PLoS ONE: MicroRNA Expression Profil i penis Cancer afsløret af næste generations Lille RNA Sequencing

Abstrakt

Penis kræft (PECA) er en relativt sjælden tumor enhed, men besidder højere sygelighed og dødelighed, især i udviklingslandene. Til dato, de konkrete patogene signalveje og centrale machineries involveret i tumorigenese og progression af PECA mangler at blive belyst. Flere undersøgelser foreslog miRNA, der modulerer genekspression på posttranskriptionel niveau, var ofte mis-reguleret og afvigende udtrykt i humane kræftformer. Imidlertid har miRNA profil i human PECA ikke blevet beskrevet før. I nærværende undersøgelse blev miRNA-profil opnået fra 10 friske penis kræft væv og matches tilstødende ikke-kræft væv via næste generations sekventering. Som følge heraf blev der i alt 751 og 806 kommenterede miRNA identificeret i normale og cancerøse penis væv hhv. Blandt som blev 56 miRNA med markant forskellige udtryk niveauer mellem parrede væv identificeret. Efterfølgende blev adskillige annoterede miRNA udvalgt tilfældigt og valideret med kvantitativ real-time PCR. Sammenlignet med de tidligere publikationer om den ændrede miRNA ekspression i forskellige cancere og især urogenitale (prostata, blære, nyre, testikel) cancere, den mest flertal af deregulerede miRNA viste lignende ekspressionsmønster i penis cancer. Desuden analyserer de bioinformatik foreslået, at de formodede målgener af differentielt udtrykte miRNA mellem kræft og matchede normale penis væv stramt var forbundet med celle vejkryds, proliferation, vækst samt genomisk ustabilitet og så videre, ved at modulere Wnt, MAPK, p53, PI3K -Akt, hak og TGF-β signalveje, som blev alle veletablerede at deltage i kræft initiering og progression. Vores arbejde giver et samlet overblik over det differentielt udtrykte miRNA og potentielt regulerende net af deres målgener til afklaring af patogene transformation af normal penis til PECA, hvor forskning ressource giver også nye indsigter i fremtidige undersøgelser havde til formål at udforske de dybtgående mekanismer miRNA og andre små RNA herunder piRNAs i penis carcinogenese regulering og effektiv målspecifik theragnosis

Henvisning:. Zhang L, Wei P, Shen X, Zhang Y, Xu B, Zhou J, et al. (2015) MicroRNA Expression Profil i peniscancer afsløret af næste generations Lille RNA Sequencing. PLoS ONE 10 (7): e0131336. doi: 10,1371 /journal.pone.0131336

Redaktør: Yu Xue, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi, KINA

Modtaget: 10. februar, 2015; Accepteret: 1 jun 2015; Udgivet: 9 juli 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle rå sekventering filer er tilgængelige fra ArrayExpress databasen (tiltrædelse nummer: E-mtab-3087)

