PLoS ONE: humane cancerceller Behold Beskedne Niveauer af enzymatisk aktivt Matriptase Kun i Ekstracellulær Milieu efter Induktion af zymogen Activation

Abstrakt

Den type 2 transmembrane serinprotease matriptase er bredt udtrykt i humane carcinomer og hæmatologiske kræftformer. Den proteolytiske aktivitet af matriptase er et potentielt mål af narkotika og billedbehandling prober. Vi vurderede skæbne aktiv matriptase efter induktion af matriptase zymogen aktivering. Udsættes otte humane carcinomceller til pH 6,0 puffer induceret robust matriptase zymogen-aktivering efterfulgt af hurtig hæmning af den spirende aktive matriptase ved hepatocytvækstfaktor aktivator inhibitor (HAI) -1. Følgelig blev der ikke enzymatisk aktivt matriptase påvist i disse celler. Nogle aktive matriptase er imidlertid hurtigt stald til det ekstracellulære miljø, som disse carcinomaceller. Manglen på celle-associeret aktiv matriptase samt afgivelse af aktive matriptase blev også observeret i to hæmatologiske cancer linjer. Matriptase udgydelse er tæt korreleret med induktion af matriptase aktivering, tyder på, at matriptase aktivering og kaste er kinetisk koblede. Koblingen tillader en andel af aktiv matriptase at overleve HAI-1-inhibering ved hurtig udskillelse fra celleoverfladen. Vores undersøgelse tyder på, at cellulære fri, aktiv matriptase er knappe og måske ikke være en effektiv mål for

in vivo

billedbehandling og lægemiddeludvikling

Henvisning:. Chu LL, Xu Y, Yang JR, Hu YA, Chang HH, Lai HY, et al. (2014) humane cancerceller Behold Beskedne Niveauer af enzymatisk aktivt Matriptase Kun i Ekstracellulær Milieu efter Induktion af zymogen Aktivering. PLoS ONE 9 (3): e92244. doi: 10,1371 /journal.pone.0092244

Redaktør: Jian Cao, Stony Brook University, USA

Modtaget: 10. januar, 2014 Accepteret: 9. februar 2014 Udgivet: Marts 24, 2014

Copyright: © 2014 Chu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Cancer Institute (NCI) Tilskud RO1 CA 123.223 (til M. Johnson og C.-Y. Lin); Taiwan Department of Defense Grant MAB-102-08 (til J.-K. Wang); og Chi-Mei Medical Center tilskud CMNDMC-10211 (til J.-K. Wang og L.-L. Chu). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. C.-Y.L. er en opfinder på amerikanske patenter # 6.077.938 og # 6.677.377 og M.D.J. og C.-Y.L. er opfindere på US patent # 7.355.015. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Proteaser katalyserer nedbrydningen af ​​proteiner ved hydrolyse af peptidbindinger. Den regulerbare spaltning af proteiner, proteaser involveret i mange stærkt kontrollerede fysiologiske processer, såsom DNA-replikation, cellecyklusfremadskriden, celledød, angiogenese, blodkoagulation, inflammation, neurogenese og immunitet. Protease dysregulering har været impliceret i en bred vifte af sygdomme, herunder kræft og hjerte-kar-sygdomme. Proteaser er derfor anses for at være effektive mål for udvikling som lægemiddelvirkninger og biomarkører. Proteasominhibitorer, for eksempel blevet anvendt til behandling af hæmatologiske maligniteter [1], [2] og serumniveauer af proteasen PSA (prostataspecifikt antigen) er blevet anvendt som en biomarkør til overvågning af prostatacancer i forskellige sammenhænge [3]. Opfindelsen af ​​aktivitetsbaserede sonder (ABP) det muligt at vurdere protease aktivitet i levende celler eller i hele organismer [4]. Trods succes nogle lægemidler og prober imidlertid målretning proteolytisk aktivitet til udvikling af lægemiddel og biomarkører har ikke altid været meget tilfredsstillende. Så attraktive som de er, proteaser-inspirerede diagnostik og behandling har mange iboende kompleksiteter og begrænsninger, der skal tages i betragtning, før udvikling af nye lægemidler eller sonder målrettet proteaser og proteaser aktiviteter. Disse begrænsninger omfatter activational status af proteaserne, den funktionelle lokalisering af proteaserne, og endogene proteaseinhibitorer, som alle påvirker proteaseaktivitet og kan igen påvirke effektiviteten af ​​proteaseinhibitoren og prober.

