være et intakt protein fremkommer ved LMW adskillelse strategi bruges til at berige for proteiner med molekylvægt mindre end -25 kDa. Som vist i tabel 1, blev identificeret tre S100A6 peptider; to sekvenser er fælles for de humane og muse versioner af dette protein (rød og blå fonte) og et peptid unikke for den humane version (grøn skrift) (figur 3A). MS /MS-spektret anvendes til at identificere unikke humane peptid, LMEDLDR, er vist i figur 3B. Den tilsvarende muse sekvens har en asparaginsyre i den tredje rest position, i stedet for den glutaminsyre i den humane sekvens. Tilstedeværelsen af ​​denne humane-specifikt peptid blev efterfølgende bekræftet i en anden MS /MS-analyse udført på serumprøver opsamlet fra tumorbærende mus i den tredje gruppe af dyr (se Materialer og fremgangsmåder).

(A ) Aligned mennesker og mus S100A6 sekvenser skildrer 3 aminosyre forskelle mellem de to arter (lodrette poster). Tre peptider blev påvist ved LC-LTQ MS /MS fra tumorbærende musesera; sekvenser er vist i farve font. Peptider i rød og blå skrift er homologe til mennesker og mus, mens peptidsekvensen i grøn skrift er unik for humant S100A6, grundet én aminosyre forskel. (B) MS /MS-spektrum af det humane specifikke S100A6 peptid, LMEDLDR. Denne sekvens blev ikke påvist i saltvand-podet kontrol mus sera.

Angivelse af S100A6 i OVCA

En anti-S100A6 immunoblot blev udført for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​intakt S100A6 i mus sera anvendes i MS-analyser. Ved hjælp af en tilpasset anti-humant S100A6 antistof, C1, en 10,5 kDa bånd svarende til molekylvægten af ​​S100A6 blev detekteret i samlede sera opsamlet 4 uger p.i. fra tumorbærende mus anvendes til indledende MS-analyser (figur 4A). S100A6 blev ikke påvist i sera fra matchet-studie saltvand-kontrol mus. C1 anti-S100A6 immunoblot blev også udført på yderligere serie af sera udtaget prøver fra individuelle SKOV-3-celle-injicerede dyr med eksperimentel slutstadiet sygdom, samt sera fra naive kontroldyr; den S100A6 10.5 kDa bånd blev kun observeret i sera fra dyr med tumorer, ikke i kontrol musesera (data ikke vist). Evidens for S100A6 proteinekspression i OVCA xenotransplantater og mus abdominale organer blev undersøgt under anvendelse af immunhistokemi (IHC). S100A6 immunolabeling blev observeret i tumorvæv, men ikke i omgivende mesenterium eller abdominale organer (tarme, lever, nyre, urinblære, milt, pancreas, uterus, og ovarie) (figur 4B og C).

(A) immunoblotanalyse for tilstedeværelsen af ​​S100A6 i puljet rå sera fra kræft-bærende mus (1) og saltvand kontrolmus (2). Seraene blev anvendt i LMW proteinfraktion forberedelse til MS-analyse i biomarkør opdagelse. (B) OVCA implanteret udtrykker S100A6 som analyseret ved IHC. Tumor xenograft implantat på intestinal mesenterium afslører S100A6 protein begrænset til tumor, med manglende immunolabeling i tilstødende tarme og mesenterium. (C) Serial sektion fra væv vist i B, anvendes til IHC reaktion kontrol afslører manglende immunoreaktivitet når primære S100A6 antistof udelades fra IHC. Immunoperoxydase, hæmatoxylin kontrastfarve (Bars = 50 um).

Den potentielle kliniske relevans af at finde S100A6 i sera fra mus med SKOV-3-xenografter blev yderligere undersøgt ved at undersøge ekspressionen af ​​S100A6 i andre OVCA menneske patient-afledte prøver vha Western blot. I parret kræft og matches normalt ovarie lysater fra 2 patienter, blev S100A6 forhøjet i carcinoma væv sammenlignet med sine matchede ikke neoplastiske ovariale væv (figur 5A og B). Humane OVCA-afledte cellelinier udtrykte forskellige niveauer af S100A6 (figur 5C og D). Alle OVCA celler testet, undtagen OVCAR-4 og cellelinie afledt fra klar celle ovariecarcinom (ACI-89-2), udtrykt S100A6 højere end baggrundsniveauet (normal ovarie). Salg

(A og B) Forbundne lysater af OVCA (kræft) og tilstødende normal ovarie væv (normal) fra 2 OVCA patienter blev slettet for S100A6 udtryk. SKOV-3-cellelysat blev anvendt til sammenligning. (C og D) S100A6 ekspression i OVCA cellelinier fra NCI60 (SKOV-3, OVCAR-3, 4 og 5) samt cellelinjer afledt fra OVCA patienter (se også materialer og fremgangsmåder).