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (No.81401518, nr 31.430.028, http: //www.nsfc.gov.cn/) (LZ); National Natural Science Foundation of China (nr 81.170.698, No. 81.370.856, https://www.nsfc.gov.cn/) (CZL); National Natural Science Foundation of China (nr 31.370.983, https://www.nsfc.gov.cn/) (DHZ); Anhui Provincial Natural Science Foundation (No.1408085QH180, https://www.ahkjt.gov.cn/) (LZ), Klinisk Emneord Program for Ministeriet for Folkesundhed Kina (Urology, http: //www.nhfpc .gov.cn /) (CZL), dyrkning projekt for NSFC på Anhui Medical University (nr 2013KJ14, https://www.ayfy.com) (LZ) og Key Project af det kinesiske undervisningsministerium (nr 212.080, https://www.moe.edu.cn/) (DHZ). De finansieringskilder havde ingen roller i undersøgelsesdesign, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Molekylær forskning har vist sig som et lovende redskab til dybdegående forståelse i carcinogenese, med dens cellulære komponenter, signalveje og farmaceutiske mål i kræftmedicin. Desværre har bemærkelsesværdige fremskridt ikke omfattede alle kræftformer. Penis cancer (PECA) er sådan en relativt sjælden tumor enhed inden de udviklede lande i verden, blev kun omkring 1640 penis kræfttilfælde nydiagnosticerede og 320 kræftrelaterede dødsfald blev anslået i 2014 i USA nationalt [1]. Betragtninger, sygelighed og dødelighed af PEOG i de fleste udviklingslande var betydeligt højere, tegner sig for en 3-10 gange stigning på satserne for de udviklede lande i de seneste årtier [2]. Penis kræft er forbundet med flere etablerede risikofaktorer som humant papillomvirus (HPV) infektion, dårlig hygiejne, forhudsforsnævring med kronisk inflammation, rygning og nogle epigenetiske vekslen herunder histon methylering modifikationer [3,4]. Desuden har nogle gener under carcinogenese, proliferation, invasion og metastase af PECA blevet identificeret. For eksempel, p53, cyclin-afhængig kinase inhibitor 2A (CDKN2A) og matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) blev påvist at spille afgørende roller i PECA kræftfremkaldende ruter og epithelial-mesenchymal overgang (EMT), henholdsvis [5]. Ikke desto mindre, som nævnt ovenfor, yderligere omfattende forskning for yderligere at belyse de nøjagtige mekanismer i molekylære ændringer ligger til grund for initiering, udvikling og progression af PECA er bydende nødvendigt for os at udforske nye og værdifulde forebyggende, tidlig påvisning, målrettede behandlinger og prognose forudsigelse tilgange til denne urogenitale uorden.

Modne microRNA (miRNA) er en gruppe af endogent udtrykt, evolutionært konserveret, enkeltstrengede og ikke-kodende små RNA’er (smRNAs, ca. 19-23 nukleotider i længden), der fungerer som posttranskriptionel regulatorer af gen ekspression i en lang række organismer [6]. Til dato har mere end 1000 menneskelige miRNA blevet identificeret, og der er opnået enorme observationer i at forbinde de alternative og afvigende ekspressionsniveauer af miRNA med initiering og progression af humane sygdomme, især for forskellige former for kræft typer [7-9], som ikke mindre end halvdelen miRNA gener er placeret i cancer-associerede regioner eller skrøbelige steder i hele genomet [10]. miRNA deregulering i tumor biologi blev først observeret i miRNA-15a og miRNA-16-1 inden locus 13q14, begge de to miRNA som målrettede B-celle lymfom 2 (Bcl-2) mRNA blev slettet eller nedreguleret i de fleste størstedelen af ​​kroniske lymfatisk leukæmi (CLL) tilfælde, hvilket resulterer i tumorigenese ved at reducere apoptotiske aktiviteter [11]. I øjeblikket er det blevet almindeligt accepteret, at særskilte cancertyper, stadier, regression kvaliteter eller differentiering stater kan besidde individuelle miRNA udtryk profiler, som holder meget lovende i at handle som pålidelige molekylære biomarkører for kræft diagnose og kan også afsløre nye patogene signalveje korreleret med carcinogenese og progression for målrettede molekylære lægemidler [12]. Lige siden, har en række forskellige teknikker blevet indført for at gennemføre miRNA profilering. For eksempel, kvantitativ revers-transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR) assays, Northern blotting analyser og mikroarrays nogensinde er blevet udbredt anvendt til miRNA undersøgelser [13]. For nylig har en nyudviklet teknologi opkaldt næste generation sekventering (NGS) vakte stor opmærksomhed i små RNA (smRNA) profilering på grund af sine unikke fordele i test specificitet, sensitivitet og roman smRNAs identifikation [14-16]. Gennem hvilke, kan vi opdage næsten alle smRNAs såsom kendte og nye miRNA selv med ekstremt lav overflod, små cytoplasmatiske RNA (scRNAs), nukleare RNA (snRNAs), nucleolar RNA (snoRNAs) og piwi-interagerende RNA (piRNAs) [17] .