Typen 2 transmembrane serin protease (TTSP) matriptase er et særligt interessant eksempel på de udfordringer, som en protease kan præsentere om sit valg som et mål for udviklingen af ​​kliniske applikationer og de strategier, der måtte være nødvendige for effektivt at ansætte hæmmere af og prober til matriptase aktivitet . Matriptase er bredt udtrykt af epitelvæv og faktisk er påkrævet for opretholdelse af epitelial integritet [5] – [7]. Matriptase er almindeligt dysreguleret i carcinomer gennem forhøjet ekspression, øget zymogen-aktivering, og en ubalance i ekspressionen af ​​matriptase forhold til hepatocytvækstfaktor aktivator inhibitor (HAI) -1, den primære endogen protease inhibitor af matriptase aktivitet [8] – [10] . Ud over epitelceller, er matriptase også udtrykkes i monocytter [11] – [13], mastceller [14], chondrocytter [15] og neurale progenitorceller [16], og matriptase har været impliceret i osteoarthritis [15] og atherosklerose [13]. Udtrykket af matriptase i mastceller tyder på, at matriptase har potentiale til at bidrage til allergi-relaterede sygdomme, såsom astma. Adskillige matriptase katalytiske hæmmere er blevet udviklet, herunder lille molekyle og peptid-baserede hæmmere. Disse matriptase hæmmere udviser stor styrke over matriptase aktivitet, når testet med

in vitro

analyser, i de fleste tilfælde, har gjort brug af rekombinant matriptase serinproteasedomænet [17] – [22]. Antistof-baserede inhibitorer specifikt rettet mod aktiv matriptase (i modsætning til den aktiverede form) er også blevet udviklet [23] og anvendes til at detektere tumorer i mus via binding til aktiv matriptase på overfladen af ​​cancerceller [24], [25].

Matriptase syntetiseres som et zymogen og undergår autoaktivering at erhverve sin potente trypsinlignende aktivitet. Aktiveringen af ​​matriptase er hurtigt efterfulgt af inhibering af den spirende aktive matriptase af proteinet HAI-1 og forbliver fastgjort til cellerne gennem transmembrandomænet af HAI-1. Det er uklart, hvor meget og hvor længe spirende gratis aktive matriptase fortsætter på celleoverfladen: parametre, der er vigtige for nogen begrundelse for udviklingen af ​​matriptase aktivitetsbaserede hæmmere og sonder til kliniske anvendelser. I den aktuelle undersøgelse, vi satte os for at vurdere skæbnen for aktiv matriptase efter induktion af matriptase zymogen aktivering i human carcinom og hæmatologiske kræftceller. Uanset omfanget af matriptase zymogen aktivering induceret, blev der ikke frie, aktive matriptase fundet at vare på kræftcellerne. Men interessant nok, en lille andel af den aktive matriptase overlever HAI-1-inhibering ved at være hurtigt udskilles til det ekstracellulære miljø. Vores undersøgelse tyder på, at på grund af manglen på gratis aktive matriptase til stede på overfladen af ​​kræftceller, matriptase katalytiske aktivitet er usandsynligt at præsentere et effektivt mål for kliniske anvendelser.

Materialer og metoder

Kemi og reagenser

Gelatine og 5,5′-dithio-bis- (2-nitrobenzoesyre) (DTNB) blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); N-tert-butoxycarbonyl (Boc) -Gln-Ala-Arg-7-amido-4- methylcoumarin (AMC) blev indkøbt fra Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY); Føtalt bovint serum (FBS) blev opnået fra Omega Scientific (Tarzana, CA).