for yderligere at afgrænse forskellen S100A6 udtryk i humane OVCA patient væv, undersøgelse af maligne, grænsetilfælde, godartede og noncancerous ovarie væv blev udført ved hjælp af IHC. Vævssnit mangler S100A6 immunreaktivitet, svarende til observationer i IHC negativ reaktion kontrol, blev anset for negativ. Immunreaktivitet klart over negative kontrol blev tildelt som positiv. Prøver med par numre af svagt positive celler blev anset tvetydig. Blandt 140 maligne OVCA prøver, 116 (83%) var positive for S100A6 immunolabeling (tabel 2). High S100A6 positive forekomst (over 80%) blev observeret i alle maligne typer OVCA med undtagelse af clear cell carcinoma, hvoraf kun 2 ud af 4 prøver var S100A6 positive. Næsten 85% af godartede adenomer udviste positiv S100A6 reaktivitet samt; mærkningen intensiteten var sammenlignelig med ondartet OVCA. Ingen tilsyneladende sammenhæng mellem mærkning intensitet og kræft scene eller klasse blev observeret. Derimod normale ovariale væv og ikke-neoplastisk væv tilgrænsende til tumorer udviste begrænset eller ingen mærkning S100A6. Disse resultater, der viser, S100A6 ekspression i en række forskellige patient-afledt epiteliale æggestokkene cancercellelinier og væv, fastslå, at ekspression af S100A6 i OVCA er ret almindelig. I denne sammenhæng finder humanspecifikke S100A6 peptidsekvens i serum fra humane OVCA-bærende mus viser, at S100A6 kan have gavn som kandidat-protein til overvågning OVCA. Desuden positivt udtryk for S100A6 i benigne og maligne OVCA i modsætning til sin virtuelle fravær på overfladen af ​​normale æggestok, foreslår S100A6 kan være egnet som en markør i diagnostisk billeddannelse for at finde og bekræfte æggestokkene proliferative forandringer.

serum S100A6 Level korrelerer med OVCA tumorbyrde

for at afgøre, om mængden af ​​S100A6 i serum kunne bruges som et korrelat til at estimere tumor byrde,

in vivo

bioluminescerende billedbehandling og en modificeret ELISA-assay (ECLISA) blev anvendt. For det første at fremlægge skøn over tumor byrde i celletal blev 35 dyr injiceret med varierende antal luciferase udtrykker SKOV-3-celler (SKOV-3-Luc) og

in vivo

bioluminescerende fotonsignaler blev kvantificeret (anden kohorte , human Ovarian Cancer Animal Model, materialer og metoder). Regressionsanalyse blev udført på (log

10) foton output vs. (log

10) antal inokulerede celler til at producere en standard kalibreringskurve (figur 6A). En omvendt forudsigelsesligningen (se materialer og metoder) blev afledt fra regressionsanalysen til opnåelse estimater af celleantal, dvs., forudsagde tumorbelastning fra fotonflux produktion af levende dyr.

(A) fotonflux målinger foretaget fra mus, der huser definerede antal bioluminescerende SKOV-3-Luc celler i bughulen. Regressionsanalyse blev udført på (log

10) foton output vs. (log

10) antal inokulerede celler til at producere en standard kalibreringskurve ved anvendelse af en invers forudsigelsesligningen (se Materialer og fremgangsmåder). Dette blev anvendt til at forudsige tumorbelastning fra fotonflux målinger (se figur 6C). (B) sammenligning af serum S100A6 i tumorbærende (T, lukkede cirkler) og saltvand-inokuleret kontrolmus (SC, åbne cirkler). Serum S100A6 koncentrationer, testet som individuelle prøver fra flere mus ved ECLISA (afbildet som individuelle værdier med vandret linie ved medianværdi), var signifikant forskellige mellem T vs. SC ved hver af tre gange testet efter inokulering, 9 dage (p = 0,015) , 15 dage (p = 0,036) og 21 dage (p = 0,0031) (Wilcoxon Rank Sum-test). (C) Sammenhæng mellem skøn over tumor byrde i OVCA carcinomatose og koncentration af serum S100A6, som målt ved ECLISA fra tumor-bærende mus (r = 0,79, p 0,0001).