i den foreliggende undersøgelse, vi sigter mod at udfylde hullet i oplysninger om miRNA profil i menneskelig penis cancer og evalueret en mulig sammenhæng mellem differentierede miRNA udtryk niveauer med tumorigenese og progression. Ved at anvende næste generations sekventering (NGS) teknologi, udførte vi smRNA-seq for ti parrede frisk-frosne enheder af penis pladecellecarcinom og matches histologisk normalt penis væv, som var tilstødende til kræft. Vi har behandlet de generelle oplysninger af miRNA udtryk profiler i begge de parrede penis væv og især fundet, at en række af miRNA afvigende blev udtrykt i peniskræft sammenlignet med matchede normale væv. Især genet ontologi (GO) analyse af potentielle miRNA målgener indikerede, at deregulerede miRNA i berigede biologiske processer, molekylære funktioner og cellulære komponenter blev involveret i cellevækst, celleform, axonogenesis, proteinaktivitet regulering og angiogenese, som tilsammen deltog i transformation af normale celler til maligne læsioner. Desuden er kyoto encyklopædi af gener og genomer (Kegg) pathway analyse held beriget flere stramt cancer-associerede veje, der alle var veldokumenterede til at deltage i kræft initiering, udvikling, invasion, metastase og også lovende terapi. Vores resultater giver en værdifuld forskning ressource til yderligere at belyse de lovgivningsmæssige roller miRNA i penis tumorigenese og progression, som også lover godt ved at lette udviklingen af ​​nye diagnostiske biomarkører og effektive terapeutiske strategier for PEOG.

Materialer og metoder

Etik erklæring

informeret samtykke blev underskrevet af alle de tretten patienterne selv med penis planocellulært karcinom, som havde fået delvis penectomy og undersøgelsen blev evalueret grundigt og derefter godkendt i nøje overensstemmelse med reglerne ved etiske komiteer om menneskelige forskningspotentiale af First Affiliated Hospital i Anhui Medical University (Godkendelse nr PJ20140906).

Klinisk prøver samling

penis kræft og matchede ikke-maligne prøver blev indsamlet fra i alt 13 patienter, som gennemgik en delvis penectomy 2013-2015 ved Institut for Urology, First Affiliated Hospital i Anhui Medical University. Umiddelbart efter operationen, kræft og matchede normale penis væv blev separat lagret i RNAlater opløsning (Ambion, USA) og nedfrosset ved -80 ° C i overensstemmelse med en standard operation procedure (SOP) styret af uropathologist. Kort fortalt blev tumorvæv indeholder mere end 80% tumorform læsioner inkluderet for yderligere analyser. Tilsvarende blev de matchede normale tilstødende væv opnået fra hvor mindst 1,0 cm ud over de synlige tumorform væv i penis. Hver kræft og ikke-maligne væv blev diagnosticeret histopatologisk ved Hæmatoxylin-eosin (HE) -staining.

SmRNA bibliotek konstruktion og dyb sekventering

Total RNA blev indsamlet fra ti par frisk frosset penis cancere og matchede histologisk normale penis væv ved hjælp TRlzol-reagens (Life Technologies, USA). Kvalificeret RNA med A260 /A280-forhold på over 1,8 blev efterfølgende vurderet for RNA integritet ved at udføre DNA-chip-analyse. To smRNA biblioteker blev konstrueret fra poolede og integrerede RNA af ti personer for hver gruppe (kræft og matchede normale penis væv) ved hjælp af en smRNA prøve prep kit (Illumina, USA) efter standard protokoller, med specifikke ændringer [15]. Kort fortalt, de passende fraktioner varierede fra 18 nt til 28 nt blev adskilt, oprenset via 15% (vægt /volumen) denaturerende polyacrylamidgelelektroforese og derefter bundet til RNA adaptere (5′-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC og 3′-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG) efterfulgt af RT-PCR amplifikation. Dernæst blev PCR-produkterne yderligere oprenset på agarosegeler at etablere bibliotekerne. Endelig blev de to biblioteker, som konstrueret ud fra ti cancerøse penis væv (poolede og homogeniseret til et bibliotek) og ti matchede tilstødende normal penis væv (poolede og homogeniseret til et andet bibliotek) sekventeret ved at anvende Illumina Hiseq 2000 (Illumina, USA) ved Beijing Genomics Institute (Shenzhen, Kina) strengt efter de standard protokoller [18].