Celledyrkning Salg

humane brystcancerceller MCF7 og MDA-MB-468 blev opretholdt i en modificeret Forbedret Minimum Essential medium (IMEM), suppleret med 10% FBS. Humane prostatacancerceller LNCaP, PC3, og DU145, human cancer ovarieceller OVCAR-3, humane myelomatoseceller RPMI 8226-celler og humane Burkitt-lymfomceller Ramos blev dyrket i RPMI-1640-medium, suppleret med 10% FBS. Humane brystcancerceller SK-BR-3, human keratinocyt HaCaT, og humane ovariecancer celler OV-2008, blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% FBS. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Alle celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) bortset HaCaT (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim Tyskland) og OV2008 (venligt leveret af Dr. Gaetano Marverti, University of Modena og Reggio Emilia, Italien) [26] .

monoklonale antistoffer

De humane matriptase monoklonale antistoffer M24 og M69 blev brugt til immunoblotanalyser at opdage total matriptase og aktiveret matriptase henholdsvis [27] – [29]. MAb M69 immobiliseret på Sepharose-perler blev anvendt til immunodepletion studier.

Tryptic aktivitetsassay efter induktion af matriptase zymogen-aktivering

I induktion af matriptase zymogen-aktivering i carcinomceller, blev cellerne dyrket i 150 mm skåle eller plader med 6 brønde. Cellerne blev vasket med PBS tre gange og derefter inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur med 150 mM phosphatbuffer pH 6,0 (7 ml til 150 mm skåle og 1 ml til 6-brønds plade) eller 150 mM phosphatbuffer pH 8,0 som en ikke -activation kontrol. I nogle tilfælde blev PBS anvendt som ikke-aktivering kontrol. Efter inkubationen blev 2 M Trizma base, tilsat for at bringe pH til 8,0. Cellerne blev skrabet fra skålene eller brøndene til opnåelse af en kombineret suspension indeholdende en blanding af cellerne og kaste proteiner. En del af denne blanding blev underkastet centrifugering ved 10.000 rpm ved anvendelse af en Eppendorf bordcentrifuge i 1 min. Supernatanten blev opsamlet som skuret fraktion og cellepelleten blev resuspenderet i 150 mM phosphatbuffer pH 8,0 til det samme volumen som prøven før centrifugeringen til opnåelse af cellefraktion. Proceduren for skrotning af cellerne fra disken og forarbejdning ved centrifugering dosis ikke resultere i frigivelse af matriptase eller HAI-1 fra cellerne. Proceduren blev designet til at generere cellen og konditionerede buffer under identiske betingelser med hensyn til pH og ionstyrke i bufferen for den proteolytiske assay. For de to hæmatologiske cancerceller, som vokser som suspensionskulturer, forholdet mellem celleantal i forhold til volumen af ​​phosphatbuffer var 5 × 10

5 celler /200 pi buffer. Den matriptase aktivitet i 195 pi af afstødte og cellefraktioner blev vurderet ved måling 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) frigivelse fra et syntetisk substrat Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (5 pi af en 5 mM stamopløsning) i mikrofluorpladen 96-brønds sorte mikrotiterplader (Thermo Scientific). Spaltningen af ​​det syntetiske fluorogent substrat blev optaget med en Wallac 1420 Victor 2 mikropladelæser med en excitationsbølgelængde på 360 nm og afsløre emission ved 480 nm.

Immunodepletion

M69 mAb blev kovalent koblet til Sepharose 4B ved 5 mg /ml gel som tidligere [28] beskrevne. For immunodepletion blev prøverne (200 pi) inkuberet med 15 pi M69-Sepharose roterer i koldt rum i 2 timer. Supernatanten blev separeret fra perlerne ved centrifugering og opsamles som den ubundne fraktion. Perlerne blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 1% Triton X100 fire gange, hvorefter de indfangede proteiner blev elueret fra perlerne med 0,1 M glycin, pH 2,4, efterfulgt af neutralisering med 2 M Trizma base.

Western blotting

Celler blev lyseret i PBS indeholdende 1% Triton X-100 og 1 mM DTNB. DTNB sattes til lyseringspuffer at forhindre spaltning af disulfidbindinger [30]. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-proteinassay og lige mængder af proteiner eller lige dele cellelysater og konditionerede puffere blev analyseret ved Western blot. Proteinprøver blev fortyndet i 5 × prøvebuffer indeholdende nogen reducerende middel og inkuberet ved stuetemperatur i 5 min. Proteiner blev adskilt ved 7,5% SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembraner, og derefter probet med de forskellige mAb’er. Bindingen af ​​mAb’er blev påvist under anvendelse HRP-konjugerede sekundære antistoffer, og visualiseret under anvendelse af Western Lightening® Kemiluminescens Reagent Plus (Perkin-Elmer, Boston, MA).