For at afgøre, om serum S100A6 niveauer eskalerede som tumorbyrde steg med tid på studiet, blev musene injiceret med SKOV-3-Luc eller saltvand (tredje kohorte, human Ovarian Cancer Animal Model, materialer og metoder). På dagene 9, 15, 21 og 28 p.i., alle SKOV-3-Luc-inokulerede mus optisk afbildede at finde et foton output fra voksende cancere. Fotonflux data blev derefter omdannet til estimater af

in vivo

tumorceller byrde. Ti dyr hver fra tumorbærende og kontrolgrupper blev tappet og fjernet fra undersøgelsen på hvert tidspunkt; serum S100A6 niveau blev kvantificeret ved ECLISA for alle studier mus. Sammenligninger af serum S100A6 koncentration fra tumorbærende mus og saltvandsinjicerede kontroller viste, at så tidligt som 9 dage p.i., der var signifikant større serum S100A6 i tumorbærende mus, længe før nogen identificerbare tumormasser til stede; den betydelige forskellen serum S100A6 niveau varede gennem dag 15 til dag 21 p.i. (Figur 6B). Mest dag 28 p.i. serumprøver blev brugt til MS /MS-analyse, og antallet af resterende serumprøver var utilstrækkelige til dette statistisk sammenligning.

Sammenhængen mellem tumor byrde og S100A6 niveau serum i prøver fra disse samme SKOV-3-Luc -injiceret mus søgtes næste. Når tumorbyrde (celleantal) blev plottet mod serum S100A6 proteinkoncentration i disse dyr, resultater viste en meget signifikant korrelation (r = 0,79, p 0,0001); serum S100A6 koncentration var større tumoren voksede derfor over tid for dyr, der fik SKOV-3-Luc (figur 6C). Mængden af ​​S100A6 i saltvandsinjicerede kontrolmus forblev nær et basalt niveau på alle undersøgelse tidspunkter, typisk tilnærme den nedre grænse for S100A6 ECLISA detektion (figur 6B, SC). Eskalerende koncentrationer af S100A6 blev også observeret i sera opsamlet serielt ved 1, 2, og 4 uger p.i. fra individuelle mus i den indledende kohorte af 20 mus, der fik den parentale SKOV-3 cellelinie (data ikke vist).

Serum S100A6 Niveauer i human OVCA Study Sets er knyttet til Disease Stage

I for at afgøre, om der var en sammenhæng mellem forhøjet S100A6 protein og tumor byrde hos kvinder med OVCA, vi udførte et pilotforsøg ved hjælp af et velkontrolleret humane kliniske studie sæt af 66 diagnostiske serumprøver, der var til rådighed for os gennem USA-ITALIEN Oncoproteomics Program. Sera var indhentet før behandling fra kvinder med tidlig fase (I-IIb) og borderline OVCA (n = 23), og fra kvinder med fremskreden fase (IIc-IV) sygdom (n = 43). Immunblots, med C1 anti-S100A6, blev udført på en omvendt fase-protein microarray (RPMA) slide. Ved hjælp af denne teknik, blev der fundet niveauer af S100A6 at blive statistisk forhøjet i sera af kvinder med fremskreden sygdom sammenlignet med dem med fase tumorer tidligt (p = 0,031), hvilket viser en sammenhæng mellem kliniske funktioner i større tumor byrde og øgede niveauer af S100A6 i OVCA patienter (figur 7).

Scatterplot viser relativ intensitet af serum S100A6 værdier for kvinder med tidlig fase (åbne cirkler, n = 23) og avancerede trin (udfyldte cirkler, n = 43) OVCA. Den tidlige fase sygdomsgruppe omfatter 2 tumorer diagnosticeret som borderline OVCA. Midlerne til de relative intensitet værdier af analytkoncentrationer vist (vandrette linjer) er signifikant forskellige for de to grupper (p = 0,031, to-stikprøve t-test), og skildrer relativt større gennemsnitlig S100A6 koncentration i sera fra stadie patienter avancerede.

diskussion

S100A6 blev identificeret i sera fra mus med human OVCA ved hjælp af en MS /MS-baserede bottom-up proteomics strategi i et forsøg på at opdage kandidat biomarkører afledt af tumor masse . Den menneskelige tumor-oprindelse S100A6 blev etableret for modellen, og serumkoncentrationen af ​​S100A6 korreleret med mængden af ​​eksperimentel kræft til stede. Yderligere klinisk relevans blev demonstreret gennem opdagelsen af ​​potentialet for serum S100A6 at korrelere med tumorbyrde anvendes humane kliniske studier sæt.