NGS dataanalyser og nye miRNA identifikation

de sekventering data smRNA blev yderligere analyseret med henvisning til de metoder, der er beskrevet i de tidligere udgivelser [15-18]. Konkret efter sletning 5’adapter og trimning 3 ‘acceptor-sekvenser, fjernelse forurenet og lav kvalitet læser (Q 10, blev kvaliteten beregnes af Q = ASCII code-64), såsom læser uden indsats fragment eller indeholder poly ( A) strækker blev de kvalificerede unikke tags kortlagt til GRCh37.p5 ved indføring SOAP2.0 ultrahurtig værktøj (https://soap.genomics.org.cn) [19]. Tags med ikke mere end én mismatch blev plukket ud til efterfølgende analyse. De konserverede kendte miRNA blev identificeret ved at tilpasse de kortlagte tags til miRBase værktøj (version 18.0) i

Homo sapiens

[20], og tags ikke modsvares i miRBase blev yderligere justeret mod sekvenserne af andre ikke-kodende RNA (rRNA’er, tRNA’er, snRNAs, snoRNAs) præsenteret på Rfam database (https://www.sanger.ac.uk/resources/databases/rfam.html) [21], gentager database samt Pirna database [22]. I betragtning af et par smRNA tags kan kort til mere end én kategori, vi fulgte de prioriterede reglerne beskrevet i forrige publikation at garantere, at hver unikke smRNA blev kortlagt til unikke anmærkning som følger: miRNA, Rfam, gentagelser, Pirna og mRNA (122,228 .158.106 /mr2_dev) [23].

efter at have identificeret de kendte miRNA, de resterende sekvenser fra alle kræft og matchede normale penis prøver ikke kommenteret af de ovennævnte databaser blev plukket ud af de to biblioteker skal justeres med den integrerede menneskelige transkriptom til at forudsige nye miRNA. Alle hårnål-lignende strukturer, der indeholder uklassificerede smRNA tags består af ikke mindre end 45 læsninger blev forudsagt ved hjælp af klassisk pre-microRNA forudsigelse værktøj Mireap (https://sourceforge.net/projects/mireap/) [24] i nøje overensstemmelse med følgende regler: 1) Længde af miRNA-sekvenser spænder 18-26 nt; 2) Gratis energi af en miRNA forløber er mindre end -18 kcal /mol; 3) Bulge tilladt for miRNA og den parrede forløber miRNA * er mindre end 4; 4) Plads mellem miRNA og den parrede forløber miRNA * er ikke mere end 35 nt. I mellemtiden, RNA Fold (https://rna.tbi.univie.ac.at/RNA/RNAfold.html) [25], et program beregner den mindste frie energi (MFE) og backtraces en optimal sekundær struktur, blev udlånt til at forudsige alle de essentielle sekundære strukturer af potentielle miRNA forstadier. Alle de rådata, næste generation sekventering er blevet deponeret i den udpegede database ArrayExpress (Tiltrædelse nummer: E-mtab-3087).

Bioinformatik analyser for differentielt udtrykte miRNA

tilgange beskrevet i vores tidligere publikation for bioinformatik analyser blev indført for at udføre målgener forudsigelse i den foreliggende undersøgelse [17-18]. Kort fortalt blev de målrettede gener af differentielt udtrykte miRNA fra kræft og matchede normale penis væv forudsiges ved hjælp Microcosm Mål, tidligere kaldet miRBase mål (https://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/) [26-27 ], TargetSpy (https://targetspy.org/) [28] og Miranda (https://www.microrna.org) [29]. De konkrete forudsigelser blev nøje overensstemmelse med de regler, der er beskrevet som følger: 1) Enhver uoverensstemmelse bør ikke findes på frø regionen; 2) Den frie energi af miRNA /mål-duplex bør være mindre end -20 Kcal /mol; 3) Den samlede score for en miRNA-mRNA par bør overstige 140 [17-18].