gelatinezymografi

Gelatine geler blev støbt ved tilsætning gelatine (slutkoncentration 1 mg /ml) til 7,5% SDS polyacrylamidgeler. Proteinprøver blev inkuberet med SDS-prøvebuffer ved stuetemperatur i 5 minutter i fravær af et reduktionsmiddel. Efter elektroforese blev gelatinegelerne vasket med 2,5% Triton X-100 /PBS tre gange og derefter inkuberet in100 mM Tris-buffer pH 8,0 ved 37 ° C natten over. De geler blev derefter farvet med Coomassie Brilliant Blue.

Resultater

MCF7 brystkræftceller konstitutivt aktivere matriptase men den gratis aktive matriptase ikke forblive forbundet med cellerne

For at begynde at undersøge, om matriptase proteolytisk aktivitet associeret med brystcancerceller kan anvendes som et mål for udvikling af lægemidler og /eller billeddannende prober, målte vi spaltning af substratet Boc-Gln-Ala-Arg-AMC ved MCF7 brystcancer celler før og efter induktion af robust matriptase zymogen-aktivering (fig. 1A). Matriptase zymogen-aktivering tilsyneladende forekommer konstitutivt i MCF7-celler, da 120-kDa matriptase-HAI-1-kompleks let blev påvist ud over den 70-kDa matriptase zymogen i cellelysater forud for induktion af matriptase zymogen-aktivering (fig. 1A bane 1) . Efter induktion af matriptase zymogen-aktivering ved eksponering af cellerne til pH 6 puffer i 20 min [27], [31], [32], en stor del af 70k-Da matriptase zymogen blev omdannet til 120 kDa matriptase-HAI- 1-kompleks (fig. 1A bane 4). Dernæst måles mængden af ​​tryptisk aktivitet forbundet med MCF7 under konstitutive eller syreinduceret betingelser, som giver de to forskellige niveauer af matriptase aktivering. I betragtning af den mulighed, at HAI-1 kan binde til og inhibere det aktive matriptase efter begge proteiner var blevet befriet fra cellemembranen, målte vi tryptiske aktivitet associeret med overfladen af ​​cellerne i fravær af ikke-ionisk detergent Triton X-100 . Under disse betingelser var der næsten ingen spaltning af de fluorescerende substrater fra de MCF7-celler, om matriptase aktivering var konstitutiv eller robust induceret af syre eksponering (fig. 1B, kurve 1 og 4). Disse data antyder, at disse brystcancerceller ikke beholder frie, aktive matriptase uanset niveauerne af matriptase zymogen-aktivering.

A.

MCF7 humane brystcancerceller blev inkuberet med en buffer pH 6 at fremkalde matriptase zymogen aktivering (

a.

højre, Act.) eller med den pH 6 suppleret med 150 mM NaCl som en ikke-aktivering kontrol (

a.

venstre, ikke-handling .). Cellelysater fremstilledes, og prøver opbevares til analyse (bane 1 og 4). De resterende cellelysater blev underkastet immunodepletion med den aktive matriptase-specifikke mAb M69 immobiliseret på Sepharose-perler til at udtømme den aktiverede matriptase, overvejende den 120 kDa-kompleks (bane 2 og 5, og D). Antistof-bundet aktiveret matriptase blev udvundet ved en pH 2,4 puffer eluering efterfulgt af pH-neutralisering (bane 3, E). Disse prøver blev derefter analyseret for matriptase arter ved SDS-PAGE (uden kogning af prøverne eller anvendelse af reduktionsmidler) og Western blot under anvendelse af samlede matriptase mAb M24.

B.

Cellerne, de immundepleteret lysater, og eluaterne blev analyseret tryptisk aktivitet ved spaltning af et syntetisk fluorogent substrat med Arg som P1 site. For tryptiske assay cellerne forblev intakt i fravær af Triton X-100. NA står for ikke-aktivering; L for lastning af immunodepletion, D for immundepleteret fraktion; E for eluerede fraktion; A til aktivering; RFU for relativ fluorescerende enhed.