Under opdagelsen fase, blev et serum separationsmetode til isolering LMW proteom anvendes til at berige proteiner /peptider cirkulerer i relativt lav tæthed, som omhandler kompleksiteten af ​​hele serum proteomanalyse. Den menneskelige SKOV-3 celle xenograft musemodel gav mulighed for at vurdere artsforskelle i bestræbelserne på at klassificere kræft-associerede proteom enten tumor-afledt (human) vs. host reaktion (mus). Mere i dybden kliniske valideringsundersøgelser er berettiget til at undersøge mulighederne for serum S100A6 at tjene som en kandidat biomarkør for evaluering af kvinder med OVCA, især til overvågning af tilbagefald. Denne forudsætning støttes af følgende beviser: (1) tilstedeværelsen af ​​en human-specifik peptidsekvens af S100A6 i sera, (2) påvisning af S100A6 proteinekspression i eksperimentelle tumorer, men ikke i omgivende ikke neoplastiske musevæv, (3) et positiv og direkte korrelation mellem S100A6 serumkoncentration og tumorbelastning i xenograft model, (4) påvisning af forhøjet S100A6 ekspression i væv og cellelinier fra OVCA patienter, men sjældent i normalt ovarie, i denne og andre undersøgelser [21], [22 ], og endelig, (5) signifikant forhøjelse af analytten i sera fra kvinder med fremskreden fase OVCA vs. kvinder med tidlig stadie sygdom. Begrænsning indledende screening i mus til SKOV-3 cellelinie i dette tilfælde derfor ikke til hinder for, at identificere en mulig klinisk surrogat biomarkør for yderligere validering. Yderligere menneskelige OVCA væv-associerede proteiner blev også rapporteret i serum ved hjælp af denne metode, og disse kan testes yderligere for kandidat biomarkører potentiale ved hjælp af strategi anvendes her.

S100A6 blev forfulgt til den indledende validering som kandidat serum biomarkør grund om associering med cancer progression [22], [23]. S100A6 er en lille calcium-bindende protein, der hører til S100 proteinfamilien. De cirka 25 medlemmer af S100 familien er kendetegnet ved 2 EF-hand strukturer og sandsynligvis har calcium sensor funktion [24]. S100-proteiner er blevet impliceret i en lang række fysiologiske og patologiske processer, herunder celleproliferation, differentiering og intracellulær signalering, selvom deres nøjagtige funktioner stadig skal defineres yderligere [24] – [27]. Med hensyn til S100A6, er dets ekspression normalt findes i fibroblaster og epitelceller [28], og forhøjede S100A6 er blevet rapporteret i et antal humane cancertyper, herunder carcinomer i colon, pancreas, bryst, ovarie, lunge og skjoldbruskkirtlen [29] – [35]

Der er modstridende rapporter om den rolle S100A6 spiller i kræft.. Vimalachandran et. al. [29] undersøgt ekspressionsmønsteret for S100A6 som det vedrørte kliniske resultater i bugspytkirtelkræft og S100A6 ekspression var en negativ prognostisk faktor. Høj, især nuklear, blev ekspression af S100A6 forbundet med en dårlig prognose. Desuden er der rapporteret en trinvis forøgelse af S100A6 under pancreas carcinogenese [36]. Derimod forhøjede niveauer af S100A6 faldt mobilitet osteosarcomceller og var forbundet med nedsat klinisk tydelige metastaser [37]. Tilsvarende blev forøget S100A6 udtryk forbundet med en overlevelse fordel for ikke-småcellet lungekræft [35]; S100A6 blev påvist i 2 lungekræft patienters sera, og i pleural effusion af en. I den foreliggende undersøgelse har vi udvidet værdien af ​​S100A6 at medtage det som en OVCA serum biomarkør ved at demonstrere positivt udtryk i menneskelig OVCA hjælp immunhistokemi, samt en sammenhæng mellem S100A6 serum niveau og tumor byrde hos både mus og humane patienter. Den omstændighed, at S100A6 suppleres af en række humane cancere, antyder, at dets anvendelse som en eneste biomarkør kan støde potentielle falske positive forekomster, beslægtet til CA-125. Derfor inkorporerer S100A6 ind et panel af kræft biomarkører repræsenterer en logisk tilgang, der skal forfølges.

Den lave forekomst af OVCA gør oprettelse og validering af kliniske biomarkører ved hjælp af humane prøver vanskelig. Kun 1 ud af 2500 postmenopausale kvinder skønnes at blive påvirket af OVCA årligt [38], [39]. På grund af denne lave forekomst, population screening kræver et stort antal patienter, og derfor er meget dyrt for OVCA biomarkør opdagelse og validering. Derfor anvendelse af en dyremodel kan være en omkostningseffektiv måde at tilvejebringe prækliniske data til at retfærdiggøre en stor klinisk valideringsstudie. Ved hjælp OVCA dyremodeller til dette formål nødvendiggør troskab til både eksperimentelle mål og den gentog kardinal funktioner i human sygdom biologi.