Efterfølgende beriget GO vilkår (https://www.geneontology.org) [30] og Kegg veje ( https://www.genome.jp/kegg/) [31] analyser blev udført for de forudsagte målgener af differentielt udtrykte miRNA fra normale og kræft penis prøver. Helt konkret efter kortlægning af de potentielle målgener til datasættet af GO anmærkninger og Kegg veje, sortering ud beriget biologiske processer og signalveje gennem Hypergeometrisk og Fishers test, de berigelse nøgletal og p-værdier for GO og Kegg blev beregnet via indføre identiske formel nævnt i vores tidligere rapport [17], så den False Discovery Rate (FDR) justering blev udført for at bedømme betydningen af ​​forskelle i multiple test [32]. Til sidst blev de centrale GO vilkår og veje kun identificeret under det forhold, at berigelse ratio≥2.0 og FDR p-værdi 0,05 samtidigt

QRT-PCR verifikation for ændret miRNA udtryk

Modne miRNA. kvantificering blev udført ved rutinemæssig kvantitativ real-time PCR under anvendelse af en Applied Biosystems StepOne real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) og en SYBR premix Ex-Taq II kit (Takara, Japan) med optimerede reaktionsbetingelser og under anvendelse af de specifikke primere, der er anført i S1 tabel. Kort beskrevet blev totalt RNA ekstraheret fra 13 parrede cancerøse og matchede normale penis væv. Blandt hvilke, blev det ekstraherede RNA fra de identiske ti patienter, påførte på NGS samlet og valideret, mens hver totalt RNA fra yderligere tre patienter separat blev anvendt til yderligere analyser. Efter cDNA syntese blev tredobbelte reaktioner udført ved 95 ° C /10 min, blev de efterfølgende 40 amplificerede cyklusser udført ved 95 ° C /15 s og 60 ° C /60 s. I mellemtiden var U6 snRNA udlånt som en intern kontrol for at normalisere miRNA udtryk. Til analyse af data, blev tærsklen cyklus (Ct) defineret som brøkdele cyklusser, når fluorescens bestået en fast tærskelværdi og yderligere anvendes til at beregne relative miRNA mængderne (△△ Ct = Ct

miRNA-Ctsn

RNAU6). Relative ekspression fold ændringer blev beregnet under anvendelse af 2

– △△ Ct formel [16]. MiRNA koncentrationsforskelle mellem kræft og normale penis væv blev analyseret under anvendelse uparrede t-tests [18]. Når en p-værdi viste sig at være mindre end 0,05, ville det blive betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Oversigt over hele genomet smRNA-sekventering af data fra de parrede penis prøver

Alle smRNAs af 18-32 nukleotider fra de parrede frisk frosne eksemplarer af penis pladecellekræft (herefter benævnt “ondartede væv”) og matches histologisk normale penis væv støder op til cancer (i det følgende benævnt “normale væv” ), der er blevet diagnosticeret histopatologisk af HE-farvning (figur 1), var dybt sekventeret for at få et samlet overblik over smRNAs profil.

HE farvning illustreret de repræsentative tilstødende normale penis væv (til venstre) og kræft penis prøver (til højre) fra tre patienter.

for hver prøve 13.796.889 (ud af 15.702.009 læser) og 14.051.355 sekvens læser (ud af 15.698.197 læser) tilpasset det menneskelige genom sekvens datasæt var opnået, som repræsenterer 704.514 (ud af 966.914) og 787.447 (ud af 1,090,353) unikke tags henholdsvis (S2 tabel). Blandt hvilke, 6.898 unikke tags svarende til 4.795.955 læser og 7.173 unikke tags svarende til 3.815.482 læser blev matchet til kendte miRNA til normale og ondartede væv, hhv. I mellemtiden, 5877 svarende til 172.216 læser og 6272, svarende til 119.724 læser blev matchet til kendte piRNAs for normale og ondartede væv, hhv. Resten af ​​sekvenserne blev matchet til andre typer af RNA’er, herunder mRNA’er, rRNA’er, sRNA’er, snRNAs, snoRNAs, tRNA’er, gentagelser osv (fig 2 og S2 Table). Blandt hvilke, gentagelserne bestod hovedsagelig af rRNA enten baseret på total læser eller unikke tags (S3 tabel).