Manglen på fri, aktiv matriptase forbundet med cellerne skyldes den hurtige hæmning af aktiv matriptase af HAI-1. Tidligere genererede vi en matriptase monoklonalt antistof, som specifikt genkender og binder til den aktiverede form af matriptase (uanset om det er i et kompleks med HAI-1), uden at krydsreagere med matriptase zymogen [33], [34]. Vi anvendte denne mAb, M69, der er koblet til kugler, for at fjerne enhver aktiveret matriptase, der var til stede i cellelysaterne efter immunodepletion. Som forventet blev den 120-kDa matriptase-HAI-1-kompleks effektivt fjernet fra MCF7 cellelysater ved denne fremgangsmåde (fig. 1A, sammenligne bane 2 og 5 med bane 1 og 4, henholdsvis). Den 70-kDa matriptase proteinbånd til stede i begge prøver blev ikke forårsaget af den aktiverede matriptase mAb, hvilket viser, at 70-kDa matriptase proteinbånd i begge præparater indeholder lidt eller ingen aktiv matriptase og er matriptase zymogen. Som forventet immundepleteret prøver havde ingen spaltning aktivitet mod det fluorescerende substrat (fig. 1B). De aktiverede matriptase arter bundet til M69 mAb-sepharose-perler, der anvendes til immunodeplete prøverne blev elueret under anvendelse af pH 2,4 glycinbuffer. Vi har tidligere vist, at denne sure buffer forårsager dissociation af matriptase-HAI-1-komplekset [33]. Neutralisering resulterer typisk i re-sammenslutning af nogle af de HAI-1 og aktiv matriptase efterlade resten af ​​den dissocierede aktive matriptase i kompleksbundet form, efter neutralisering af eluatet med det resultat, at den aktive matriptase blev påvist ved Western blot-analyse ved anvendelse af en total matriptase mAb overvejende som en 70-kDa bånd. Intensiteten af ​​denne 70-kDa aktiv matriptase bånd var proportional med intensiteten af ​​120-kDa matriptase-HAI-1 komplekst bånd påvist i begge situationer (fig. 1A, bane 3 og 6). Dette dissocierede aktiv matriptase udviste tryptisk aktivitet som vurderet ved spaltning af det fluorogene substrat (fig. 1B, kurve 3 og 6). Substratet spaltningshastigheder observerede korrelerede godt med niveauerne af den aktive matriptase detekteret ved Western blot-analyse. Disse analyser bekræfter, at de 120-kDa celleassocierede matriptase arter er en inaktiveret aktiv matriptase kompleks, og at elueres 70-kDa arter er faktisk aktiv matriptase.