De unikke tags og alt læser tilpasset det menneskelige genom sekvens datasæt blev opnået. Den kortlagt unikke tags og ren læser blev kommenteret og klassificeret som miRNA, Pirna, rRNA, Srna, snRNA, snoRNA, tRNA, gentager mv baseret på sammenligning med analytiske databaser, delvise tags og læser ikke blev kommenteret.

De fleste af disse rene læser var 22 nt i størrelse, konsekvent efterfulgt af 23-nt og 21 nt RNA-fragmenter (S1 Fig). Desuden at forstå fordelingsmønster af alle de unikke tags på kromosomer, blev den detaljerede placering af hvert mærke på kromosom evalueret. Som et resultat heraf kromosom fordelinger mellem ondartede og normale væv var generelt de samme. Konkret i de ondartede penis væv, kromosom 1 harbored fleste af de unikke tags, efterfulgt af kromosom 2, 11, 12 og 17, tilsvarende de fleste af de unikke tags placeret på kromosom 1, 2, 17, 12, 11 i det tilstødende normale penis væv (S2 fig).

Karakteristik af top rigelige kendte og nye miRNA

for at analysere de mest udbredte miRNA i penis væv, vi listet de 20 højt udtrykte miRNA med relativt mere læser tæller i faldende orden ud af de 751 og 806 kendte miRNA i normale og cancer penis væv, henholdsvis som udtryk profil blev angivet af både absolutte læser tæller og læser tælle ud af per million læser tæller. I normale penis væv, lad-7a-5p, lad-7f-5p, lad-7b-5p, lad-7c-5p, miR-140-3p, lad-7 g-5p, lad-7e-5p, miR-103a -3p, miR-320a, miR-143-3p var de øverste rigelige miRNA. Tilsvarende blev de højt udtrykte miRNA i kræft penis væv Lad-7f-5p, lad-7a-5p, lad-7b-5p, lad-7c-5p, miR-140-3p, miR-199B-3p, lad-7g -5p, miR-199a-3p, lad-7e-5p og miR-143-3p besad de øverste rigelige ekspressionsniveauerne. Hvorfra, fandt vi, at de højest udtrykte miRNA i normale og cancer penis væv var omtrent den samme (tabel 1), der angiver identisk histologiske oprindelse parrede prøver gennemgår dybe sekventering.

For at identificere potentielle nye miRNA i penis væv blev de uklassificerede tags videreforarbejdes hjælp Mireap værktøj. Kun de tags med læser tælle mere end 50 og strengt matcher standardparametre blev klassificeret som kandidater af nye modne miRNA. På grundlag af denne analyse, hver 10 miRNA forstadier (hvis potentielle hårnåle-strukturer blev vist i S3 Fig) koder den mest rigelige forudsagte roman modne miRNA kandidater med længder varierede den 22.-24 nt blev identificeres særskilt i de to smRNA biblioteker fra penis væv. Især blev 7 rigeligt udtrykte nye miRNA overlappede mellem kræft og matchede tilstødende normale penis væv (tabel 2), der er angivet den identisk histologiske oprindelse og kromosomal placering af miRNA i begge væv igen. Imens disse nye miRNA stammede fra samme forstadier har også vist heterogenitet og præferencer, ved at generere relativt mere modne produkter fra 3 ‘ender i forhold til 5’ ender og blandt de 10 nye modne miRNA i enten penis væv, 9 miRNA indledt med adenin eller uridin (tabel 2), hvilke mønstre var i overensstemmelse med den tidligere rapport [17].

differentielt udtrykte profiler af miRNA i peniskræft

Når man sammenligner de forskellige niveauer af miRNA overflod mellem normale og cancerøse væv, to mængder er hyppige af stor betydning: den ene er p-værdi, der svarer til t-test svar på spørgsmålet om, hvorvidt der kan opnås den statistisk signifikante forskel i ekspressionsniveauer mellem de parrede grupper. Den anden er den fold-ændring (FC) værdi, som kunne illustrere, hvad er størrelsen af ​​miRNA overflod forskellen mellem de parrede prøver. Især kan selv meget store FC værdier har ubetydelige p-værdier ifølge t-testen forårsaget af betydelige variabiliteter. Tilsvarende kan relativt lille størrelse af forskellen også betyde en lille p-værdi på grund af de meget konsekvente tekniske replikater inden for hver prøver. Således er en egnet visualisering metode kaldet “vulkan plot”, som samtidig kan udvise fold-change og p-værdier på X-aksen og Y-aksen separat, er indsat for at udføre vores analyse. Generelt point placeret i øverste venstre eller øverste højre regioner af plottet og angivet med den grønne farve skal trække mere opmærksomhed, som de havde begge små p-værdier (p 0,05) og høj FC værdier (FC≥2) . I denne sammenlignende undersøgelse, blev det overblik over vulkanen plot genereret af miRNA profiler i penis kræft og matchede normale væv vist (S4 Fig). Som et resultat, differential betydeligt ekspressionsniveauerne af 98 miRNA blev fundet mellem Peca og tilstødende normale penis prøver efter justering for multiple test. Ved at anvende yderligere filtrering med en stringent cut-off på 50 læser tæller i begge prøver, identificerede vi 56 miRNA bestod af 30 (53,6%) miRNA, der blev nedreguleret (tabel 3) og 26 (46,4%), som blev opreguleres (tabel 4) hos patienterne og kunne skelne penis karcinom fra matchede normale væv.

Blandt hvilke, de mest rigeligt nedreguleret miRNA i kræft penis væv var miR-320a, miR-205-5p, miR- 145-5p, miR-423-5p og miR-23b-3p. Af de opreguleres miRNA, MIR-107, miR-223-3p, miR-340-5p, miR-424-5p og MIR-944 var top 5 mest rigeligt udtrykte miRNA i penis kræft væv, blandt hvilke, miR-107 havde et udtryk niveau i PECA overstiger 30.000 læser tæller. I mellemtiden, miR-107 var også den mest markant opreguleres miRNA som loggen

2 (Cancer /Normal Ratio) var 3,83708. Tilsvarende miR-508-3p var den mest markant nedreguleret miRNA som udtryk for miR-508-3p blev endda ikke påvist i PEOG.

Altered miRNA udtryk i kræft penis væv valideret af QRT-PCR

for at validere den ændrede miRNA udtryk i PECA profileret af smRNA-seq, blev QRT-PCR udført på penis kræft væv og matches histologisk normale væv. For det første, for at udelukke eventuelle individuelle forskelle mellem prøverne udsat for sekventering, den 10 parrede penis prøver fra patienterne blev også blandet som en pulje til den valideret assay. Efterfølgende tog vi tilfældigt 5 opreguleres og 5 nedreguleret miRNA blandt de differentielt udtrykte miRNA at gennemføre QRT-PCR-analyse, og ekspressionsniveauerne blev præsenteret ved hjælp af den normaliserede fold ændring af kræft væv versus normale væv. Resultaterne viste, at ekspressionsniveauerne og ændret ekspression tendens af de 10 deregulerede miRNA var helt i overensstemmelse med resultaterne opnået fra NGS teknologi. Fra begge teknikker, MIR-509-3p viste den største fold-change af nedreguleret ekspressionsniveauer i cancerøse penis væv, og MIR-107 havde den største fold-change af opreguleres ekspressionsniveauer i cancerøse penis væv, som tilsammen indikerede, at ekspressionsniveauerne af miRNA detekteret af smRNA-seq sekventering var pålidelige (S5 fig). Desuden at validere ændrede miRNA udtryk mønster afsløret af NGS data i de enkelte patienter, vi plukket 4 deregulerede miRNA at gennemføre den QRT-PCR-analyse, og ekspressionsniveauerne blev præsenteret ved hjælp af den normaliserede fold ændring af kræft væv versus normale væv i hver patient , henholdsvis. I overensstemmelse med resultatet, fandt vi, at selv om populationsbaserede effekter og iboende forskelle uundgåeligt opstået som den tidligere rapport [33], tendensen af ​​ekspressionsmønstre var i overensstemmelse med NGS undersøgelsesresultater miR-107 og miR-223-3p viste opreguleres ekspressionsniveauerne i kræft penis væv, mens miR-1247-5p og miR-509-3p viste nedreguleret ekspressionsniveauerne i kræft penis væv, som igen bekræftede de smRNA-Seq sekventering data (S6 Fig).