En del af aktiv matriptase blev udgydt til det ekstracellulære miljø

trods den hurtige HAI-1-medieret hæmning af den aktive matriptase forbundet med cellen, frit aktivt matriptase blev faktisk skur i det ekstracellulære miljø forud for HAI-1-inhibering (fig. 2). Når MCF7 brystcancerceller blev transient eksponeret til pH 6,0 puffer efterfulgt af neutralisering til pH 8,0, blev stærk tryptisk aktivitet mod det fluorescerende substrat detekteret i blandingen af ​​celler og konditionerede buffere (kaste fraktion) (fig. 2A). Når cellerne og stald fraktioner adskilt, den tryptiske aktivitet kun detekteret i skuret fraktioner (supernatant) og ikke er associeret med cellepellets. Disse data indikerer, at sammen med induktion af matriptase zymogen-aktivering, er nogle aktive proteaser med tryptisk aktivitet stald i det ekstracellulære miljø. For at løse spørgsmålet om, hvorvidt dette skur proteolytisk aktivitet stammer fra aktiv matriptase vi bestemt, hvis M69-perler kunne immunodeplete aktiviteten fra prøverne (fig. 2B og C). Immunodepletion af materialet stald fra kontrol-behandlede celler resulterede ikke i en signifikant ændring i intensiteten af ​​den 70 kDa matriptase bånd (fig. 2B, bane 1 og 2) og ingen matriptase blev påvist i materialet elueret fra perlerne (Fig . 2B, bane 3), i overensstemmelse med fravær eller lavt niveau af kaste fri, aktiv matriptase under disse betingelser. I modsætning hertil efter sur-induceret matriptase aktivering, udtømning med M69-beads reducerede signifikant niveauerne af total matriptase stede i skuret fraktion (fig. 2B, sammenlign bane 5 til bane 4), og en stærk 70-kDa matriptase båndet er stede i eluatet fra perlerne (fig. 2B, bane 6). Dette er i overensstemmelse med tilstedeværelsen af ​​frie, aktive matriptase i det konditionerede buffer fra cellerne i hvilke matriptase aktivering var blevet induceret af syre eksponering. Når analyseret for tryptisk aktivitet ved anvendelse af fluorogene substrat assayet fandt vi, at proteolytisk aktivitet dramatisk faldt efter immunodepletion (fig 2C, sammenligne kurverne A-L og A-D), hvilket bekræfter, at størstedelen af ​​den tryptiske aktivitet til stede i stalden fraktion henføres til fri, aktiv matriptase. Tilstedeværelsen af ​​aktiv matriptase i skuret fraktionen blev yderligere bekræftet ved påvisning af en 70-kDa gelatinolytisk aktivitet i skuret fraktion (fig. 2D, bane 1), og nedbrydningen af ​​70-kDa gelatinase af de aktiverede matriptase mAb perler (Fig . 2D, bane 2). Taget sammen antyder disse data, at medens MCF7 brystkræftceller konstitutivt aktiverer matriptase under normale forhold, er langt størstedelen af ​​det aktive matriptase hurtigt inhiberet af HAI-1 selvom en lille del af det aktive enzym, kan være hurtigt kaste i det ekstracellulære miljø. Udgydelse af aktiv matriptase til det ekstracellulære miljø på denne måde er i overensstemmelse med påvisning af aktiv matriptase i de konditionerede medier af brystkræftceller i vores tidlige undersøgelse [35].

A.

MCF7-celler blev induceret til at aktivere matriptase ved en pH 6,0 puffer efterfulgt af neutralisering til pH 8,0. Blandingen af ​​cellerne og bufferen (Kombiner), blev de pelleterede celler efter centrifugering (celle) og bufferen supernatant (shed fraktion) alene (Shed) analyseret for tryptisk aktivitet ved spaltning af et syntetisk fluorescerende substrat med Arg som P1 websted . RFU står for relativ fluorescerende enhed. B. kaste fraktioner indsamlet fra MCF7-celler efter induktion af matriptase aktivering (lov.), Og det ikke-aktivering kontrol (ikke-handling.) Blev udsat for immunodepletion med aktiveret matriptase mAb M69 perler. Stald fraktioner (L, bane 1 og 4), de udtømte fraktioner (D, bane 2 og 5), og de eluerede fraktioner (E, bane 3 og 6) blev analyseret for matriptase arter ved Western blot ved hjælp af mAb M24.

C.

D.

Skur fraktion opsamles fra pH 6 buffer-eksponerede MCF7-celler blev immundepleteret hjælp M69 perler. Skuret fraktion (L, bane 1) og den immundepleteret fraktion (D, bane 2) blev analyseret for tryptiske aktivitet (panel

C

) og gelatinolytisk aktivitet ved gelatinezymografi (panel

D

, Gel. zym.). RFU står for relative fluorescensenheder; A-L for aktiveret-læsning; A-D for aktiveret-udtømte.