GO berigelse analyse af gener udtrykkes forskelligt i kræft og normale penis væv

de væsentlige biologiske funktioner i de formodede målgener blev klassificeret via Gene ontologi systemet. Da enkelte gener var relateret til forskellige GO vilkår, blev gen-sæt, som viste de tilsvarende deregulerede udtryk mønstre i flere kræftformer menes at være funktionelt afgørende for tumorigene processer [30]. For bedre at forstå de biologiske adfærd af deregulerede kendte miRNA, potentielle target gener og biologiske funktioner er omfattet af disse miRNA blev forudsagt ved hjælp af mikrokosmos TargetSpy og MIRANDA software [26-29] (S1-fil). Efter justering af antallet af samlede gener tæller kommenteret af en specifik GO term≥10, beriget ratio≥2.0 og FDR p-værdi 0,05 for at opnå den mest overbevisende resultat for berigelse analyse, de 10 mest berigede GO vilkår, herunder biologiske processer, cellulære komponenter og molekylære funktioner blev præsenteret i tabel 5. Blandt hvilke, de formodede målgener af deregulerede miRNA mellem kræft og normale penis prøver syntes at være meste forbundet med de berigede cellulære komponenter bestod af cytoskelet såsom adherens krydset (som junction ankre transmembrane proteiner og letter celle cytoskelet vedhæftede), stress fiber (som består af korte actinfilamenter), celle-celle krydset (som kommunikerer krydset almindeligvis forbinder tilstødende celler). I mellemtiden er den mest berigede molekylære funktion blandt de 10 GO vilkår var beta-catenin binding (der fungerer som den interaktive adfærd med beta-catenin i en selektiv og ikke-kovalente måde). Desuden blev disse formodede målgener tæt relateret til en bred vifte af biologiske processer, herunder vækstregulering (som i vid udstrækning modulerer organismens udvikling), celle form regulering (der fungerer som den øverstbefalende celleoverfladen konfiguration), axonogenesis (hvilken proces generelt modulerer Axon s morfogenese og form bestemmelse), cyclin-afhængig proteinkinaseaktivitet regulering (som procedure regulerer serin /threonin-kinase aktivitet omfattende), peptidyl-serin-phosphorylering (hvilken fremgangsmåde medierer omdannelsen af ​​peptidyl-serin peptidyl-O-phospho-L-serin) og positiv angiogenese regulering (som procedure letter dannelsen af ​​blodkar).

Kegg pathway analyse af gener udtrykkes forskelligt i kræft og normale penis væv

Efter GO analyse, den formodede mål gener af disse miRNA differentielt udtrykte i kræft og normale penis prøver blev introduceret til Kegg at gennemføre en sti berigelse analyse, som i sidste ende viste 22 målgener, der blev kommenteret for differentielt udtrykte miRNA og 5 Kegg veje blev beriget. Baseret på den statistisk signifikante definition med FDR p-værdier 0,05, blev fundet den kommenterede mest berigede veje til at være tæt forbundet til “dorso-ventrale akse dannelse (GRK-EGFR)” (som modulerer de vigtigste effektorer i akse dannelse som Rho