For at bestemme om andre matriptase-udtrykkende brystcancerceller også regulere matriptase på en lignende måde til MCF7-celler, vi analyserede prøver frembragt under anvendelse MDA-MB-468 og SK -BR-3 brystkræftceller under normale forhold, og når væksten udsættes for syre-induceret matriptase zymogen aktivering. Matriptase arter og proteolytisk aktivitet blev vurderet som før gennem en kombination af fluorescerende substrat spaltning assay immunodepletion og immunoblotanalyser (fig. 3). Svarende til MCF7-celler, MDA-MB-468 celler konstitutivt aktiverer matriptase (fig. 3A bane 1), og kan induceres til robust aktivere matriptase efterfulgt af hurtig HAI-1-medieret inhibering som reaktion på cellulær eksponering for mildt sure puffer (Fig . 3A bane 2). 120-kDa matriptase-HAI-1-kompleks er specifikt immundepleteret ved anvendelse af de aktiverede matriptase mAb perler (fig. 3A bane 3) og hovedparten af ​​syren-dissocieret fri aktive matriptase blev elueret og forblev ikke-kompleksbundet efter neutralisering (fig. 3 bane 4 ). Tryptisk aktivitet blev kun detekteret i skuret fraktioner og ikke i cellefraktioner (fig. 3B), hvoraf størstedelen blev immundepleteret med den aktiverede matriptase mAb M69 (fig. 3C), hvilket bekræfter tilstedeværelsen af ​​aktive matriptase i det ekstracellulære miljø. Den tredje brystcancerceller, SK-BR3 ligner MCF7 og MDA-MB-468 med hensyn til syre-induceret matriptase aktivering (fig. 3D, bane 1), immunodepletion, og elueringen af ​​ikke-kompleksbundet aktiveret matriptase fra de aktiverede matriptase mAb perler ( fig. 3D, bane 2 og 3). Igen blev tryptisk aktivitet genereres sammen med induktion af matriptase zymogen-aktivering stald og ikke tilbageholdes med cellerne (Fig. 3 E), og størstedelen af ​​den stald tryptisk aktivitet blev afledt af aktiv matriptase (fig. 3 F).

A

og

D

: MDA-MB-468 og SK-BR-3 humane brystkræftceller blev induceret til at aktivere matriptase (eller ikke) ved pH 6 (eller kontrol) puffer-eksponering. Cellelysater fremstillet fra cellerne blev underkastet immunodepletion at fjerne aktiveret matriptase. Lysater fra ikke-aktivering kontrolceller (N), syreaktiveret celler (A), M69 depleteret lysater (D), og den eluerede fraktion (E) blev analyseret for total matriptase arter ved immunoblot under anvendelse af matriptase mAb M24.

B

og

E

. MDA-MB-468 (

B

) og SK-BR-3 (

E

) blev behandlet med pH 6,0 puffer for at inducere matriptase aktivering. Efter neutralisation, blanding af cellerne og bufferen (Combine), de pelleterede celler efter centrifugering (celle) og bufferen supernatant (shed fraktion) alene (Shed) blev analyseret for tryptisk aktivitet.

C

F

. MDA-MB-468 og SK-BR-3-cellelysater, fremstillet efter induktion af matriptase aktivering blev immundepleteret hjælp af mAb M69. Cellelysaterne (A-L) og immundepleteret fraktioner (A-D) blev analyseret for tryptisk aktivitet.

Regulering af matriptase i prostata og ovariecancerceller

Matriptase er også udtrykt i prostatacancer, og de tre mest almindeligt anvendte prostatakræft linjer, DU145, PC3, og LNCaP udtrykker alle matriptase selvom DU145 udtrykker meget mindre end de to andre linjer (fig. 4A, venstre, bane 1, 3 og 5). Alle tre linjer aktiverer matriptase som reaktion på ekstracellulær syre eksponering som angivet ved tilstedeværelsen af ​​120 kD matriptase-HAI-1-kompleks (fig. 4A, venstre, bane 2, 4 og 6), som også detekteres, når prøverne er immunblottet under anvendelse af aktiverede matriptase-specifikke mAb M69 (fig. 4A, højre, bane 2, 4 og 6). Syre eksponering af cellerne inducerede også afgivelse af tryptisk aktivitet i det ekstracellulære miljø ved PC3 og LNCaP-celler, men ikke af DU145 celler (Fig. 4 B-D). Som med de brystcancercellelinjer, at størstedelen af ​​den stald tryptiske aktivitet kaste fra, PC3 og LNCaP-celler, blev bekræftet at være forbundet med aktivt matriptase ved immunodepletion som beskrevet ovenfor (data ikke vist). Manglen på detekterbar tryptisk aktivitet skuret ved DU145 celler vises på grund af det lave niveau af matriptase ekspression i denne cellelinie. Disse data antyder, at prostatacancerceller ligner brystcancerceller vedrørende hurtig HAI-1-medieret inhibering af cellulær aktive matriptase og for afgivelse af visse niveauer af frit aktivt matriptase i det ekstracellulære miljø.

A

. De humane prostatacancerceller, DU145 (DU), PC3 (PC3) og LNCaP (LN) blev udsat for pH 6,0 (eller kontrol) puffer til at inducere matriptase aktivering. Cellelysater fra pH 6-eksponerede celler (A, bane 2, 4 og 6) og den ikke-aktivering kontrolceller (N, bane 1, 3 og 5) blev analyseret for total matriptase arter (venstre) ved hjælp af mAb M24 og aktiveret matriptase hjælp af mAb M69 (højre).

B

,

C

, og

D

. De humane prostatacancerceller, DU145 (

B Salg), PC3 (

C Salg) og LNCaP (

D

) blev behandlet med pH 6,0 puffer for at inducere matriptase aktivering. Efter neutralisering blev kombinationen af ​​cellen og stald fraktioner (kombinere) cellerne fraktioner alene (celle) og skuret fraktionen alene (stald) analyseret for tryptisk aktivitet. RFU står for relative fluorescensenheder.

To ovariekræft cellelinier, som udtrykker matriptase, OCAR3 og OV2008, blev også undersøgt og viste samme karakteristika med hensyn til matriptase aktivering induceret ved eksponering til pH 6,0 puffer med hurtig dannelse af aktiverede matriptase-HAI-1-komplekser, som blev forarmet af mAb M69 (fig. 5A). Hverken cellelinie bibeholdt celleassocieret tryptisk aktivitet, men kaste aktiviteten i bufferen, der blev verificeret til at være afledt af aktive matriptase ved immunodepletion hjælp af mAb M69 (fig. 5 B og C). Skuret matriptase udstillet gelatinolytisk aktivitet, som igen blev tømt af mAb M69 (fig. 5D).

A

. Humane ovariecancerceller OVCAR3 blev induceret til at aktivere matriptase ved pH 6,0 (eller kontrol) puffer. Cellelysater blev immundepleteret med mAb M69. Cellelysater af de ikke-aktivering kontrolceller (N, bane 1), de pH 6 aktiverede celler (A, bane 2), og den immundepleteret fraktion (D, bane 3) blev analyseret for matriptase arter ved Western blot under anvendelse af M24 mAb .

B

. og C. Fraktionerne celler (celle), de stald fraktioner (kaste), og de aktiverede matriptase-udtømte stald fraktioner (nedbryder) i OVCAR3 (

B

.) celler og OV2008 celler (

C

.) blev analyseret for tryptisk aktivitet. RFU står for relative fluorescensenheder.

D.

OV2008 humane ovariecancerceller blev induceret til at aktivere matriptase ved pH 6,0 buffer. Skuret fraktion (bane 1) og den aktiverede matriptase-udtømte skur fraktion (bane 2) blev analyseret for matriptase gelatinolytisk aktivitet ved gelatinezymografi.

Størstedelen af ​​den aktiverede matriptase spredes fra hæmatologiske cancerceller er kaste så fri aktiv matriptase

Matriptase udtrykkes også i hæmatologiske kræftceller, men, i skarp kontrast til celler af epitelial oprindelse, de udtrykker ingen eller meget lave niveauer af HAI-1 [36], [37]. At udforske matriptase aktivering og kaste dynamik i cancere af denne type vi transient udsættes RPMI 8226 humane myelomatoseceller og Ramos Burkitt lymfomceller til pH 6,0 puffer efterfulgt af indstilling til pH 8 med Tris buffer som vi havde gjort med de epiteliale cancere. Høje niveauer af tryptisk aktivitet blev påvist i blandingen af ​​celler og bufferen (shed fraktion) (fig. 6A), og når cellerne og kaste fraktioner blev adskilt ved centrifugering blev tryptisk aktivitet kun detekteret i skuret fraktion, og var ikke forbundet med cellerne. Endvidere tryptisk aktivitet blev fuldstændig fjernet, når de afstødte fraktioner blev depleteret under anvendelse af de aktiverede matriptase mAb perler, der bekræfter, at aktiv matriptase er kilden til den tryptiske aktivitet, der registreres.

A

og

B.

Ramos humane Burkitt lymfomceller (

A

) og RPMI 8226 humane myelomatoseceller (

B

) blev behandlet med pH 6,0 buffer til at fremkalde matriptase aktivering. Efter neutralisering, kombinationen af ​​cellen og skuret fraktion (kombinere), cellen fraktion alene (celle), og skuret fraktionen alene (stald) blev analyseret for tryptisk aktivitet.

C

D

.